浙江省無花果種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析評價(jià)

劉亞群，王燕飛，段柳會，王麗玲，張飛英，韓素芳

浙江省無花果種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析評價(jià)

劉亞群1，王燕飛2，段柳會3，王麗玲1，張飛英1，韓素芳1

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 龍泉市林場，浙江 麗水 323700;3. 開化縣音坑鄉(xiāng)林業(yè)站，浙江 衢州 324309）

利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合物候期對從美國、英國、意大利、法國、中國等地收集的適合浙江省種植的15個(gè)無花果品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同品種物候期存在不同程度差異，萌動期均為3月中下旬；展葉期在4月中下旬；座果期基本為5月初；果實(shí)成熟期6月底、7月中旬、7月底，8月中旬、9月均有；篩選出SRAP引物34個(gè)，擴(kuò)增出204條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為62.25%，表明無花果種質(zhì)資源的種內(nèi)變異較為豐富；15個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)在0.691 ～ 0.922，其中‘波姬紅’與‘瑪斯義陶芬’，‘美麗亞’與‘金傲芬’之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.922，親緣關(guān)系最近；‘紅矮生’和‘日本紫果’遺傳相似系數(shù)最小，為0.691。聚類分析表明在遺傳距離為0.735處，不同品種分為兩個(gè)大類群，其中‘紅矮生’單獨(dú)聚為一類，其余品種聚為一類。物候期觀察表明，同一生長環(huán)境下，物候期與品種親緣關(guān)系相關(guān)。

無花果；種質(zhì)資源；親緣關(guān)系；SRAP；分子標(biāo)記

無花果Ficus carica為?？芃oraceae榕屬Ficus植物，其隱花果味甜可食，富含活性多糖、黃酮等功能性成分。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就記載其果實(shí)有健胃清腸、消食解毒功效，具有降血壓、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種功能，在臨床上可用于治療糖尿病、咽喉腫痛、腫瘤及免疫功能低下等疾病，堪稱“圣果”[1-2]。無花果對土壤要求不嚴(yán)，在砂土、微酸性及鹽堿地均可種植，新疆、山東、江蘇、浙江均有廣泛栽培[3]。中國無花果品種有1 000多個(gè)，但具有推廣價(jià)值的不超過100個(gè)[4]。無花果可分為野生類型和栽培類型，后者又根據(jù)結(jié)實(shí)是否需授粉分為普通類型、斯密爾那類型、中間類型和原生類型，目前世界范圍內(nèi)栽培品種多為普通類型無花果，不經(jīng)授粉即可形成可食用的果實(shí)。根據(jù)果實(shí)成熟時(shí)期將無花果分為夏果專用種、秋果專用種、夏秋果兼用種。根據(jù)無花果果皮和果肉顏色可分為綠色品種，如‘青皮’、‘綠抗 l號’；紅色品種，如‘波姬紅’、‘日本紫果’、‘瑪斯義陶芬’等；黃色品種，如‘豐產(chǎn)黃’、‘布蘭瑞克’、‘金傲芬’等。但上述標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，難以區(qū)分?jǐn)?shù)以百計(jì)的品種資源[5]。2003年國際植物遺傳資源研究所和地中海高級農(nóng)業(yè)國際研究中心共同編輯《Descriptors for Fig（Ficus carica L.）》，對無花果表型性狀有了更細(xì)致的描述，但由于描述的性狀數(shù)量不多，在應(yīng)用上仍有一定的局限性[6]。浙江省金華、嘉興、湖州等地都有規(guī)模種植，主栽品種有‘瑪斯義陶芬’、‘綠抗1號’等十幾個(gè)品種。無花果多用扦插繁殖，2015年本研究組采用扦插方式建立了種質(zhì)資源保存圃，并對不同無花果品種大田扦插的生長特性進(jìn)行了研究[7]。隨著經(jīng)濟(jì)增長和人民生活水平的提高，無花果的營養(yǎng)、藥用和保健價(jià)值日益受到重視，社會需求越來越多，浙江省栽培面積也逐漸擴(kuò)大。不同環(huán)境條件下的繁殖栽培，也會造成種內(nèi)變異的多樣性[8]，因此建立在DNA水平之上的分子標(biāo)記為無花果遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、親緣關(guān)系分析、品種分類鑒定及種質(zhì)資源保護(hù)等開辟了新途徑。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）技術(shù)具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率、高共顯性、便于克隆測序目標(biāo)片段、在基因組中分布均勻等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于櫻桃Cerasus pseudocerasus，梅Armeniaca mume，蘋果 Malus pumila，柑橘 Citrusreticulata，陽芋 Solanum tuberosum，稻 Oryza sativa，蕓苔 Brassica campestris，蒜Allium sativum，萵苣Lactuca sativa，旱芹Apium gravelens，草棉Gossypium herbaceum等植物和稻瘟病（病原菌：Magnaporthe grisea）的遺傳圖譜構(gòu)建比較基因組學(xué)、遺傳多樣性分析、基因定位、雜種優(yōu)勢預(yù)測等方面的研究[9-14]。本文利用SRAP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合物候期對適合浙江省栽培的15份無花果種質(zhì)資源材料進(jìn)行了親緣關(guān)系分析評價(jià)，以期為無花果種質(zhì)資源的保存、保護(hù)及分子輔助選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 種質(zhì)資源圃概況

