霍亂弧菌毒力基因zot的克隆表達(dá)及生物活性

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·論著·

霍亂弧菌毒力基因zot的克隆表達(dá)及生物活性

熊長輝，楊夢(mèng)，劉曉青，王鵬，徐曉倩

目的對(duì)霍亂弧菌zot毒力基因進(jìn)行表達(dá)并研究重組蛋白的生物活性。方法從霍亂弧菌(Vibrio cholerae)MO45中克隆zot的全基因序列，構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-zot并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，通過誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化重組蛋白，研究zot表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果純化蛋白的濃度為0.324 mg/mL，經(jīng)Western blot驗(yàn)證表達(dá)蛋白為目的蛋白，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)表達(dá)蛋白作用的人小腸上皮細(xì)胞顯示重組zot蛋白能引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡。結(jié)論成功克隆表達(dá)了霍亂弧菌毒力基因zot，重組蛋白能引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡。

霍亂弧菌；克隆表達(dá)；zot基因；人小腸上皮細(xì)胞

霍亂是由霍亂弧菌引起的急性水樣便為主要特征的腸道傳染病。由于僅有部分霍亂弧菌菌株可以引起霍亂流行，因此研究毒力基因分布和DNA分子特征，已成為目前學(xué)者們關(guān)注的重要課題[1]?；魜y毒力基因的分布特性為毒力因子產(chǎn)生水平轉(zhuǎn)移提供了環(huán)境毒力貯存庫，成為霍亂持續(xù)流行的重要因素[2]。外環(huán)境中大多數(shù)非致病性霍亂弧菌，經(jīng)過復(fù)雜的進(jìn)化和變異，某些特定的菌株可通過獲得毒力而有效定植在人類小腸并釋放腸毒素致病，其過程涉及多個(gè)毒力因子的協(xié)調(diào)作用[3-4]。在一定條件下，非流行株和非產(chǎn)毒株同樣可以感染人體引起腹瀉[5]。近年來發(fā)現(xiàn)，一些 O1/O139 群霍亂弧菌非產(chǎn)毒株也可以引起霍亂樣腹瀉[6]。zot毒力基因是檢測(cè)霍亂弧菌毒力強(qiáng)弱的第2個(gè)指標(biāo)，其編碼的毒素增加腸黏膜通透性以及細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的耦合，本研究對(duì)霍亂弧菌zot毒力基因進(jìn)行表達(dá)并研究表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒 人小腸粘膜上皮細(xì)胞(HUM-CELL-0032)，購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司；TOP10，BL21(DE3),質(zhì)粒(pET-32a(+)),購自Invitrogen Biotechnology公司；O139霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株(MO45)，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng).

1.2試劑與培養(yǎng)基TaqDNA聚合酶，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI(TaKaRa，Japan)；細(xì)菌DNA提取試劑盒，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒(OMEGA，USA)；鼠抗-His抗體，羊抗鼠lg-G/辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa Cruze, USA)；蛋白純化Ni-IDA Resin(均購自南京凱基，中國)。

1.3主要儀器 高速低溫離心機(jī)(德國eppendorf公司)、PCR 擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)、自動(dòng)凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、電泳儀(中國上海天能科技有限公司TANONEPS-100)、超凈工作臺(tái)(中國蘇凈安泰SW-CJ-2FD)、培養(yǎng)箱(日本EYELA SLI-1200)、高速冷凍離心機(jī)(德國SIGMA 3-18K)、生物安全柜(美國Thermo公司)、Olympus IS71倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)、流式細(xì)胞分析儀(美國BD FASCALBAR)、核酸/蛋白分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的霍亂弧菌標(biāo)株N16961(GenBank/NC_002505.1)的基因全長序列用Primer Primier 5軟件設(shè)計(jì)引物，其中，根據(jù)pET-32(a+)質(zhì)粒圖譜序列的酶切圖譜，于引物的5′端分別加入BamH I(CGGGATCC)、XhoI(CCGCTCGAG)酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基。引物如下：zotsense primer： 5′-CGGGATCCATGAGTATCTTTATTCATCAC-3′； zot Anti-sense primer： 5′-CCGCTCGAGTCAAAAT-ATACTATTTAGTCCTTTTTTATC-3′。

1.4.2MO45霍亂弧菌基因組DNA的提取 將霍亂弧菌MO45接種于LB肉湯，37 ℃，170 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取1 mL菌液加入1.5 mL 離心管，5 000 r/min 10 min，棄上清后用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取總DNA(方法參考OMEGA公司生產(chǎn)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書)。

