云南核桃感病枝干真菌多樣性初步研究

趙玉美，趙寧，馮小飛，楊斌，陳玉惠

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650224)

云南核桃感病枝干真菌多樣性初步研究

趙玉美1，趙寧1，馮小飛1，楊斌2，陳玉惠1

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.西南林業(yè)大學(xué)，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650224)

在云南省核桃主產(chǎn)區(qū)的18個縣(市)開展了核桃JuglansregiaL.枝干病害調(diào)查，對所采集的194號標(biāo)本進(jìn)行了切片觀察及鑒定。結(jié)果表明：核桃枝干上的真菌隸屬于24屬28種，其中，15個屬作為核桃病原真菌已有報道，另9個屬未有病原菌方面的報道；本文列出了所鑒定屬、種的名錄。多樣性分析結(jié)果表明，各屬真菌占真菌總數(shù)的比例差異較大(0.65%～16.3%)；不同縣(市)核桃枝干的真菌多樣性也有較大差異，真菌 Shannon-Wiener指數(shù)差異也較大(0.6～2.10)。

真菌多樣性；核桃；感病枝干；云南

核桃材質(zhì)優(yōu)良，其種仁營養(yǎng)成分豐富，具有較好醫(yī)療保健功能，是荒山造林和退耕還林的重要樹種。近年來，我國的核桃栽培面積以每年10%的速度遞增[1]。云南省核桃種質(zhì)資源豐富，栽培歷史悠久，在滇西、滇西北、滇中、滇東北均有種植，覆蓋全省129個縣(市)中的110個縣(市)，截至2014年，全省核桃種植面積達(dá)273,33萬hm2，年產(chǎn)量77萬t，產(chǎn)值239億元，種植面積、產(chǎn)量、產(chǎn)值均居全國第一，種植農(nóng)戶已超過250萬戶[2]。在楚雄、大理、保山、臨滄等主產(chǎn)區(qū)，核桃種植已成為新型支柱產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民增收致富的重要來源。

然而，核桃種植面積的迅速擴(kuò)大，帶來種植方式的集中連片、樹種單一，以及集約化經(jīng)營、撫育管理水平參差不齊等問題，導(dǎo)致核桃病蟲害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，局部種植區(qū)幼樹染病率高達(dá)40%，核桃病蟲害已成為制約全省核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展和高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要瓶頸。迄今為止，國內(nèi)對核桃枝干病害病原菌的報道僅9種[3-6]，而云南省關(guān)于核桃病害種類、發(fā)生狀況、分布、危害等全面系統(tǒng)的研究更為缺乏。作者從云南省核桃主產(chǎn)區(qū)的18個縣(市)的感病枝干上采集標(biāo)本，經(jīng)切片觀察病部真菌的形態(tài)特征，對其進(jìn)行分類鑒定，明確病部真菌的種類并對其多樣性進(jìn)行了分析，以期對云南省核桃病害及病原菌種類、發(fā)生危害現(xiàn)狀有較全面的了解，指導(dǎo)病害的防控，為云南核桃種植業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源 2015年5月—2016年1月，分夏、秋、冬三個時段以踏查為主在昭通地區(qū)的魯?shù)榭h、永善縣和大關(guān)縣，曲靖地區(qū)的陸良縣、沾益縣和會澤縣，昆明市區(qū)及東川區(qū)，楚雄州的姚安縣和大姚縣，大理州的漾濞縣和永平縣，保山地區(qū)的保山市隆陽區(qū)和昌寧縣，麗江地區(qū)的華坪縣，怒江州的瀘水縣，臨滄地區(qū)的臨滄市臨翔區(qū)(臨滄市區(qū))和鳳慶縣采集核桃病枝和病干標(biāo)本，并拍攝生境照片及癥狀照片，然后逐個編號，帶回實驗室備用。

1.2 研究方法

1.2.1 切片制作 從病癥明顯的病部取樣，直徑約為3～5mm，徒手切片。尚無子實體的，對樣品進(jìn)行保濕處理，待長出子實體后，再做切片。

1.2.2 顯微觀察 挑取較薄的切片，以水作浮載劑制片，在MoticBA210顯微鏡下觀察記載、顯微計測、拍照。

1.2.3 形態(tài)鑒定 根據(jù)上述方法所觀察到的載孢體、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子的形狀、顏色和特征以及所計測的相關(guān)數(shù)據(jù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-13]，對真菌的種類進(jìn)行鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Shannon-Wiener指數(shù)來反映感病核桃枝干真菌的多樣性，Shannon-Wiener指數(shù)的計算公式為：

式中，n為真菌屬種數(shù)量，Pi為第i屬種真菌的比例，如真菌總數(shù)量為N，第i屬的數(shù)量為Ni，則Pi=Ni/N。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病核桃枝干的真菌多樣性 對采集的194號病枝干標(biāo)本，進(jìn)行徒手切片，共切出153個真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、分析，其分別隸屬于子囊菌門、擔(dān)子菌門及有絲分裂孢子類群下轄的24屬(表1)。

