棉花冠菌素不敏感因子GhCOI1基因分離和對大麗輪枝菌的抗性分析

范 強，王 樂，謝彩玲，張 寧，司懷軍，吳家和

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2. 中國科學院 微生物研究所，植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101)

棉花(Gossypiumspp.)是錦葵科棉屬草本植物，涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和紡織業(yè)，在日常生活中具有重要作用[1]。然而棉花黃萎病(Verticilliumwilt)嚴重制約著棉花的生產(chǎn)，它是一種土壤傳播的維管束病害[2]。黃萎病病原菌為大麗輪枝菌，該真菌屬于半知菌亞門輪枝菌屬。病原菌從棉花根部入侵，植株發(fā)病后會嚴重影響棉花的纖維產(chǎn)量和品質[3]。因此，分離和解析抗病功能基因已成為棉花抗病研究的一個重要方向。

植物毒素冠菌素不敏感因子(Coronatine-insensitive 1， COI1)是茉莉酸(Jasmonate， JA)信號轉導途徑的關鍵調(diào)控因子。在擬南芥中，COI1缺失突變體表現(xiàn)為對各種茉莉酸應答反應不敏感或者不響應，在受到病原菌侵染時不能啟動相應的應答反應[4]。植物中COI1與JAZ結合參與SCFCOI1(Skpl-Cullin-F-box protein， SCF)復合物的形成，這個復合物組成蛋白的缺失突變體，如AXR1、CUL1等都表現(xiàn)為茉莉酸不敏感，從而喪失抗病性[5]。研究表明COI1處于JA信號通路的上游，其功能的喪失會引起JA信號通路的中斷[6]。雖然COI1在擬南芥、煙草等模式植物中的研究比較清楚，但是有關棉花COI1和其在JA信號轉導途徑的研究還未見報道。

本研究從陸地棉中分離一個棉花COI1基因，并利用病毒誘導基因沉默(Virus-induced gene silencing， VIGS)技術從棉花植株沉默該基因表達[7]。對沉默植株接菌研究表明，抑制GhCOI1基因表達會減弱對大麗輪枝菌的抗性?？傊珿hCOI1基因參與了棉花的抗病反應，促進棉花對大麗輪枝菌的抗性。因此，該基因可以作為棉花抗病育種的候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

棉花材料為陸地棉品種中棉所35，由山西農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所資源室提供。所用VIGS系統(tǒng)載體煙草脆裂病毒(TRV)干擾表達載體pYL-156和輔助載體pYL-192由清華大學劉玉樂教授惠贈。陽性對照載體pYL-156-PDS、農(nóng)桿菌GV3101、LBA4404和棉花黃萎病菌菌系 V991(Verticilliumdahliaestrain V991)均由植物基因組學國家重點實驗室保存。

PCR(Polymerase chain reaction)擴增所用試劑和酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、RNA提取試劑盒、逆轉錄cDNA合成試劑盒、pEASY-T1克隆載體試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)細胞等購自北京全式金生物技術有限責任公司，qPCR試劑盒(SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit)購自TaKaRa公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 將中棉所35種植在直徑20 cm花盆里，培養(yǎng)土為富含腐殖質的營養(yǎng)土?；ㄅ璺胖糜?6 h/8 h光照/黑暗、28 ℃的溫室中培養(yǎng)。

1.2.2 棉花RNA提取及cDNA的合成 稱取一定量的棉花樣品，液氮研磨成粉末。用RNA提取試劑盒分離棉花樣品的總RNA。取2 μg總RNA，50 pmol的Anchored Oligo(dT)18用于第1鏈cDNA的合成，具體步驟參照逆轉錄cDNA合成試劑盒說明書進行。獲得的cDNA用于基因克隆及表達分析。

1.2.3GhCOI1克隆和沉默載體構建 為了分離GhCOI1基因，分析棉花基因組序列(http：//cgp.genomics.org.cn)，設計1對特異引物，引物序列為：(F：5′-ATGGGGGAAAATTATAACG-3′，R：5′-TTATAAACTTATACTCCT-3′)。以生長21 d棉花整株cDNA為模板進行PCR擴增，擴增片段被亞克隆到pEASY-T1載體上，然后進行測序鑒定。

