實時熒光PCR法在魚翅鑒別中的應(yīng)用

方軍，林晨，張志軍，王李平，熊娟，陳敏兒

（中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510070）

實時熒光PCR法在魚翅鑒別中的應(yīng)用

方軍，林晨，張志軍，王李平，熊娟，陳敏兒

（中國廣州分析測試中心，廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510070）

為有效鑒別市售魚翅的真?zhèn)?，針對魚翅中鯊魚源性成分的線粒體基因組的部分序列，利用實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，通過特異性引物和探針的設(shè)計建立起一種有效的真?zhèn)舞b別方法。該方法中對樣品脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）的提取方法、DNA檢測的濃度靈敏度、質(zhì)量靈敏度以及方法的特異性進行研究。結(jié)果表明魚翅樣品用試劑盒進行提取效果良好，其檢測的DNA濃度靈敏度可達1×10-5ng/μL，質(zhì)量靈敏度可達0.01%。利用該方法對市場上的購買的47份魚翅類樣品和18份非魚翅樣品進行了檢測，43樣品檢測出鯊魚成分，包括4份仿魚翅在內(nèi)的22份未檢出鯊魚成分。

魚翅；實時熒光PCR；靈敏度；特異性；鑒別

魚翅，又稱鮫鯊翅、鯊魚翅，是一種由軟骨魚系鯊魚或犁頭鰩經(jīng)加工而制作的產(chǎn)品，主要以鰭中的軟骨（又稱翅筋）供食，主要包括背鰭、胸鰭、尾鰭、腹鰭等。魚翅制作工藝復雜，包括去沙、漂白、脫皮和去骨等多種工序。由于原料數(shù)量有限[1]，且魚翅富含膠原蛋白[2]，價格昂貴，尤其是在東南亞市場，屬高端消費品。隨著人們生活水平的不斷提高，對魚翅的消費需求量越來越大。由于我國相關(guān)法規(guī)的不完善，許多不法分子趁虛而入，選用明膠、海藻酸鈉為主要原料，研制出仿真魚翅，其在外觀和口感上和真魚翅類似，很難辨認。近年來，市場上出現(xiàn)大量的仿真魚翅[3]，擾亂市場秩序，極大的損害消費者的權(quán)益。

為辨別魚翅的真?zhèn)?，保障消費者的權(quán)益，研究人員已開發(fā)出多種鑒別魚翅真?zhèn)蔚姆椒╗4-11]，如郭云霞等[5]建立利用感官技術(shù)和普通PCR技術(shù)鑒別真?zhèn)蔚姆椒?，林婉玲等[6]用熱脹冷縮的方法鑒別真?zhèn)?，冼燕萍等[7]用掃描電鏡鑒別真?zhèn)?，韓婉清等[8]發(fā)展紅外光譜鑒別魚翅真?zhèn)蔚募夹g(shù)。PCR作為檢測遺傳信息載體DNA的一種新方法，具有操作簡單、特異性好、靈敏度高的特性，廣泛用于物種鑒定和生物體的真?zhèn)舞b別[9-24]，國內(nèi)也有大量文獻報道利用PCR技術(shù)鑒別鯊魚源性成分的方法[12-15]，如覃芳芳等[12]、郭云霞等[13]使用普通PCR技術(shù)鑒別鯊魚源性成分，建立相應(yīng)的行業(yè)標準。實時熒光PCR技術(shù)作為一種在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的技術(shù)，實時熒光PCR技術(shù)全程采用的是閉管式檢測，不需PCR后處理，克服普通PCR假陽性問題和交叉污染，靈敏度高，特異性強，無需電泳，簡單快速[10]，郭云霞等[14]建立SYBR Green熒光PCR技術(shù)鑒別鯊魚源性成分的方法。王德蓮等[16]利用實時熒光PCR技術(shù)成功地鑒別了魚翅制品中的鯊魚源性成分。但是熒光染色PCR法由于產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，容易導致高背景和假陽性，使其應(yīng)用受到了一定程度的限制。

