極細(xì)鏈格孢激活蛋白對大豆光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及產(chǎn)量的影響

邸 銳，楊春燕

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050035)

大豆(GlycinemaxL.) 是我國主要的糧食與油料作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有不可替代的重要地位[1-2]。河北省常年種植大豆46.7萬～53.3萬hm2，是我國大豆生產(chǎn)大省[3]。因?yàn)榉柿?、農(nóng)藥等投入不足，造成植株抗逆、抗病性差，產(chǎn)量不穩(wěn)定是當(dāng)前影響河北大豆生產(chǎn)的重要因素[4]。如何通過新技術(shù)方法提高大豆植株的抗逆性、增加大豆產(chǎn)量，是河北大豆生產(chǎn)研究的一個重要方面。

植物免疫誘抗劑能夠通過級聯(lián)放大作用調(diào)節(jié)植物的新陳代謝，增強(qiáng)植物抗病和抗逆能力，最終可以達(dá)到作物增產(chǎn)效果，同時可以減少農(nóng)藥的過度使用對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品帶來的污染。真菌激活蛋白(Activator protein)是新型的植物免疫誘抗劑，廣泛存在于真菌孢子和菌絲體中[5]，其代表產(chǎn)品是中國農(nóng)科院邱德文教授研發(fā)的“3%極細(xì)鏈格孢激活蛋白可濕性粉劑”、“普綠通植物免疫蛋白粉劑”等[6]。在蔬菜、糧食作物以及大田經(jīng)濟(jì)作物施用研究表明，激活蛋白不僅能夠通過誘導(dǎo)、激發(fā)、調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的一系列功能蛋白，啟動植物防衛(wèi)反應(yīng)，激活植物的免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力，而且通過調(diào)節(jié)植物生長代謝系統(tǒng)，促進(jìn)植物生長，提高作物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)[6-7]。

有關(guān)激活蛋白對大豆生長發(fā)育研究較少。前人研究分析了激活蛋白處理大豆幼苗后對根系生理、葉片生理影響，證實(shí)了一定濃度的激活蛋白處理可增強(qiáng)大豆幼苗根系活力和硝酸還原酶活性，提高葉片葉綠素含量及可溶性糖、可溶性蛋白的含量[8]。由于光合作用是植物生長的基礎(chǔ)，闡明激活蛋白對植物光合特性的影響具有重要的理論和實(shí)踐意義。然而，有關(guān)激活蛋白對大豆光合特性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響至今尚未見報道。因此，以極細(xì)鏈格孢激活蛋白作為植物免疫誘抗劑，在受控環(huán)境下開展了不同濃度植物激活蛋白對大豆光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及產(chǎn)量的影響，探討激活蛋白在促進(jìn)大豆生長發(fā)育、增加植株產(chǎn)量的生理功能基礎(chǔ)，以期為應(yīng)用激活蛋白實(shí)現(xiàn)大豆增產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理設(shè)置

大豆種子冀豆17由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油所提供，挑選大小一致、形狀飽滿且均勻、無蟲蛀或劣變發(fā)霉的種子，浸泡在80 mmol/L過氧化氫溶液中6 h進(jìn)行表面消毒，取出后用雙蒸水進(jìn)行沖洗，重復(fù)3～5遍[9]。然后將種子播于澆足水裝有清水洗凈后沙子的塑料花盆中，種植密度5苗/盆，然后將花盆移置于溫室中。溫室內(nèi)光源系統(tǒng)是由紅∶白=4∶1的LED提供，植物冠部光強(qiáng)為(500±50)μmol/(m2·s)光照周期為12 h(光)/12 h (暗)，溫度26 ℃(光)/22 ℃(暗)±1 ℃，相對濕度(55±10)%。每2 d每盆澆Hoagland營養(yǎng)液500 mL，EC值和pH值分別為2.0 dS/m和 5.5[10]。

極細(xì)鏈格孢激活蛋白購自北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司。先用蒸餾水將3%激活蛋白可濕性粉劑稀釋成1，2，3，4，5，6 μg/mL 6個濃度。在大豆開花期時，分別用上述6個濃度的激活蛋白溶液噴霧處理，以同齡期噴清水(0 μg/mL的激活蛋白)處理為對照。在處理后的第7天進(jìn)行取樣，同時對大豆進(jìn)行光合特性與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測量。在80 d后收獲大豆，測量不同處理組的總生物量以及大豆產(chǎn)量。