表1 核桃病枝干的真菌名錄

續(xù)表

注:“*”表示首次在核桃上報道的真菌屬；“**”表示首次在核桃上報道的真菌種。

各類群的真菌數(shù)量和Shannon-Wiener指數(shù)均有差異。其中：屬于有絲分裂孢子類群的真菌樣本數(shù)最多，占真菌總樣本數(shù)的66.7%，其Shannon-Wiener指數(shù)最大為2.2；屬于子囊菌門的真菌占真菌總樣本數(shù)的24.2%，但其Shannon-Wiener指數(shù)相對較小為1.7；屬于擔(dān)子菌門的真菌樣本數(shù)量最少為9.2%，其Shannon-Wiener指數(shù)為1.8。在屬的水平上，比例超過5%的有8個屬，又以擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis(Sacc.) Sacc.為優(yōu)勢菌群，占真菌總樣本數(shù)的16.3%，其次是小穴殼屬DothiorellaSacc.，占14.4%，殼梭孢屬FusicoccumCorda占7.8%，長孺孢屬HelminthosporiumLink為6.5%，莖點(diǎn)霉屬PhomaSacc.和隔擔(dān)菌屬SeptobasidiumPat.均各占5.9%，聚殼座屬Eutypella(Nitschke) Sacc.占5.2%，其它14個屬真菌的數(shù)量均較少，所占比例不足5%。各屬真菌的種數(shù)也有很大差異，長孺孢屬種數(shù)最多，為4種，擬莖點(diǎn)霉屬有2種，其它22屬真菌均只有一個種。

在感病核桃枝干上首次發(fā)現(xiàn)的真菌共有9種，觀察了其中8種的顯微特征(圖1)，觀察了另外1種自然狀態(tài)下的特征(圖2)。

A.子座和分生孢子器；B.α型和β型分生孢子圖1-1 胡頹子生擬莖點(diǎn)霉Phomopsis arnoldia的顯微特征

A.子囊殼的聚生頸；B.子囊及側(cè)絲；C.子囊孢子圖1-2 星芒狀彎孢聚殼Eutypella stellulata的顯微特征

A.子座及子囊殼；B.子囊殼及子囊；C.子囊及子囊孢子圖1-3 朱紅叢赤殼Nectria cinnabarina的顯微特征

A.分生孢子座；B.分生孢子圖1-4 普通瘤座孢Tubercularia vulgaris的顯微特征

A.分生孢子器；B.分生孢子圖1-5 蒂腐色二孢Diplodia natalensis的顯微特征

A.骨架-纏繞絲；B.擔(dān)孢子圖1-6 層疊樹舌Ganoderma lobatum的顯微特征

A.分生孢子器；B.分生孢子圖1-7 殼月孢屬之一種Selenophoma sp.的顯微特征

A.子囊座及子囊腔；B.子囊圖1-8 痂囊腔菌屬之一種Elsinoe sp.的顯微特征圖1 8種真菌的顯微特征

圖2 毛栓菌Trametes hispida的生境照

2.2 不同地區(qū)感病核桃枝干的真菌多樣性 不同地區(qū)感病核桃枝干上的真菌種類和數(shù)量均有差異(圖3)。18個縣區(qū)中，陸良的真菌種類12種和樣本數(shù)36株，最多；其次是沾益，種類和樣本數(shù)分別為11和29；臨滄臨翔區(qū)、大姚、永平和漾濞4縣的真菌均分屬于7個屬，但大姚的樣本數(shù)為19，臨滄臨翔區(qū)的樣本數(shù)為15，永平和漾濞病枝干樣本數(shù)較少，僅為11；其它縣區(qū)的真菌均不超過5屬，樣本數(shù)量不足10。

各縣區(qū)核桃病枝干上真菌的Shannon-Wiener指數(shù)也有較大差異(圖4)。沾益(2.10)的多樣性指數(shù)最高，其次是陸良(2.07)，漾濞(1.89)、永平(1.89)、臨滄臨翔區(qū)(1.73)、華坪(1.61)和大姚(1.57),5個縣區(qū)的真菌多樣性指數(shù)高于1.5，鳳慶(1.48)、保山隆陽區(qū)(1.39)、永善(1.10)和會澤(1.10)等4縣區(qū)的真菌多樣性指數(shù)在1.0～1.5之間，而六庫、魯?shù)?、大關(guān)和昌寧4個縣的多樣性均較低(0.7)，昆明市區(qū)因所切出的真菌每屬僅一個種，因此多樣性指數(shù)為0。

注：橫坐標(biāo)1-16分別代表臨滄臨翔區(qū)、鳳慶、陸良、沾益、會澤、大姚、漾濞永平、昆明市區(qū)、東川、六庫、魯?shù)椤⒋箨P(guān)、永善、昌寧、保山隆陽區(qū)和華坪(漾濞和永平兩地所采集的病枝干樣本數(shù)相同，真菌種數(shù)也相同，故兩地只設(shè)一個橫坐標(biāo))。