1.4.3zot基因PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL；dNTPs (每種dNTP溶液濃度為2.5 mmoL/ L) 2 μL；引物每條1 μL (終濃度1 μmol/L)；Taq酶0.5 μL (5 U/μL)；超純水16 μL；模板2 μL，總反應(yīng)體積為 25.0 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，變性模板DNA；然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.4zot基因的克隆 純化后的zot基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pET32a(+) 用BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切，雙酶切后的zot基因及載體pET32a(+)按摩爾比2∶1加入連接反應(yīng)體系，T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化預(yù)先制備的感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌TOP10，涂布含60 μg/mL Amp LB平板，同時(shí)將0.2mL感受態(tài)細(xì)胞涂布于不含Amp LB平板作為對(duì)照。倒置平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑取單個(gè)白色菌落接種于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，振蕩培養(yǎng)160 r/min， 6～10 h，用于提取質(zhì)粒鑒定。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pET-32 a(+)-zot。

1.4.5 重組質(zhì)粒的鑒定

1.4.5.1重組質(zhì)粒的PCR鑒定 提取的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-zot為模板，用引物zotsense primer和zotAnti-sense primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.5.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定 對(duì)提取的重組克隆質(zhì)粒pET-32a(+)-zot用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.5.3基因序列測(cè)定 將經(jīng)雙酶切檢測(cè)陽性的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-zot送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，采用通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG進(jìn)行測(cè)序。

1.4.6重組克隆質(zhì)粒pET-32a(+)-zot的原核表達(dá)及表達(dá)結(jié)果分析 將重組質(zhì)粒pET-32a(+)-zot轉(zhuǎn)化預(yù)先制備的感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜；從轉(zhuǎn)化的LB平板上挑取重組菌落，接種于的LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL的卡那霉素)，同時(shí)接種宿主菌E.coliBL21(DE3)作為對(duì)照，37 ℃振蕩(200 r/min)過夜培養(yǎng)；然后以50 μL轉(zhuǎn)種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(100 μg/mL Amp)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至濃度OD600為0.6～0.8時(shí)，向培養(yǎng)菌液中加入IPTG(終濃度0.5 mmol)，分別置于15 ℃、28 ℃、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜，分別取1 mL培養(yǎng)物，12 000 r/min離心5min，去除上清液。在每管收集的菌體中加入60 μL 1×SDS，100 ℃煮沸10 min，14 000 r/min離心5 min，上清即為蛋白，收集蛋白于-20 ℃保存，并用SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.4.7表達(dá)蛋白放大培養(yǎng) 培養(yǎng)1 L的表達(dá)菌，生長至OD600=0.8時(shí)，加終濃度0.5 mmol IPTG，15 ℃誘導(dǎo)16 h后收集菌體，用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化表達(dá)蛋白(整個(gè)純化過程在低溫下操作，方法按南京凱基公司生產(chǎn)蛋白純化Ni-IDA Resin說明書操作)。

1.4.8蛋白濃度測(cè)定 吸取2 μL重組蛋白于核酸/蛋白分析儀測(cè)定其濃度。

1.4.9蛋白復(fù)性 經(jīng)Ni-IDA親和層析純化分析，收集純度較高的洗脫液進(jìn)行蛋白復(fù)性，并加DTT至終濃度為5 mmol后放入到處理后的透析袋中，4 ℃環(huán)境下，透析到緩沖液中進(jìn)行復(fù)性，每隔1.5 h換液一次，共9 h。然后用截留分子量為10 kDa的濃縮管濃縮，濃縮結(jié)束后，離心，取上清用0.22 μm濾器過濾后分裝，并將其凍存至-80 ℃，同時(shí)做Western blot鑒定表達(dá)蛋白。

1.4.10表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用 待細(xì)胞在培養(yǎng)板底部形成完整的類似上皮樣的膜狀結(jié)構(gòu)時(shí)用于試驗(yàn)，使用前細(xì)胞用Hank’s緩沖液洗3次，再向每孔加入1mLDMEM，分別向12孔板中加入10 μg(30.86 μL)、20 μg (61.73 μL)、40 μg(123.46 μL)、80 μg (246.91 μL) 表達(dá)蛋白，空白孔加入等量PBS進(jìn)行對(duì)照。重復(fù)1板。置37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后用流式細(xì)胞儀觀察并檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒pET-32(a+)-zot的構(gòu)建

2.1.1zot全基因PCR擴(kuò)增 用Primer Premier 5自行設(shè)計(jì)合成的特異性引物對(duì)從霍亂弧菌M045提取總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)計(jì)長度1 200bp一致的PCR產(chǎn)物(圖1)。