為了構建GhCOI1基因的病毒沉默載體，首先利用生物信息學技術分析GhCOI1基因的序列，發(fā)現(xiàn)753～1 025核苷酸序列片段是該基因特異的序列，設計引物(GhCOI1VF：5′-CCGGAATTCCAACGGTGGTTCTTTCTACG-3′，GhCOI1 VR：5′-CGCGGATCCCTTACAACTTCGGGCAACA-3′，下劃線部分為保護堿基及酶切位點)進行PCR擴增，獲得該特異片段。通過EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切擴增產(chǎn)物和pYL-156載體，純化后進行連接反應，轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中得到重組載體[8]。最后將重組載體進行雙酶切和測序驗證，獲得帶有目的基因片段的質粒，命名為pYL-156-GhCOI1。

1.2.4 序列分析及系統(tǒng)進化樹的構建 將GhCOI1與其他物種的COI1蛋白進行同源比對分析(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并用Clustalx 2.1進行多重比對，用MEGA 5.0構建系統(tǒng)進化樹。通過在線Protparam工具(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)將ORF(Open reading frame)翻譯成氨基酸序列，并對其蛋白質進行分析，如等電點、結構域等。

1.2.5 沉默GhCOI1植株的培育 將重組質粒pYL-156-GhCOI1通過電擊的方法導入農(nóng)桿菌GV3101中。電擊完成的農(nóng)桿菌利用含有卡拉霉素(Kan)和利福平(Rif)的固體LB培養(yǎng)基進行劃線培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，挑單克隆在含有Kan(50 μg/mL)和Rif(25 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基再次進行過夜培養(yǎng)。取過夜后的菌液于10 mL離心管中，4 000 r/min離心15 min棄上清液，加入適量重懸液(重懸液成分MgCl210 mmol/L，AS 200 μmol/L，MES 10 mmol/L)重懸菌體，并測OD值調(diào)整到OD600=1.5左右。再分別將含pYL-156-GhCOI1、pYL-156、陽性對照pYL-156-PDS與pYL-192菌液按體積比1∶1 混合，室溫下靜置3 h待用。

溫室中培養(yǎng)的棉花子葉平展時(一般7～10 d)，用針頭在子葉背面輕劃出小傷口，用去掉針頭的1 mL注射器將混合菌液從背面注入子葉中，盡量使整個子葉被侵染。注射后的植株避光處理12 h后，再次置于光照下培養(yǎng)。每個試驗單元進行3次生物學重復。

1.2.6 RT-PCR和qPCR分析 RT-PCR檢測：利用樣品cDNA為模板，采用半定量RT-PCR方法檢測GhCOI1的表達水平。特異引物為F：5′-AGGAGGTTGCTTCTTCAGC-3′，R：5′-CGGATGCTCTACCACGACTA-3′，擴增片段大小為214 bp，選用Actin為內(nèi)參基因來進行半定量。

qPCR檢測方法：將cDNA模板稀釋10倍，反應體系為20 μL，具體步驟參照試劑盒說明書進行，40個循環(huán)后作熔解曲線。設計特異性引物(F：5′-TTACACGACGAGTCCCGAAC-3′，R：5′-GCACCGATTTCAAGCAAGTC-3′)，以Actin為內(nèi)參，獲得的結果采用2-ΔCt或2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量，試驗重復3次。

1.2.7 大麗輪枝菌接種棉花 取出保存于-80 ℃冰箱中的大麗輪枝菌，在冰上溶解后，吸取50 μL孢子液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基[9]。在25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d。用打孔器取出菌絲塊，置于Czapek′s液體培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)7 d(25 ℃，120 r/min)后用雙層醫(yī)用紗布過濾出去菌絲[10]。通過血球計數(shù)板來統(tǒng)計真菌孢子濃度，并用無菌水將濾液調(diào)整到適宜濃度備用。

為了驗證GhCOI1的抗病功能，采用直接注射法進行孢子接種。首先選用1 mL注射器針頭在棉花植株子葉節(jié)以下1 cm處向下輕劃，然后在傷口處滴加3～5 μL已經(jīng)制備好的孢子液，待植株將液滴完全吸入后放置到溫室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如上所述。接菌后觀察植株生長和發(fā)病情況，在21 d后統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)和發(fā)病程度，計算病株率和病情指數(shù)。相同的試驗進行3次重復。

另外，為了分析GhCOI1基因對大麗輪枝菌的應答反應，采用水培接菌法進行試驗。簡單的步驟為：將發(fā)芽好的棉花種子定植到水培培養(yǎng)盒中，水培液中加入1/16 MS培養(yǎng)基無機鹽，培養(yǎng)盒放在溫室中，培養(yǎng)條件如上所述。待棉花苗生長到2片真葉時，將棉花根浸染在上述制備好的大麗輪枝菌孢子液中30 min，然后再轉到水培盒中繼續(xù)培養(yǎng)。然后進行不同時間的根器官取樣，取樣時間為0，3，12，36，48 h，收集根材料用流水洗凈并用滅菌的濾紙將多余水分吸干，放于-80 ℃冰箱中備用。