細胞中的線粒體基因特異性較強，具有潛在靶基因的優(yōu)勢[11，17]。本研究根據(jù)鯊魚綱在細胞色素氧化酶序列，設(shè)計出特異性引物和探針，建立了實時熒光PCR技術(shù)鑒別魚翅真?zhèn)蔚男路椒?，試驗結(jié)果優(yōu)于文獻[15]的報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售47份魚翅樣品，包括29份魚翅干制品（明翅）、8份未加工的干魚翅（生翅），4份泡發(fā)魚翅，2份凍干魚翅（明翅），4份仿魚翅類樣品：廣州市海味干果行業(yè)商會；鱈魚、石斑魚、魷魚、秋刀魚、帶魚、金鯧魚、黃魚、平菇、花生、海帶、玉米、冬瓜、土豆、紅薯、黃豆、雞、鴨、羅非魚：市售。DNA提取試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司；魚翅引物（COI-F、COI-R）：生工生物工程（上海）有限公司；TaqMan探針：Invitrogen公司；PCR預混合溶液（PCR-mix）：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司；PICO17高速臺式離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司。

選取細胞色素氧化酶COI基因為魚翅的特異基因，利用Vector NTI軟件對查到的各序列進行比對，比對結(jié)果表明COI基因具有一定的保守性，并通過軟件Primer Express 3.0.1設(shè)計特異引物及探針。引物和探針序列如表1所示。

表1 魚翅引物及探針Table 1 Primers and probes for shark fins

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

魚翅干制品、未加工的干魚翅和凍干魚翅用銼刀磨碎成粉狀后備用，泡發(fā)魚翅烘干后用粉碎機制成粉狀后備用，羅非魚肉樣品烘干后研磨成粉末。取粉末狀魚翅樣品按一定質(zhì)量分數(shù)比添加到粉末狀的羅非魚樣品中，混合均勻，用于質(zhì)量靈敏度的測定。

1.3.2 DNA提取

分別稱取約0.01 g樣品，利用迪澳公司的動物組織的基因組提取試劑盒或者植物組織的基因組提取試劑盒進行樣品DNA的提取，作為DNA擴增的模板。

1.3.3 PCR擴增

經(jīng)試驗確定的實時熒光PCR反應(yīng)體為：12.5 μL的 PCR-Mix，引物 COI-F/R 各 1 μL，Probe 0.5 μL，無菌水 5 μL，5 μL DNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方案的確定

稱取不同質(zhì)量的魚翅樣品，利用迪澳公司的動物組織的基因組提取試劑盒進行樣品DNA的提取，使用核酸定量分析儀測定其質(zhì)量，檢測結(jié)果顯示，DNA濃度為358 ng/μL，OD260/OD280比值為1.8。表明本試驗所用DNA試劑盒能夠提取到足夠量的DNA，滿足后續(xù)檢測的要求。以提取的DNA作為陽性模板，ddH2O作為陰性對照，以COI-F/R作為引物，加入相應(yīng)的探針，進行PCR擴增。參照ABI7500熒光PCR儀使用說明書，設(shè)置反應(yīng)程序為：Holding Stage為95℃5 min，1個循環(huán)；Cycling Stage為95℃ 20 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，并收集熒光信號，結(jié)果圖1所示。

從圖 1可以看出，0.01、0.02、0.005 g魚翅樣品的擴增曲線的Ct值分別在27、28、29，均為有效擴增。0.01 g樣品量時擴增效果最好，因此取0.01 g樣品作為本試驗的取樣量。

2.2 濃度靈敏度試驗

將魚翅 DNA 分別稀釋至 1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5ng/μL幾個梯度，每個稀釋度分別取5 μL進行PCR實驗，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，以COI-F/R作為引物，加入相應(yīng)的探針，進行PCR擴增，并收集熒光信號，以確定該檢測方法對魚翅檢測的濃度靈敏度，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，將魚翅DNA稀釋至不同濃度梯度進行擴增后，出峰時間和濃度梯度呈明顯梯度變化，1×10-5ng/μL的魚翅在Ct值為35時出現(xiàn)陽性擴增，其DNA檢測的濃度靈敏度可達1×10-5ng/μL。與王德蓮[15]相比，檢測DNA靈敏度更高，是其1000倍左右。

圖1 不同提取方案得到的擴增曲線Fig.1 Amplification curves from different extraction method

圖2 DNA濃度靈敏度試驗Fig.2 Sensitivity of different DNA concentration

2.3 質(zhì)量靈敏度試驗

將粉碎后的魚翅樣品與粉碎后的羅非魚肉樣品混合，使其質(zhì)量分數(shù)分別為0.01、0.1、1、10%的幾個梯度，加入相應(yīng)的探針，進行PCR擴增，并收集熒光信號，以確定該檢測方法對魚翅檢測的靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，將魚翅DNA稀釋至不同的質(zhì)量分數(shù)，COI-F/R作為引物進行PCR擴增，出峰時間和質(zhì)量分數(shù)呈明顯梯度變化，含0.01%（m/m）魚翅的混合樣品在Ct值為33時出現(xiàn)有效擴增，因此該方法能檢測出樣本中0.01%的鯊魚源性成分。與王德蓮[15]相比，檢測的質(zhì)量靈敏度也大幅度提高，是其10倍左右。