2.1.2重組質(zhì)粒的酶切分析 重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后，產(chǎn)生兩條帶：一條為pET-32(a+)質(zhì)粒帶，另外一條約為1 200bp的zot帶(圖2)。初步說明zot基因已插入質(zhì)粒pET-32(a+)載體。

圖1 zot基因擴(kuò)增圖Fig.1 Amplification of zot gene

圖2 重組質(zhì)粒pET-32(a+)-zot雙酶切Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid

2.1.3pET-32(a+)-zot基因測(cè)序 以pET-32(a+)載體測(cè)序通用引物T7：TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG；T7 terminator：TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，采用Blast程序?qū)y(cè)序所得序列與模板序列的zot序列比對(duì)。結(jié)果顯示，各連接點(diǎn)正確，插入序列與模板序列完全相符，命名為：pET-32 a (+)-zot。

2.2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

2.2.1SDS-PAGE分析鑒定誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 取15 ℃、28 ℃、37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜的菌液各1 mL制樣，SDS-PAGE分析結(jié)果(如圖3)顯示15 ℃為最佳表達(dá)溫度。

M: Standard protein marker; 1: Uninduced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2-4: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3); 2: incubated at 15 ℃; 3: incubated at 28 ℃; 4: incubated at 37 ℃圖3 SDS-PAGE 分析zot蛋白于BL21(DE3)表達(dá)情況Fig.3 Expression of zot fusion protein

2.2.2 親和層析柱純化表達(dá)蛋白

2.2.2.1上清通過親和層析純化表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析 全菌采用超聲裂解后，超速離心分離，取上清用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化目標(biāo)蛋白，收集洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示(圖4)：上清中無明顯目標(biāo)蛋白。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: Whole cell bacteria break precipitated by centrifugation; 2: Whole cell supernatants after centrifugation bacteria break; 3: Supernatant and Ni-IDA effluent; 4-8: Eluent with different chromatography column圖4 SDS-PAGE 分析zot蛋白上清純化結(jié)果Fig.4 zot protein purified from supernatant were analyzed by SDS-PAGE

2.2.2.2包涵體通過親和層析純化表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析 取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液用1×PBS洗滌，用Buffer B(8M Urea緩沖液)溶解菌體。超速離心后取上清用親和層析柱(Ni-IDA Resin)純化目標(biāo)蛋白，收集每個(gè)洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示(圖5)：目標(biāo)蛋白能與Ni-IDA很好的結(jié)合，收集Lane3-5復(fù)性。

2.3蛋白濃度測(cè)定 用核酸/蛋白分析儀測(cè)定純化的重組蛋白濃度為0.324 mg/mL。

2.4Western blot分析重組蛋白 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以鼠抗His-tag抗體為一抗，羊抗鼠lg-G/辣根過氧化物酶為二抗進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示在zot重組蛋白預(yù)期大小處 (約48.0kD)有一條明顯的特異性免疫反應(yīng)條帶 (圖6)。

M: SDS-PAGE Protein marker; 1: The supernatant after centrifugation was dissolved 8M urea; 2: 8M urea were dissolved supernatant and Ni-IDA column effluent; 3-5: Eluent with different chromatography column圖5 SDS-PAGE 分析zot蛋白包涵體純化結(jié)果Fig.5 zot protein purified from inclusion bodies were analyzed by SDS-PAGE

M: Prestained protein molecular weight marker; 1: Induced pET-32a(+)-zot/BL21(DE3)圖6 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.6 Western blot analysis of expression products

2.5重組蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用 在培養(yǎng)人小腸上皮細(xì)胞的過程中，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，隨著重組蛋白濃度的增加，人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡率升高(如表1)。

表1 重組表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的作用
Tab.1 The role of recombinant expression protein in human intestinal epithelial cells

蛋白濃度(μg/mL)proteinconcentration(μg/mL)細(xì)胞比例(%)cellproportion(%)正常細(xì)胞normalcells死亡細(xì)胞dyingcells早期凋亡細(xì)胞viableapoptoticcell晚期凋亡細(xì)胞non?viableapoptoticcell1087．600．1211．171．112080．840．9015．522．744076．501．0619．802．648071．081．0324．163．73PBS對(duì)照94．602．122．171．11