1.2 葉綠素含量測定

采用Arnon法測定葉綠素含量[11]。運(yùn)用紫外分光光度計(SP-752，上海光譜儀器有限公司，中國)將葉綠素丙酮溶液在663，645，440 nm波長下比色，所得的光密度(OD)值代入公式計算浸提液中葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、葉綠素總量(Chla+b)以及類胡蘿卜素(Caro)含量的值。

1.3 光合特性測定

根據(jù)先前的文獻(xiàn)方法[12]，使用便攜式光合儀(LI-6400XT，LI-COR，USA)，環(huán)境 CO2濃度和光照強(qiáng)度均以培養(yǎng)條件設(shè)定為準(zhǔn)，在不同激活蛋白處理后的第7天上午10：00測定大豆第4片真葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)等。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

使用LI-COR便攜式光合作用系統(tǒng)(LI-6400 XRT，LI-COR，USA)測量氣體交換的同時進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y量。所有葉綠素?zé)晒鈪?shù)均使用葉綠素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)葉室(m=2 cm2)完成測定，熒光測量前先將待測葉子暗適應(yīng)30 min。PS Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Optimal photochemical efficiency of PS Ⅱ，F(xiàn)v/Fm)是通過最大可變熒光(Fv)與暗條件下最大熒光(Fm)比值獲得。光系統(tǒng)Ⅱ潛在活性(Potential activity of PS Ⅱ，F(xiàn)v/Fo)是通過最大可變熒光(Fv)與暗條件下最小熒光(Fo)比值獲得。參考前人文獻(xiàn)所述方法計算獲得以下參數(shù)[13]：PS Ⅱ有效量子效率(Effective quantum yield of PS Ⅱ，ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(Photochemistry quenching，qP)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(Nonphotochemistry quenching，NPQ)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)進(jìn)行3次平行測量。9次測量的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作為最終的結(jié)果，運(yùn)用Statistical Product and Service Solutions(SPSS 20.0)軟件分析，全部數(shù)據(jù)采用方差分析(ANOVA)P≤0.05，采用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對大豆光合色素含量的影響

光合作用是植物合成有機(jī)物的重要途徑，葉綠素a和葉綠素b是綠色植物光合作用的主要色素和輔助色素，它們含量高低可以反映植物光合能力的大小[14]。如圖1所示，隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，葉綠素a、b與總量的變化均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而且在3，4 μg/mL的激活蛋白濃度下，其值達(dá)到最大，與對照處理相比，葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素總量分別增加33%～40%，37%～39%和35%～40%。在施用較低濃度(1～2 μg/mL)的激活蛋白時，葉綠素a含量的增幅明顯大于葉綠素b含量(圖1-A、B)，這表明葉綠素a對極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度變化的響應(yīng)比葉綠素b更為敏感。當(dāng)施用極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度達(dá)到了6 μg/mL時，大豆的葉綠素含量迅速下降，極細(xì)鏈格孢激活蛋白對大豆葉綠素a、葉綠素b的含量促進(jìn)效果完全消失(圖1-A、B)。不同濃度的極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理下大豆胡蘿卜素含量變化很小，并不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，圖1-D)。

不同的字母表示不同處理間差異顯著，P<0.05。圖2-4同。Different letters are significantly different at P<0.05.The same as Fig.2-4.

