土沉香對黃野螟抗性機(jī)理的初步研究

朱誠棋，張蒙，馬濤，孫朝暉，李奕震，溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

土沉香對黃野螟抗性機(jī)理的初步研究

朱誠棋，張蒙，馬濤，孫朝暉，李奕震，溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

采用紫外分光光度計(jì)，分析測定林間篩選的對黃野螟HeortiavitessoidesMoore具有不同抗性表現(xiàn)的土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg植株(感蟲植株、抗1植株、抗2植株)葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及單寧的含量。結(jié)果表明，3種不同抗性的土沉香葉片中可溶性糖含量從大到小依次為：感蟲葉片，抗1葉片，抗2葉片；可溶性蛋白含量從大到小依次為:感蟲葉片，抗2葉片，抗1葉片；葉片單寧含量從大到小依次為：抗2葉片，抗1葉片，感蟲葉片?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍缀康淖兓c其抗蟲性呈負(fù)相關(guān)，單寧含量與抗蟲性呈正相關(guān)。

黃野螟；土沉香；抗蟲機(jī)理；抗性品種

土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬Aquilaria植物，又名白木香、女兒香、崖香和蜜香等。土沉香在國外主要分布于印度、馬來西亞[1]以及亞洲東南部，國內(nèi)分布于海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等低緯度地區(qū)[2]。土沉香不僅是傳統(tǒng)名貴的天然香料[3]，而且是唯一能夠生產(chǎn)中藥沉香的藥用植物[4]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，中藥沉香味辛、苦，性微溫，具有溫和止嘔，行氣止痛，納氣平喘的功效，可用于治療胸腹、脹悶疼痛，腎虛氣逆喘急等疾病[5]。

黃野螟HeortiavitessoidesMoore是土沉香的主要食葉害蟲，這種害蟲具有突發(fā)性、食葉量大、危害期長等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅土沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6-7]，目前對黃野螟的生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性、化學(xué)防治和性信息素的開發(fā)應(yīng)用等方面的研究報(bào)道較多[8]，但尚無抗蟲土沉香品種選育的報(bào)道及土沉香抗蟲機(jī)制方面的研究。探討土沉香抗蟲機(jī)制，有助于揭示黃野螟種群暴發(fā)的原因，為新型害蟲行為調(diào)控劑的開發(fā)研究提供依據(jù)。

林間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土沉香種群中普遍存在3種不同抗性的植株，在外部形態(tài)和抗蟲能力上有顯著差異。抗1植株葉片細(xì)小，略發(fā)黃；抗2植株葉片厚綠，革質(zhì)化程度高；感蟲土沉香葉片細(xì)長嫩綠。作者以3種對黃野螟有抗性的土沉香品種為材料，研究土沉香葉片中可溶性糖、蛋白質(zhì)以及單寧的含量及其與黃野螟抗性的關(guān)系，為深入研究土沉香對黃野螟的抗性機(jī)制，尋求黃野螟種群監(jiān)控和無公害防治的有效措施。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況 試驗(yàn)地位于廣州市土沉香種植基地(N23°13′,E113°10′)，海洋性亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫22 ℃，年平均相對濕度77 %，年降雨量1 720 mm。地貌類型屬低、中丘陵，海拔162 m，土壤為花崗巖風(fēng)化形成的微酸性沙壤土?，F(xiàn)有土沉香1萬株，間距2 m×2 m，樹齡5～8 a，樹高2～4 m。

1.2 藥劑與儀器 供試藥劑為蒽酮試劑，葡萄糖，考馬斯亮藍(lán) G-250 進(jìn)口分裝，牛血清蛋白電泳純，無水乙醇，磷酸，鎢酸鈉，磷鉬酸，以及無水碳酸鈉。