無花果種質(zhì)資源圃位于浙江省武義縣桑和水果專業(yè)合作社，119°49′ E，28°54′ N，海拔91 m，酸性紅壤，中亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫16.9℃，年降水量1 445.7 mm，年日照時(shí)數(shù)1 963.7 h。該圃建于2015年，占地0.13 hm2，15個(gè)種質(zhì)引自浙江嘉興神農(nóng)無花果果園，每份種質(zhì)資源25株，為1年生裸根苗，平均高55 cm，地徑1 cm。按行株距2.5 m×1.0 m分行定植。種源原產(chǎn)地分別為美國、意大利、英國、西班牙、中國，詳見表1。

1.2 材料

2016年3月，每個(gè)品種隨機(jī)選取5株，每株采集植株頂端初展開的完全葉1 ～ 2片，同一品種的嫩葉合并放入裝有硅膠干燥劑的密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取 基因組提取采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（BioTeke，北京），DNA提取后通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000C微量核酸蛋白測定儀檢測完整性、純度及濃度。D260/D280在1.8 ～ 2.0之間的DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.3.2 SRAP引物篩選和PCR擴(kuò)增 從15份樣品中隨機(jī)選擇5份樣品進(jìn)行SRAP引物篩選，共獲得34對擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰的多態(tài)性引物（見表2）。利用這34條引物對15份無花果樣品進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增。SRAP擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL體系：10.0 μL 2×Power Taq PCR MasterMix，模板DNA 60 ng，SRAP上游引物1 μL (10 μmol·L-1)，下游引物 1 μL（10μmol·L-1），ddH2O 補(bǔ)足 20 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 TC-XP 型擴(kuò)增儀（杭州博日）上進(jìn)行。SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，35℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)，94℃變性1 min，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR擴(kuò)增片段的數(shù)量、片段分子量大小以及多態(tài)性。

表1 15 個(gè)無花果品種特征信息[3,15]Table 1 Information of 15 cultivarsof Ficus carica

表2 SRAP引物Table 2 SRAP primers

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析記錄同一水平位置重復(fù)出現(xiàn)的條帶。在相同的遷移率上，有帶用1表示，無帶用0表示。采用NTSYS-pc2.10e軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，使用軟件中的SimQual程序計(jì)算樣品間的DICE遺傳相似系數(shù)（GS，Genetic similarity）和遺傳距離（GD，Genetic distance），用SHAN程序進(jìn)行非加權(quán)成對算術(shù)平均法聚類分析（UPGMA，Unweighted pair-group method with arithmetic means），通過Tree plot模塊生成聚類圖。

1.4 物候觀測

2016年2－10月，每個(gè)品種隨機(jī)選取5株進(jìn)行萌動期、展葉期、座果期及果實(shí)成熟期觀測，每3 d記錄1次，取平均值作為結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 物候期觀測分析