圖3各地區(qū)病枝干真菌樣本數(shù)和種數(shù)

注：橫坐標(biāo)1-16分別代表臨滄臨翔區(qū)、鳳慶、陸良、沾益、會澤、大姚、漾濞永平、昆明市區(qū)、東川、六庫、魯?shù)椤⒋箨P(guān)、永善、昌寧、保山隆陽區(qū)和華坪(漾濞和永平兩地所采集的病枝干樣本數(shù)相同，真菌種數(shù)也相同，故兩地只設(shè)一個橫坐標(biāo))。

圖4各縣區(qū)核桃病枝干真菌的多樣性

3 結(jié)論與討論

對云南核桃主產(chǎn)區(qū)感病枝干經(jīng)切片觀察，共鑒定出真菌28種，隸屬于24個屬，其中15個屬的真菌曾被作為核桃病害的病原菌報道過。但對核桃枝干部位病害的病原菌，前人報道的不足10種[3-6]，本研究表明云南核桃枝干病害上的真菌多樣性是豐富的，且各地存在差異。據(jù)分析，各地多樣性差異與各地所采病枝的樣本數(shù)不同有關(guān)。

本次研究新發(fā)現(xiàn)的、出現(xiàn)在核桃病枝干上的胡頹子生擬莖點(diǎn)霉、星芒狀彎孢聚殼、蒂腐色二孢、朱紅叢赤殼(其無性態(tài)為普通瘤座孢)、間座殼屬之一種Diaporthesp.、殼月孢屬之一種Selenophomasp.、痂囊腔菌屬之一種Elsinoesp.、引起木腐的層疊樹舌等，前人都曾作為植物病原菌報道過[14-22]，但均未報道為核桃病害的病原菌。鑒于其在枝干上較明顯的病狀和病癥，要確定它們?yōu)楹颂抑Ω刹『Φ牟≡?，還有待通過科赫法則做進(jìn)一步的驗證。

有些真菌種類是弱寄生，甚至可能是腐生的，如長蠕孢屬真菌通常在生長勢較弱的枝條上才出現(xiàn)，本研究所鑒定的該屬4個種：擬小叢長蠕孢、絨長蠕孢、多隔長蠕孢和小叢長蠕孢均出現(xiàn)在活的枝干上。但在本研究中，切出長蠕孢的核桃病枝干上，同時也可切到如桃殼梭孢、群生小穴殼等其它真菌，因此長蠕孢屬的真菌常與其它真菌對核桃病枝干形成交叉侵染。這可能是因為核桃樹勢減弱后，長蠕孢屬真菌才得以寄生。

某些在葉片上引起葉斑病的病原真菌，在核桃枝干上同樣可引起病害，如胡桃盤二孢常引起葉片的褐斑病，在病枝干上同樣出現(xiàn)。

因時間所限以及部分屬的參考文獻(xiàn)欠缺，還有一些真菌未能鑒定到種，暫以未知種記述。后續(xù)將參照前人的研究資料，必要時做小培養(yǎng)乃至分子系統(tǒng)學(xué)研究，力爭將多個經(jīng)純培養(yǎng)所獲得的、且培養(yǎng)性狀與顯微特征均有差異的菌株鑒定到種。

志謝：本項研究開展中，西南林業(yè)大學(xué)周彤燊教授對病原菌分離和形態(tài)鑒定給予了精心指導(dǎo)，所涉各縣、區(qū)林業(yè)局、森防站在標(biāo)本采集過程中給予了大力支持與熱情幫助，一并表示衷心感謝！

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(責(zé)任編輯 李計順)

PreliminarystudyonthefungidiversityfromthediseasedwalnutbranchesinYunnanprovince

/ZHAO Yumei,et al.

(Faculty of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

The author made investigations on walnut (JuglansregiaL.)trunk and branch diseases in 18 counties and districts of the main walnut-growing regions in Yunnan province,and collected 194 samples and made identifications by sliced observation and microscopy examination.The results showed that the fungi on walnut trunks and branches belonged to twenty-eight species in twenty-four genera,among which fifteen genera have been reported as walnut fungal pathogens,but none of the other nine genera has been reported.This paper listed all the identified fungi.The diversity analysis revealed that the fungal proportions in different genera varied greatly from 0.65% to 16.3%,and fungal diversity fluctuated largely in different counties and districts with their Shannon-Wiener indexes varied greatly from 0.6 to 2.10.

fungal diversity;walnut;diseased walnut trunk;Yunnan province

2016-09-21；

2016-11-07

云南省林業(yè)科技創(chuàng)新項目“云南核桃主要病蟲害種類及危害評價”(編號：[2014]CX05)；云南省高校森林有害生物科技創(chuàng)新團(tuán)隊(編號：51600507)

趙玉美(1983—)，女，漢族，云南龍陵縣人，碩士研究生，研究方向為微生物，E-mail：120985572@qq.com

陳玉惠，博士、教授，主要從事植物病理及植物生理生化研究，E-mail：cyh196107@126.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)04-0011-06