2.4 特異性試驗

分別選取1個明翅、1個生翅、1個泡發(fā)魚翅、1個凍干魚翅、1個仿魚翅以及18個非魚翅樣品，進行PCR擴增，結(jié)果如圖4。

從圖4可以看出，COI-F/R引物只在鯊魚源性樣品（包含明翅、生翅、凍干魚翅、泡發(fā)魚翅）中有擴增，在仿翅樣品中未發(fā)生擴增，與文獻[3]的報道的仿魚翅主要為明膠、海藻酸鈉，不含鯊魚成分的調(diào)查結(jié)果相吻合。在其余18個非魚翅樣品（包括合鱈魚、石斑魚、魷魚、秋刀魚、帶魚、金鯧魚、黃魚、平菇、花生、海帶、玉米、冬瓜、土豆、紅薯、黃豆、雞、鴨和羅非魚）中也未發(fā)生擴增，說明該檢測方法的特異性良好，可用于鯊魚源性樣品的檢測。

圖3 質(zhì)量靈敏度Fig.3 Sensitivity of different weight concentration

圖4 鯊魚源性成分檢測的特異性試驗Fig.4 Specific detection of shark-origin components

2.5 實際樣品檢測

利用本試驗建立的方法對采集到的市售47份各種魚翅樣品進行檢測，包括仿魚翅、明翅、生翅、泡發(fā)魚翅和凍干魚翅，結(jié)果如圖5所示。

圖5 實際樣品檢測的DNA擴增譜圖Fig.5 Amplification curves of shark fins

從圖5可以看出，COI-F/R引物在4份仿魚翅樣品中未出現(xiàn)擴增，在其余43個魚翅樣品中均出現(xiàn)有效擴增，說明該43個樣品中含有鯊魚源性成分，上述43份魚翅均為銷售方聲稱的真魚翅樣品，說明目前廣州海味市場銷售的魚翅中均含有鯊魚成分。

3 結(jié)論

本研究通過設(shè)計特征的引物和探針，建立實時熒光PCR法鑒別魚翅真?zhèn)蔚姆椒?。通過相關(guān)試驗表明，該方法DNA濃度靈敏度可達1×10-5ng/μL，質(zhì)量靈敏度可達0.01%，檢出限可達0.1%。與王德蓮等[15]采用的實時熒光PCR方法相比，濃度靈敏度提高3個數(shù)量級，質(zhì)量靈敏度提高1個數(shù)量級，且具有較高的物種特異性。通過對市場上銷售的魚翅樣本及非魚翅類的動植物樣本進行檢測，43份真魚翅樣本中均檢出鯊魚源性成分，而22份非鯊魚源性魚翅樣本中均未檢出鯊魚源性成分，顯示出該方法具有良好的特異性和通用性，為鑒別市售魚翅的真?zhèn)翁峁┝艘环N可靠的技術(shù)手段。

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Identification of Shark Fins with Real-Time PCR Method

FANG Jun，LIN Chen，ZHANG Zhi-jun，WANG Li-ping，XIONG Juan，CHEN Min-er
（China National Analytical Center，Guangzhou，Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

A novel effective method for identification of shark fins available in market was established by Real time Polymerase Chain Reaction（PCR）technique.Specific primers and probes were designed from a portion mitochondria genome of shark fin.Extraction method of Deoxyribonucleic acid（DNA），sensitivity of DNA concentration，sensitivity of DNA weight and specificity were investigated.It was indicated that enough concentration of DNA for detection would be obtained by kit extraction method.DNA concentration sensitivity of 1×10-5ng/μL and DNA weight sensitivity of 0.01%were abtained.47 shark fin products and 18 non-shark fin products available in market were determined with the above PCR method.DNA of shark was be found in 43 products while DNA of shark was not be found in other 22 products including 4 man-made shark fin products.

shark fin；real-time PCR；sensitivity；specificity；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.026

廣東省省級科技計劃項目（2013B020501005、2015B090906023）

方軍（1975—），男（漢），高級實驗師，碩士，研究方向：食品檢測與質(zhì)量控制。

2017-04-02