供試儀器為電子天平，電熱恒溫水浴鍋，攪拌器，超聲波清洗器，萬分之一電子分析天平(GA110型，德國產(chǎn))以及紫外分光光度計(jì)(UV-2201型，日本島津公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)葉片采集 土沉香葉采集于2014年10月黃野螟危害盛期。調(diào)查發(fā)現(xiàn)基地中有3種不同抗性的土沉香植株：抗蟲1、抗蟲2、感蟲?？瓜x1是具有明顯抗蟲性的植株，位于葉片幾乎全被吃光的土沉香林內(nèi)，周圍約30 m范圍內(nèi)上百株土沉香葉片全部被食光，該株葉片完好，盡管在其葉片上發(fā)現(xiàn)十多塊卵塊，但葉片幾乎沒有被危害?？瓜x2位于遭受嚴(yán)重危害的土沉香林緣，其周圍土沉香葉片被害率均在80%以上，但該植株葉色墨綠，既沒有發(fā)現(xiàn)黃野螟卵塊也沒有發(fā)現(xiàn)幼蟲危害癥狀，葉片完好率在95%以上。

采樣時(shí)，分別在3種土沉香樹冠的東、西、南、北、中5個(gè)方位的當(dāng)年生枝條上采取一定數(shù)量的健康葉片(圖1)，組成混合樣。將采集來的葉片用清水沖洗干凈并晾干。

A：抗蟲葉片1；B：抗蟲葉片2；C：感蟲葉片圖1 三種不同的土沉香葉片

1.3.2 葉片含糖量測定

1.3.2.1 葉片可溶性糖提取 分別稱取3種土沉香新鮮葉片1.5 g，置于研缽中，加入少量蒸餾水，仔細(xì)研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入50 mL試管中，放入沸水浴中煮沸30 min，取出冷卻，5000 r/min離心10 min，收集上清液于另一50 mL試管中，殘?jiān)? mL蒸餾水重復(fù)洗2次，合并上清液。在上清液中加0.5 g活性炭，80 ℃水浴脫色30 min，過濾后稱重，取5 mL濾液定容50 mL待測，每種葉片設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(0.1 mg/mL)0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL于具塞試管中，并用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，將試管放入冷水浴中，分別加入蒽酮試劑4 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱15 min，冷水中冷卻至室溫。20 min后，以空白作對照，用1 cm比色皿，在分光光度計(jì)上，620 nm波長處測定吸收度。以吸收度A標(biāo)為縱坐標(biāo)，濃度C標(biāo)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 樣品含量測定 吸取 0.1 mL樣液于試管，蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，將試管置于冰水浴中，加入4 mL蒽酮試劑并搖勻，在沸水浴中煮沸15 min，取出冷卻，在分光光度計(jì)620 nm波長處比色，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以葡萄糖溶液(0.1 mg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各樣品的可溶性糖的含量。所測樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)，取其平均值報(bào)告。相對誤差 ≤ 5 %。樣品中可溶性糖含量計(jì)算公式為：

S(mg/g)=(C樣×V×103)/(106×M)×100 %

式中：S為可溶性糖含量，C樣為提取液的含糖量(μg/mL)，代入吸光值A(chǔ)樣由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得；V是供試液的定容量(mL)，M是樣品鮮重(g)。

1.3.3 葉片蛋白質(zhì)含量測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，考馬斯亮藍(lán)染料在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成藍(lán)色，最大光吸收在 595 nm，且藍(lán)色的深淺與溶液中的蛋白質(zhì)含量成正比。

1.3.3.1 葉片蛋白質(zhì)提取 稱取3種具有不同抗蟲性的土沉香新鮮葉片各 0.5 g放入研缽中，加入5 mL蒸餾水，研磨成勻漿，移到離心管4000 r/min離心20 min，過濾上清液并定容到5 mL。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/mL)0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于具塞試管中，并用蒸餾水補(bǔ)充至1.0 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，搖勻，25 ℃水浴放置5 min后，以空白作對照，用1 cm比色皿，在分光光度計(jì)595 nm下比色測定吸光度。以吸收度A標(biāo)為縱坐標(biāo)，濃度C標(biāo)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.3 樣品含量測定 取3種具有不同抗蟲性的土沉香樣品0.1 mL上清液，向各管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán) G-250溶液搖勻，25 ℃水浴放置5 min后，在分光光度計(jì)595 nm下比色測定吸光度。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以牛血清蛋白溶液(100 μg/mL)為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各樣品可溶性蛋白的含量。所測樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)。樣品中蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式為：