對無花果種質(zhì)資源圃15個(gè)品種萌動期等物候期進(jìn)行觀測，結(jié)果見表3。由表3可知，所有品種的萌動期均在3月中下旬。除‘B1011’，‘日本紫果’，‘B110’及‘青皮’，其余都在4月中下旬進(jìn)入展葉期。除‘日本紫果’在6月底，‘AA1213’，‘紅矮生’在5月下旬，其其余座果期均均為5月初。果果實(shí)成熟期則則差別較大，分為6月底、7月中旬、7月底，8月中旬、9月初初五類。從物候候期上看，品品種間存在不不同程度的差異異。其中‘金金傲芬’和‘美美麗亞’除萌萌動期相差155 d，其余均比較接近；‘波姬紅’及及‘瑪斯義陶陶芬’的座果期一致，其余余差別都在115 d以內(nèi)。從從形態(tài)上看，‘波姬紅’和和‘瑪斯義陶陶芬’果實(shí)顏顏色相近，葉片裂度也相似似，‘金傲芬芬’和‘美麗麗亞’果實(shí)顏色（圖 1）及及葉片特征也也均十分相似似，需通過基因組學(xué)來判別別。

表3 15個(gè)無花果種質(zhì)的物候期觀測結(jié)果Table 3 Phelological period of 15 cultivars of F. carica

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

利用篩選選出的34個(gè)SSRAP引物對對無花果基因組DNA進(jìn)行行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠膠電泳結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定、重復(fù)性和多多態(tài)性較高的條帶。圖2是引物MEE1 ～ EM8 對15個(gè)無花果品種的擴(kuò)增增圖譜。34條條引物擴(kuò)增共共獲得204條條帶，條帶帶介于 100 ～2 000 bp，其其中多態(tài)性條帶127條，多態(tài)率62.225%，表明無無花果種質(zhì)間的基因差異異明顯。

圖1 ‘瑪斯義陶芬’、‘‘波姬紅’、‘金傲芬’、‘美麗亞’葉片片圖Figure 11 Leaf of ‘Masuu i Dauphine’, ‘A1132’, ‘A212’ andd ‘A134’

圖2 引物物 ME1 ～ EM88擴(kuò)增圖譜Figure 2 Amplification profile of primer ME1-EM8

2.3 遺傳相似性分析

將34條條引物擴(kuò)增出的條帶作為原始矩陣，利利用NTSYS-pc軟件計(jì)算15個(gè)品種間的的Dice遺傳相似系數(shù)，得到遺傳相似系數(shù)在0.691 ～ 0.922，平均為0.409，說明各個(gè)無花果品種間親緣關(guān)系都比較近。其中‘波姬紅’與‘瑪斯義陶芬’、‘美麗亞’與‘金傲芬’之間的遺傳相似系數(shù)最大為0.922，表明兩者間的親緣關(guān)系最近，與觀測到的品種形態(tài)特征結(jié)果一致；其次為‘青皮’與‘綠抗1號’，其遺傳相似系數(shù)為0.902。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的為‘紅矮生’和‘日本紫果’，其遺傳相似系數(shù)最小為0.691；其次為‘日本紫果’與‘B110’，其遺傳相似系數(shù)為0.701。15個(gè)無花果品種間的遺傳相似系數(shù)詳見表4。

表4 15個(gè)無花果品種間遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficient among 15 F. carica cultivars

2.4 聚類分析

利用UPGMA法對15個(gè)無花果品種進(jìn)行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖（圖3）。從圖3可知，在遺傳相似系數(shù)為0.735處可將15個(gè)無花果品種分為2大類。其中‘紅矮生’單獨(dú)聚為一類，其余品種聚為一類。表明‘紅矮生’與其他品種之間的遺傳差異較大，即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第 I大類可分為 3個(gè)小類。第一小類包含‘B110’、‘波姬紅’及‘瑪斯義陶芬’，且‘波姬紅’及‘瑪斯義陶芬’在最開始即相聚，表明兩者之間親緣關(guān)系較近。此外，‘小青皮’與‘日本紫果’雖然聚為一類，但是相聚時(shí)遺傳相似系數(shù)為 0.8左右，表示兩者之間還是存在一定的遺傳差異。其余品種聚為第三類?？傮w而言，15個(gè)品種間的遺傳差異性不大。