3 討 論

霍亂是由O1和O139群霍亂弧菌引起的以急性腹瀉為特征的腸道傳染病，霍亂弧菌主要通過腸毒素致病，霍亂弧菌在通過胃到達(dá)小腸后，粘附于小腸粘膜表面，在腸腔的堿性環(huán)境下迅速繁殖并產(chǎn)生霍亂毒素，毒素作用于小腸粘膜，引起腸液的大量分泌。zot基因存在于霍亂弧菌中對(duì)霍亂的致瀉起輔助作用，該基因由溶源性噬菌體CTXΦ編碼[7]。對(duì)zot亞細(xì)胞定位的研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，zot蛋白定位于霍亂弧菌的細(xì)胞外膜上，為相對(duì)分子質(zhì)量大約為48 kD的一條單肽鏈。Uzzau還推測(cè)，zot的N-末端部分與CTXΦ的形態(tài)形成有關(guān)，而C-末端區(qū)域可能與zot的毒素活性有關(guān)[8-9]。Waldor等[7]認(rèn)為，zot發(fā)生突變時(shí)CTXΦ遺傳因子不能正確自我傳遞，因此推測(cè)zot基因產(chǎn)物為CTXΦ復(fù)制所必需。臨床上也認(rèn)為ctxAB基因與zot基因總是共存，提出zot可能與引起嚴(yán)重腹瀉的霍亂菌株高致病力有密切關(guān)系[10]。

近些年，研究者對(duì)細(xì)菌誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的機(jī)理進(jìn)行了大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡主要與致病菌的毒力因子有關(guān)。細(xì)菌與宿主機(jī)體相互作用的關(guān)系非常復(fù)雜，1992年首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以引起受感染的宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡研究開始涉足細(xì)菌感染領(lǐng)域[11]。目前對(duì)于zot基因研究還有些爭論，zot基因被報(bào)道參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]。以前認(rèn)為zot基因編碼的毒素對(duì)霍亂的致瀉起輔助作用，zot毒力基因與霍亂腸毒素ctxAB能夠激發(fā)完整的細(xì)胞毒性效應(yīng)[13-16]，然而zot毒力基因的毒力機(jī)制以及對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的作用機(jī)制還未見報(bào)道，所以本文構(gòu)建zot原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-zot并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，通過誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化重組蛋白，研究zot表達(dá)蛋白對(duì)人小腸上皮細(xì)胞的凋亡作用。通過本研究發(fā)現(xiàn)zot表達(dá)蛋白能夠引起人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡，隨著蛋白濃度的增大人小腸上皮細(xì)胞的早期凋亡程度也增大，細(xì)胞膜的通透性也增大。利用分子生物學(xué)技術(shù)研究霍亂弧菌zot毒力基因的毒力強(qiáng)弱及細(xì)胞表達(dá)水平，為研究菌株的毒力強(qiáng)弱、致病機(jī)制及引起流行的潛力，以及更深入地研究霍亂弧菌的基因組特征提供依據(jù)，為研發(fā)抗霍亂感染的安全性疫苗提供進(jìn)一步指導(dǎo)，為江西省霍亂的流行趨勢(shì)及防控策略提供科學(xué)依據(jù)。

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CloningandexpressionofzotgeneofVibriocholeraeanditsbiologicalactivity

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qing, WANG Peng, XU Xiao-qian

(DepartmentofInfectiousDiseases，JiangxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The aim of this study is to construct the expression vector ofzotgene ofVibriocholeraeand to realize the expression ofzotgene ofVibriocholeraeinE.coliand study the biological activity of its recombinant expression product. In order to expresszotprotein inE.coli, the full-length open reading frame ofzotwas amplified by PCR from the standard strains ofVibriocholeraeMO45 genome DNA. The PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+) with restriction enaymesBamH I andXhoI. The recombinant vector pET-32a(+)-zotwas transformed intoE.coliBL21 (DE3) and expressed by IPTG induction. Thezotfusion protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting and purified by Ni-NTA affinity chromatography. After expression and purification, the recombinant expression protein played as a target for human small intestinal epithelial cells. Restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing analysis showed that thezotgene of 1 200 bp was amplified fromVibriocholeraeDNA, and the recombinant plasmid pET-32a(+)-zotwas constructed and detected its expression in prokaryotic cell successfully with SDS-PAGE and Western blot techniques. Thezotrecombinant protein was successfully expressed and purified. The purifiedzotrecombinant protein can cause human intestinal epithelial cells apoptosis.

Vibriocholerae;zotgene; cloning and expression; human intestinal epithelial cell

Xu Xiao-qian, Email: xch526@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.009

江西省科技廳項(xiàng)目基金(No.20151BBG70106)

徐曉倩，Email:xch526@163.com

江西省疾病預(yù)防控制中心傳染病所，南昌 330029

R378.3

A

1002-2694(2017)11-0996-06

Supported by the Science and Technology Program of Science and Technology Department of Jiangxi Province(No.20151BBG70106)

2017-02-17編輯梁小潔