P(mg/g)= (C標(biāo)×V1)/(1000×Vt×FW)

式中：P為樣品中蛋白質(zhì)含量，C標(biāo)為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg)，Vt是提取液總體積(mL)，F(xiàn)W是樣品鮮重(g)，Vt是測定時(shí)加樣量(mL)。

1.3.4 葉片單寧含量測定 葉片中的單寧在堿性溶液中會(huì)將磷鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色化合物，其顏色深淺與單寧含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)溶液作對比可以測得葉片中的單寧含量。

1.3.4.1 葉片單寧提取 將3種具有不同抗蟲性的土沉香新鮮葉片去雜洗凈后，置于恒溫干燥箱中，120 ℃殺青20 min，60 ℃烘干，搗碎過60目篩，稱取5 g土沉香葉粉末放入250 mL錐形瓶中，加塞密封，用體積分?jǐn)?shù)80 %的乙醇置于恒溫水浴鍋中加熱回流，浸提3次，每次2 h，雙層濾紙過濾，并定容于250 mL容量瓶內(nèi)。準(zhǔn)確吸取0.5 mL待測液于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)80 %的乙醇定容至100 mL。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取單寧標(biāo)準(zhǔn)液(0.102 mg/mL)0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL滴入6只盛有約10 mL蒸餾水的25 mL容量瓶中，分別加入3.0 mL Folin-Denis顯色劑、5 mL飽和Na2CO3溶液，加入蒸餾水定容至25 mL，搖勻避光顯色30 min后，以未加單寧試劑的混合液作空白，測定760 nm波長處吸光度值。以吸光度值作縱坐標(biāo)，以溶液中單寧的含量(mg)作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 樣品測定 取0.5 mL土沉香葉單寧提取液放入盛有約10 mL蒸餾水的25 mL容量瓶中，加入3.0 mL顯色劑并搖勻，加入5 mL飽和Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，充分搖勻靜置避光顯色30 min后，以空白試劑作參比，1 cm比色皿在760 nm波長處測吸光度。樣品單寧含量計(jì)算公式：

T(%)=(A×V1×d)/(m×103)×100 %。

式中:T為單寧含量，A是由測得的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出溶液中的單寧含量(mg)；V1是樣品提取液定容體積(mL)；d是稀釋倍數(shù)；m是樣品質(zhì)量(g)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和制圖，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片可溶性糖含量 葡萄糖含量在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖含量與吸光度值有較好的線性關(guān)系，回歸方程y=0.0075x+0.0104，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999。

在3種不同抗蟲性的土沉香樣品中，感蟲土沉香葉片可溶性糖含量為2.7 mg/g，占樣品鮮重的0.27 %，抗1土沉香葉片可溶性糖含量為1.5～2.1 mg/g，占樣品鮮重的0.18 %，而抗2土沉香葉片可溶性含量最低，為1.1～1.5 mg/g，占樣品鮮重的0.13 %(圖2)?？剐酝脸料闳~片可溶性糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于感蟲土沉香葉片可溶性糖含量(P<0.01)，其中感蟲葉片的可溶性糖含量為抗1的1.5倍，抗2的2.1倍。雖然抗1的可溶性糖含量比抗2的含量多，但未達(dá)到顯著性差異(P<0.05)。

2.2 葉片蛋白質(zhì)含量 牛血清蛋白含量在0～80 μg/mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與吸光度值有較好的線性關(guān)系，回歸方程y=0.004 9x+0.008，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9。

抗蟲品種與感蟲品種可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著(P<0.05)，其中感蟲土沉香葉片可溶性蛋白含量為6.47～7.29 mg/g，抗1土沉香葉片可溶性蛋白含量為4.69～5.23 mg/g，是感蟲土沉香葉片可溶性蛋白含量的72 %左右(圖3)。而抗2土沉香葉片可溶性蛋白的含量為5.12～5.48 mg/g，約為感蟲土沉香葉片可溶性蛋白含量77 %，可溶性蛋白含量由大到小依次為：感蟲土沉香葉片，抗2土沉香葉片，抗1土沉香葉片?？?、抗2土沉香葉片可溶性蛋白含量差異不顯著(P<0.05)，但可溶性蛋白含量和抗蟲性呈負(fù)相關(guān)，即抗性越強(qiáng)，可溶性蛋白含量越低。