圖3 15個(gè)無花果品種UPGMA聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram of 15 cultivars of F. carica

3 結(jié)論與討論

物種的遺傳多樣性是其長期進(jìn)化的結(jié)果，也是其生存、適應(yīng)和發(fā)展的前提，遺傳多樣性在物種形態(tài)、分子水平上均有所表現(xiàn)，豐富的遺傳多樣性是寶貴的基因資源。本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對采自浙江武義的15個(gè)無花果品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)合物候及果實(shí)性狀比較不同無花果品種之間的遺傳差異性。結(jié)果表明，利用篩選出的34條SRAP引物對所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得204條條帶，其中多態(tài)性條帶127條，多態(tài)率為62.25%，且擴(kuò)增條帶清晰，樣品多態(tài)性較高。

遺傳相似性系數(shù)是用來比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù)，平均相似系數(shù)越高，說明樣品之間的差異性越小，即親緣關(guān)系越近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，15個(gè)樣品之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.691 ～ 0.922。相似系數(shù)最高的是‘金傲芬’和‘美麗亞’、‘波姬紅’和‘瑪斯義陶芬’，為0.922；最低的是‘紅矮生’與‘日本紫果’，為0.691?！t矮生’為盆栽無花果專用品種，小灌木，樹冠矮小，枝條節(jié)間短，分枝多，葉中大，掌狀五裂；果紫紅色，從形態(tài)上與其他無花果品種有顯著差別，與遺傳相似系數(shù)最低符合，總體而言15個(gè)樣品間的遺傳差異性不大。

進(jìn)一步的聚類分析結(jié)果表明，‘金傲芬’與‘美麗亞’、‘青皮’和‘綠抗1號’、‘波姬紅’及‘瑪斯義陶芬’三類品種親緣關(guān)系較近。其中‘金傲芬’與‘美麗亞’原產(chǎn)地均為美國加利福利亞州，都為黃色系品種；而‘青皮’和‘綠抗1號’產(chǎn)自中國的山東和江蘇，此聚類結(jié)果將兩者聚在一起，與樣品的原產(chǎn)地的地理位置接近相符合。一般而言，在同一地區(qū)采集的樣品遺傳相似度較高[8]。‘青皮’和‘綠抗 1號’是極易混淆的品種，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)二者遺傳相似系數(shù)接近，為下一步品種鑒別奠定基礎(chǔ)?！Ъt’及‘瑪斯義陶芬’最初就聚集在一起，‘波姬紅’原產(chǎn)地為美國德克薩斯州，而‘瑪斯義陶芬’原產(chǎn)地為美國加利福尼亞州，地理位置接近；根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，‘波姬紅’果形為長卵形，果肉為淺紅，果皮為紫紅；‘瑪斯義陶芬’果形為倒圓錐形，果肉為桃紅色，成熟時(shí)果皮為紫褐色；從形態(tài)學(xué)和地理分布而言，兩個(gè)無花果品種遺傳差異性非常接近，遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.922。

物候期觀察結(jié)果表明，同一生長條件下親緣關(guān)系最近的‘金傲芬’與‘美麗亞’除萌動期相差15 d，展葉期、座果期及果實(shí)成熟期表現(xiàn)一致；而‘波姬紅’及‘瑪斯義陶芬’的座果期一致，其余差別亦在15 d以內(nèi)。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的‘紅矮生’與‘日本紫果’除萌動期一致，展葉期呈現(xiàn)10 d的差別，座果期及果實(shí)成熟期相差40 d，差別較大。親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的‘日本紫果’和‘B110’萌動期等物候也表現(xiàn)出不同程度的差別，差別最大的為相差60 d座果期。同一生長環(huán)境下，物候期與品種類別呈現(xiàn)相關(guān)性，因此可考慮結(jié)合遺傳多樣性及更詳盡的物候分析，判斷品種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，為無花果優(yōu)良種源選育和推廣應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

[1] 浙江植物志編輯委員會. 浙江植物志（第二卷）[M]. 杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，1992.

[2] 馬會勤. 從無花果產(chǎn)業(yè)看中國特色農(nóng)業(yè)發(fā)展之路[J]. 中國農(nóng)村科技，2015（2）：32－33.