2.2 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對大豆的光合特性影響

圖2表示的是不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理7 d后的大豆葉片光合特性參數(shù)的變化。從圖2-A 可以看出，隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的不斷升高，大豆光合速率(Pn)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。與對照組相比，大豆葉片噴灑極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度為1，2，3，4 μg/mL的 4個處理組，光合速率分別增加了13%，16%，52%，54%，而在使用濃度為5，6 μg/mL的2個處理組光合速率反而下降到對照水平甚至更低。各處理葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)變化與光合速率(Pn)基本相似，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(圖2-B)。施用3，4 μg/mL的極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后大豆氣孔導(dǎo)度達(dá)到最高，比對照分別提高了30%和38%，這說明合適濃度激活蛋白處理(2～4 μg/mL)明顯降低了大豆的葉片氣孔阻力，提高了氣孔導(dǎo)度。不同濃度激活蛋白處理后的大豆葉片胞間CO2濃度(Ci)的變化基本與光合速率(Pn)存在一定程度上相反的現(xiàn)象(圖2-C)。在3，4 μg/mL極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組大豆光合速率達(dá)到最高，其Ci卻顯著降低了14%～20%。從圖2-D 可知，不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉片蒸騰速率(Tr)的變化基本與氣孔導(dǎo)度(Gs)的變化類似，即隨著施用激活蛋白濃度的增加，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，說明了大豆的蒸騰速率變化與氣孔導(dǎo)度有關(guān)。2～4 μg/mL的激活蛋白處理后大豆蒸騰速率有明顯的提高，與對照比分別增加13%，21%和25%。

圖2 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉片凈光合速率(A)、氣孔導(dǎo)度(B)、胞間CO2濃度(C)、蒸騰速率(D)Fig.2 Net photosynthetic rate (A)，stomatal conductance (B)，intercellular CO2 concentration (C) and transpiration rate (D) of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

2.3 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對大豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

PS Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)值越大，說明PS Ⅱ反應(yīng)中心的能量捕捉效率越高[13]。PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPS Ⅱ)值越高越有利于提高葉肉細(xì)胞的光合能力和植物的光合效率，為暗反應(yīng)的碳同化積累更多的能量[15]。如圖3-A、B所示，噴灑極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組，大豆葉片的Fv/Fm和ΦPS Ⅱ值呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，3，4 μg/mL的激活蛋白處理組顯著高于對照組(P<0.05)，其Fv/Fm和ΦPS Ⅱ值分別較對照提高了5.4%，28.0%以及5.6%，32.0%。而噴灑5，6 μg/mL的激活蛋白處理組與對照間不存在顯著性差異(P>0.05)。噴灑1，2 μg/mL激活蛋白處理效果介于3，4 μg/mL處理組與5，6 μg/mL處理組之間。光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)越大表明PS Ⅱ開放的反應(yīng)中心所占比例越大，PSⅡ的電子傳遞活性越高；而非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)越小，表明植物吸收的光能中以非輻射能量耗散越小[16-17]。如圖3-C、D所示，隨著施用極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的提升，qP先升高后下降，而NPQ則是先下降后升高。qP與NPQ在中等濃度(3，4 μg/mL)的激活蛋白處理下分別達(dá)到最大值與最小值，與對照組之間的差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。施用低濃度(1，2 μg/mL)的激活蛋白也能提高qP，降低NPQ，但其效果明顯低于中等濃度的處理組。而施用高濃度(5，6 μg/mL)激活蛋白處理組其qP、NPQ與對照組之間不存在顯著性差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理后的大豆葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fig.3 Chlorophyll fluorescence parameters of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

2.4 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理對大豆產(chǎn)量的影響

如圖4所示，與對照相比，噴施極細(xì)鏈格孢激活蛋白明顯增加了大豆的總生物量與大豆產(chǎn)量(以干質(zhì)量計)。這說明激活蛋白的施用確實(shí)促進(jìn)了大豆的生長，有利于植株茁壯，最終提高了大豆種子的產(chǎn)量。同時也發(fā)現(xiàn)，不同的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度對大豆的增產(chǎn)效果存在差異。與對照相比，大豆施用1～6 μg/mL的激活蛋白處理后的產(chǎn)量分別增加了6.89%，6.03%，11.21%，14.76%，4.83%以及3.43%(圖4-B)。這一結(jié)果也印證了本研究前面有關(guān)噴施極細(xì)鏈格孢激活蛋白對大豆光合特性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響的試驗(yàn)結(jié)果。

圖4 不同濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白處理組的大豆總生物量(A)與產(chǎn)量(B)Fig.4 Total biomass (A) and seed yield (B) of soybean after spraying different concentrations of activator protein from Alternaria tenuissima