注：圖中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，柱形圖上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

圖2不同抗性土沉香葉片可溶性糖含量

注：圖中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，柱形圖上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

圖3不同抗性土沉香葉片可溶性蛋白質(zhì)含量

2.3 葉片單寧含量 單寧含量在0～0.012 mg/mL范圍內(nèi)，單寧含量與吸光度值有較好的線性關(guān)系，回歸方程y=35.378x+0.006 4，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 9。

分析結(jié)果表明，感蟲土沉香葉片樣品中的單寧含量為(9.13±0.49)%，抗1的單寧含量為(11.89±0.31)%，抗2的單寧含量為(14.01±0.47)%。三者之間差異性極顯著(P<0.01)?？剐酝脸料闳~片單寧含量顯著高于感蟲土沉香葉片，而2種抗性土沉香中，抗2品種大于抗1品種(圖4)。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測定結(jié)果顯示，抗1植株和抗2植株葉片可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量均顯著低于感蟲植株葉片(P<0.05)，但兩者抗性植株葉片單寧含量均高于感蟲植株(P<0.05)。

注：圖中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，柱形圖上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

圖4不同抗性土沉香葉片單寧含量

可溶性糖含量與植物的抗蟲性相關(guān)，且在抗蟲種與感蟲種間差異顯著。然而植物的抗蟲性是植物內(nèi)在和外在理化特性的綜合表現(xiàn)，是一個(gè)復(fù)雜的防御能力的綜合體現(xiàn)[9-11]，因此對于抗性土沉香樹種抗性機(jī)制有待進(jìn)一步確定。

抗性土沉香葉片內(nèi)可溶性糖及可溶性蛋白的含量較低。寄主植物只有在滿足一定的營養(yǎng)成分和含量后，才能被某些植食性昆蟲危害。由此可推斷，黃野螟不取食抗性土沉香葉片可能與寄主植物營養(yǎng)物含量未滿足其需求有關(guān)。

黃野螟對土沉香的選擇性受植株體內(nèi)各種抗生物質(zhì)的綜合影響，并不是某單一物質(zhì)的作用[12]。本試驗(yàn)僅研究了土沉香葉片中單寧含量及其與黃野螟抗性的關(guān)系，而葉片內(nèi)其他次生物含量及其與黃野螟抗性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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ResistancemachenismofAquilariasinensisagainstHeortiavitessoidesMoore

ZHU Chengqi,et al.

(College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

The content of soluble sugar,soluble protein and tennin from the leaves ofAquilariasinensis(Lour.) Gilg were measured by ultraviolet spectrophotometer.These leaves showed different resistance towardsHeortiavitessoidesMoore.The content of soluble sugar and soluble protein in resistant leaves were significantly lower than susceptible leaves.However,the content of tannin in resistant leaves was obviously higher than susceptible ones (resistant trees 2> resistant trees 1> susceptible trees).The content of soluble sugar and soluble protein had negative correlations with the resistance,while the content of tannin had positive correlations with the resistance.

HeortiavitessoidesMoore;Aquilariasinensis;insect-resistant mechanism;resistant varieties

2017-01-11；

2017-02-13

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目 黃野螟性信息素鑒定與抗蟲品種選育(2011KJCX028、2014KJCX020-01)

朱誠棋(1992—)男，浙江嘉興人，碩士研究生，主要研究方向：森林害蟲防治及昆蟲性信息素研究。E-mail:cqzhu@stu.scau.edu.cn

溫秀軍，教授，主要從事森林保護(hù)研究，E-mail:wenxiujun@scau.edu.cn。

S763.42

A

1671-0886(2017)05-0005-04

(責(zé)任編輯 王巧申)