2 結果與分析

2.1 棉花COI1基因克隆和序列分析

使用植物RNA提取試劑盒分別提取棉花根、莖、葉的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳對不同組織器官的總RNA進行分離，圖1-A顯示這些總RNA包含清晰的28S和18S RNA條帶，表明這些RNA的質量較好，能夠用于后續(xù)的分子研究。根據(jù)棉花基因組數(shù)據(jù)庫(http：//cgp.genomics.org.cn)釋放的GhCOI1基因序列，設計1對特異性引物，以棉花根的cDNA為模板，進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物在凝膠電泳上顯示出2 213 bp大小的目的基因(圖1-B)。利用膠回收試劑盒，將上述擴增產(chǎn)物切膠回收，回收產(chǎn)物進行測序。測序結果表明獲得的目的序列與棉花基因組釋放的GhCOI1序列一致(圖2)。

A.棉花不同組織器官總RNA的電泳圖；B.GhCOI1基因的PCR擴增。-CK.水為陰性對照；M.DNA分子量。A. Isolation of total RNA from cotton root， stem and leaf；B. Detection of GhCOI1 gene by PCR amplification.-CK.H2O used as negative control；M.DNA molecular marker.

通過生物信息學分析，GhCOI1蛋白含有600個氨基酸，分子量大小為68 kDa，其等電點pI為7.06，在多肽的N端含有典型F-box，在C端富含亮氨酸重復序列(Leueine rich repeat， LRR)結構域(圖2)。

在NCBI上選取與GhCOI1直系同源的不同植物進行分析，它們包括TcCOI1、VvCOI1、GmCOI1、PtCOI1、SlCOI1、MtCOI1、AtCOI1。多重序列比對分析表明這些COI1蛋白在氨基酸序列進化組成上差異較小，具有較高的同源性，并都具有典型的F-box和LRR保守區(qū)域(圖3-A)。再將棉花COI1蛋白與上述所選的植物COI1蛋白進行系統(tǒng)進化分析，利用Clustalx 2.1分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)構建系統(tǒng)進化樹。圖3-B顯示GhCOI1和TcCOI1蛋白高度相似，同時從進化的相似程度來看，該蛋白在植物進化中變異速度較慢。

框里氨基酸代表F-box；下劃線氨基酸代表亮氨酸重復序列。

2.2 GhCOI1基因組織器官表達分析

為了分析GhCOI1基因在棉花不同營養(yǎng)器官中的表達情況，利用RT-PCR和qRT-PCR分析棉花GhCOI1在根、莖、葉中的表達水平。以棉花Actin作為內(nèi)參基因來均一化各棉花組織器官的表達量，半定量和定量qPCR分析結果均表明，GhCOI1在陸地棉的根、莖、葉中均有表達，但是在根中優(yōu)勢表達，莖中表達量最低(圖4)。

2.3 大麗輪枝菌對GhCOI1的誘導表達分析

用大麗輪枝菌接種生長2片真葉的棉花，分別提取接種后0，3，12，36，48 h的根，通過qPCR檢測GhCOI1基因的表達情況，以棉花Actin為內(nèi)參基因。結果表明GhCOI1的表達受到病原菌的誘導，表達量隨著誘導時間的增加而上升，在接種病原菌12 h時表達水平達到高峰，此后略有下降(圖5)。結果說明GhCOI1可能參與棉花的抗病反應。

2.4 GhCOI1基因沉默減弱棉花抗病性

選取GhCOI1基因特異核苷酸序列(圖6方框中所示)作為基因沉默的靶序列，這段序列覆蓋A、D亞組的2個拷貝。利用PCR技術克隆了這個片段，然后插入到煙草脆裂病毒TRV載體中，構建了病毒沉默載體pYL-156-GhCOI1(圖6-A)。把pYL-156-GhCOI1和標記載體pYL-156-PDS以及輔助載體pYL-192通過農(nóng)桿菌注射法感染棉花子葉，獲得VIGS棉花植株。感染14 d后，注射標記基因PDS的VIGS植株葉片沿著葉脈呈現(xiàn)白色，隨著時間的延長，葉片失綠加重，直至全白；而注射空載體的陰性對照葉片仍然為綠色(圖6-B)。標記基因的沉默表型表明TRV系統(tǒng)在棉花植株中已經(jīng)成功地進行基因沉默。為了分析VIGS植株中GhCOI1基因的抑制水平，利用RT-PCR和qPCR方法分別分析了沉默植株的表達情況，結果表明，目標基因GhCOI1已經(jīng)被成功地抑制，平均抑制水平在90%以上(圖6-C)。