3 討論與結(jié)論

隨著極細(xì)鏈格孢激活蛋白施用濃度的增加，大豆的葉綠素含量變化明顯，胡蘿卜素含量并不明顯。先前的研究已經(jīng)證明了施用多效唑、細(xì)胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)劑可以增加葉綠素合成速率，降低葉綠素降解速率，在延緩葉片衰老以及生理功能方面發(fā)揮了重要作用[18-20]。本研究表明，施用具有抗病促生作用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)處理同樣可以有效地提高大豆的葉綠素含量。激活蛋白本身具有生長調(diào)節(jié)的功能，能夠誘導(dǎo)影響細(xì)胞內(nèi)的激素平衡，從而調(diào)節(jié)生長代謝，并在一定程度上延緩葉片的衰老和光合功能衰退，延長葉片的光合功能期[21-22]。這可能是極細(xì)鏈格孢激活蛋白使用后大豆葉綠素提高的原因。武廣衍等[8]的研究表明，與對照組相比，當(dāng)施用2，5 μg/mL激活蛋白處理后大豆幼苗葉綠素含量分別增加了17.32%和5.32%，高濃度的激活蛋白處理反而降低了激活蛋白對葉綠素含量的增加效果。本試驗(yàn)結(jié)果再一次印證了這一觀點(diǎn)：在適當(dāng)濃度條件下，激活蛋白可以提高植物的葉綠素含量，增強(qiáng)其光合作用，濃度過高這種效果將消退。大多的研究結(jié)果表明，胡蘿卜素對外源誘導(dǎo)處理的響應(yīng)敏感程度低于葉綠素[23-25]。因此，大豆胡蘿卜素對激活蛋白低敏感度可能是造成其含量并未發(fā)生明顯變化的原因。

隨著施用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，大豆的光合特性出現(xiàn)了明顯的變化。大豆的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)的變化一致，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而胞間二氧化碳濃度(Ci)則是呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。由此我們可以發(fā)現(xiàn)，一定濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白不僅可以提高葉綠素的含量而且也可以增加葉片Gs，從而促進(jìn)了葉片Pn的上升。先前的研究表明，在有光暗周期下，Tr的上升與增大的Gs緊密相關(guān)，Tr隨氣孔開度增大而線性增加[26]。本研究結(jié)果與先前有關(guān)Tr的變化主要受Gs的控制等結(jié)果一致。當(dāng)Pn提高時，葉肉細(xì)胞固定的CO2增多，從而造成了Ci 降低[27-28]。這種現(xiàn)象表明了施用一定濃度(3～4 μg/mL)激活蛋白對大豆積累有機(jī)物的能力產(chǎn)生了明顯的促進(jìn)作用，為大幅增產(chǎn)奠定了光合生理基礎(chǔ)。然而，隨著激活蛋白濃度的進(jìn)一步提高，則會減弱這種促進(jìn)效應(yīng)。這與先前的研究報道類似：隨激活蛋白濃度的增加，大豆幼苗的根系活力、硝酸還原酶活性、葉綠素含量等各生理指標(biāo)的活性或含量呈先上升后下降的趨勢[8]。但是，具有明顯拋物線式的光合作用調(diào)節(jié)效果背后的機(jī)理仍然需要進(jìn)一步的研究解析。

此外，隨著施用的極細(xì)鏈格孢激活蛋白濃度的增加，最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、有效量子效率(ΦPSⅡ)和光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標(biāo)均呈先上升后下降的趨勢。其中以中濃度(3，4 μg/mL)的處理效果最好，這些結(jié)果表明，施用適當(dāng)濃度極細(xì)鏈格孢激活蛋白為大豆的生長提供了非常好的生長環(huán)境，降低了植株生長的逆境脅迫壓力。這與施用與微生物肥料的效果類似[29]，有利于大豆的茁壯生長，最終提高了大豆種子的產(chǎn)量。

總體上，在開花期，噴灑3，4 μg/mL濃度的極細(xì)鏈格孢激活蛋白能夠顯著地促進(jìn)大豆光合特性與葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)，降低外界環(huán)境對大豆植株的光合生理脅迫，最終提高了大豆的產(chǎn)量，是一種促進(jìn)大豆增產(chǎn)的有效措施。