[3] 曹尚銀. 無花果無公害高效栽培[M]. 北京：金盾出版社，2003.

[4] 姜衛(wèi)兵. 無花果主要品種介紹[J]. 山西果樹，1990，（4）：27－32．

[5] 吳子江，馬翠蘭，郭陽彬，等. 無花果生產(chǎn)與研究進(jìn)展[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2013，9（3）：151－157.

[6] CABRITA L F，AKSOY U，HEPAKSOY S，et al．Suitability o fisozyme，RAPD and AFLP markersto assess genetic differences and relatedness among fig（Ficus carica L.）clones[J]. Sci Hor，2001（87）：261－273．

[7] 劉亞群，韓素芳，張飛英，等. 不同無花果品種大田扦插的生長特性研究[J]. 浙江林業(yè)科技，2016，36（6）：8－13.

[8] 王亮，王彩虹，田義軻，等. 山東省無花果種質(zhì)資源多樣性的RAPD分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8（3）：303－307.

[9] LI G，QUIROS C F．Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Gen，2001（103）：455－461．

[10] 林忠旭，張獻(xiàn)龍，聶以春，等. 棉花SRAP遺傳連鎖圖構(gòu)建[J]. 科學(xué)通報(bào)，2003，48（15）：1676，1679．

[11] LI G，GAO M，YANG B，et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J].Theor Appl Gen，2003，107（1）：168－180．

[12] FERRIOL M，PICO B，NUEZ F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbitapepo using SRAP and AFLP markers [J]. Theor Appl Gen，2003，107（2）：271－282．

[13] RIAZ A，LI G，QURESH Z，et al. Genetic diversity of oilseed Brassica napus inbred lines based on sequence-related amplified polymorphism and its relation to hybrid performance[J]. Plant Breed，2001，120（5）：411－415．

[14] 吳偉懷，王玲，程貫忠，等. 稻瘟病菌群體的分子遺傳學(xué)研究—廣東省與云南省稻瘟病菌群體遺傳及致病型結(jié)構(gòu)的時(shí)空變化分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（10）：1468－1473.

SRAP Analysis on Genetic Relationship of Germplasm Resources of Ficus carica in Zhejiang Province

LIU Ya-qun1，WANG Yan-fei2，DUAN Liu-hui3， WANG Li-ling1，ZHANG Fei-ying1，HAN Su-fang1
（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Longquan Forest Farm of Zhejiang, Lishui 323700, China;3. Forestry Station of Yinkeng Town of Kaihua county, Quzhou, Zhejiang, 324309）

Fifteen culitvars of Ficus carica from the United States, the United Kingdom, Italy, France and China were planted in Wuyi, Zhejiang province in 2015, leaves were collected in March 2016 for evaluation of genetic relationships among these cultivars by SRAP markers and observations on phenological periods. The results showed that there were differences in phenological period among 15 germplasm resources, with sprouting period from middle to late March, leaf expansion from middle to late April, fruit setting at early May, and fruit mature from late June to the early September. 34 SRAP primers were selected, 204 polymorphic bands were obtained by PCR with the polymorphic rate of 62.25%, indicating abundant intraspecific variation. The genetic similarity coefficient among 15 cultivars was 0.691-0.922, with the maximal coefficient of 0.922 of‘A132’ and ‘Masui Dauphine’, and the minimal of 0.691 of ‘Violette Solise’ and ‘Hongaisheng’. Cluster analysis showed that tested germplasm could be divided into two groups at genetic distance of 0.735. ‘Hongaisheng’ was clustered alone, the others were clustered into one group. Observation on phenological period of tested cultivars planted in the same location showed that their phenology had relation with their provenances..

Ficus carica; germplasm resources; genetic relationship; SRAP; molecular marker

S663.3

A

1001-3776（2016）05-0023-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.05.004

2017-03-25 ；

2017-07-08

浙江省科研院所專項(xiàng)（2015F30002）

劉亞群，高級工程師，從事林業(yè)土壤、植物的分析檢測工作；E-mail：liuyaqun2005@aliyun.com。通信作者：韓素芳，副研究員，從事經(jīng)濟(jì)林栽培研究；E-mail：hansufang2004@126.com。