選擇GhCOI1基因抑制較好的VIGS植株進行大麗輪枝菌接菌處理，分析該基因在棉花抗病中的功能。對鑒定過后的沉默植株進行子葉節(jié)下方注射孢子，接菌處理21 d后進行分析。結果表明，所有接種黃萎病菌的植株均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫并脫落，植物生長狀況較差。相較于對照植株，沉默植株發(fā)病癥狀更加嚴重(圖7-A)。發(fā)病株率和病情指數(shù)(DI)分析表明，GhCOI1基因沉默植株明顯高于對照(圖7-B)，暗示該基因的沉默降低了棉花的抗病能力。

A.不同種植物COI1的氨基酸序列多重比對；B.不同種植物COI1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析；劃線部分為保守結構域F-box和LRR。

圖4 棉花不同組織中GhCOI1的表達情況Fig.4 The relative expression levels of GhCOI1 in different tissues of cotton

圖5 棉花受到大麗輪枝菌侵染后GhCOI1基因在不同時間段的表達情況Fig.5 The relative expression levels of GhCOI1 incourse of time under V.dahliae infection

3 討論

棉花是一種重要的經(jīng)濟作物，其生產(chǎn)的天然纖維是紡織工業(yè)的重要原材料。隨著人們生活質量的日益提高，對棉紡織業(yè)的要求也愈來愈高。因此，提高棉花的產(chǎn)量和質量成為當前棉花生產(chǎn)的主要目標。然而棉花病蟲害的危害嚴重地制約了棉花的生產(chǎn)，尤其棉花黃萎病的危害大大降低了棉花的品質和產(chǎn)量[11]。當前由于棉花缺少黃萎病的抗原，造成棉花抗病育種裹步不前[12]。利用基因工程分子育種技術也是目前改良植物抗病性的一個主要手段，其中最主要的是抗病基因的分離和功能鑒定。在這個研究中筆者分離了一個棉花抗病相關基因COI1，研究報道說明COI1是JA信號途徑中的一個重要成分，參與植物的抗性，包括生物和非生物逆境的抗性。通過VIGS的手段來沉默基因的表達，并對沉默植株進行接菌分析，研究表明，GhCOI1參與了棉花對大麗輪枝菌的抗性。因此，該基因可以作為棉花抗病育種的一個候選基因。

A.沉默載體構建示意圖；B. GhPDS沉默植株的葉片漂白表型；C.GhCOI1基因沉默效果；

A．GhCOI1基因沉默植株的抗病性下降；B.病株率(左圖)和病指(右圖)分析。

研究表明，GhCOI1基因受到大麗輪枝菌浸染的誘導，其表達量隨著浸染時間的延長呈現(xiàn)上調(diào)，結合利用VIGS的反向遺傳學方法確證了GhCOI1正調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性。有研究指出，COI1作為JA分子的一個共受體(Co-receptor)參與SCFCOI1復合體的形成[13]。目前大量研究數(shù)據(jù)表明，JA在植物抗逆反應中發(fā)揮著重要的作用，JA直接調(diào)控防衛(wèi)化學物質的合成與代謝，最終精細調(diào)控植物對病原微生物或逆境的抗性反應[14]。COI1蛋白的抗性功能已在多種植物進行報道，如擬南芥、番茄、煙草、大豆和水稻等[15-21]。本研究在棉花中研究結果也表明GhCOI1也參與棉花黃萎病的抗性反應，進一步確證了COI1是一個JA抗病途徑中主要成分，是植物抗病反應中重要調(diào)控蛋白。

本研究中分離的棉花GhCOI1基因在根器官中優(yōu)勢表達，在莖中表達量較低，并受到大麗輪枝菌浸染的誘導。沉默GhCOI1基因棉花的抗病性減弱，說明該基因編碼的蛋白是棉花抗病反應的一個正調(diào)控因子，可以考慮作為棉花抗病育種的候選基因。然而有關該蛋白過量表達是否能夠提高棉花的抗病性，以及其是否和擬南芥等植物中擁有一樣的抗病機制等問題，有待于進一步的研究和探討。