棉花光合基因GhRCAα啟動(dòng)子的克隆及活性分析

晁毛妮，張志勇，張金寶，溫青玉，郭書(shū)磊，馬亮，王清連

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院， 現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

通過(guò)調(diào)控植物的光合作用來(lái)增加植物的產(chǎn)量，是繼通過(guò)傳統(tǒng)育種技術(shù)、栽培措施及農(nóng)業(yè)實(shí)踐等方法后，實(shí)現(xiàn)植物產(chǎn)量增加的一個(gè)新的重要的方向[1]。在大多數(shù)植物中，卡爾文循環(huán)在植物碳代謝中占據(jù)重要位置，調(diào)控這個(gè)途徑對(duì)于提高植物的光合效率和產(chǎn)量意義重大。

Rubisco作為卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，不僅可以催化2個(gè)具有競(jìng)爭(zhēng)性的反應(yīng)，同時(shí)它也是一個(gè)具有較低周轉(zhuǎn)次數(shù)的低效酶，它的有效活化需要Rubisco活化酶(RCA)的參與[2]。因此，對(duì)RCA基因的研究已成為近年來(lái)提高植物產(chǎn)量的一個(gè)新的重要目標(biāo)。通過(guò)調(diào)控RCA基因的表達(dá)來(lái)增加Rubisco的活性，在改善植物光合效率和提高植物產(chǎn)量方面具有很大的潛力[3-4]。許多研究發(fā)現(xiàn)，RCA基因的表達(dá)受光、植物激素、組織特異性及晝夜模式的調(diào)控[5-8]。與RCA基因具有組織特異性和受光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄模式一致，菠菜[9]、擬南芥[10]、馬鈴薯[11]和水稻[12]的RCA基因啟動(dòng)子在高等植物的綠色組織及光誘導(dǎo)下具有活性。RCA基因啟動(dòng)子的光誘導(dǎo)和組織特異性在應(yīng)對(duì)葉食害蟲(chóng)或葉片抗病植物基因工程方面具有特定的優(yōu)勢(shì)。例如，在馬鈴薯基因工程方面，馬鈴薯的RCA基因啟動(dòng)子可用于表達(dá)只在植物綠色組織表達(dá)的防御基因來(lái)特異性的防御白粉病或者蚜蟲(chóng)[11]。因此，研究植物RCA基因的啟動(dòng)子，不僅有助于了解該基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制，而且對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有重要意義。

啟動(dòng)子是影響基因表達(dá)效率的重要因子，其順式作用元件決定了基因的表達(dá)量及表達(dá)模式[13]。啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件可以響應(yīng)光、植物激素、逆境脅迫和生物鐘等，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行順式作用元件分析，有助于了解下游基因的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)制。棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。目前，關(guān)于棉花RCA基因的研究主要集中在結(jié)構(gòu)、活性和熱脅迫條件下的蛋白表達(dá)等方面[14-15]，關(guān)于其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制研究很少。為此，本研究利用棉花基因組測(cè)序結(jié)果，以陸地棉品種百棉1號(hào)為材料，通過(guò)PCR方法從基因組中擴(kuò)增GhRCAα啟動(dòng)子序列，并利用PlantCARE對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析。同時(shí)為了驗(yàn)證該啟動(dòng)子的功能，利用熒光定量PCR技術(shù)研究了該基因的表達(dá)特性，并通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)的方法進(jìn)一步研究其活性。旨在摸清RCA表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，從而為提高棉花光合速率和產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

用于GhRCAα啟動(dòng)子克隆或組織表達(dá)模式分析的材料為陸地棉品種百棉1號(hào)，該材料由河南科技學(xué)院棉花研究所提供，于2015年4月20日種植于河南科技學(xué)院?jiǎn)讨x試驗(yàn)田。在幼苗期，當(dāng)?shù)?復(fù)葉完全展開(kāi)時(shí)，取完全展開(kāi)葉并立即速凍于液氮中，用于基因組DNA的提取。在盛花期取棉花植株的根、莖、葉和花(花瓣和萼片)及初鈴期的鈴殼和纖維用于棉花GhRCAα的組織表達(dá)模式分析。

1.2 DNA的提取及GhRCAα啟動(dòng)子的擴(kuò)增

使用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN， China， DP321)提取百棉1號(hào)葉片DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行GhRCAα啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增。引物序列為：GhRCAα-Promoter-F：5′- TCAGGGTATCTTCAGGGGTA-3；GhRCAα-Promoter-R：5′-GTCCTTTTCGGTCTGTGTCT-3′。

GhRCAα啟動(dòng)子擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系，包括：10 μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer (Mg2+plus)，4.0 μL 2.5 mmol/LdNTPs，1.5 μL 10 mmol/L正反向引物，1 μL 1.2 U/μL PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa， Japan)，4.0 μL DNA模板及28.0 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 20 s， 61 ℃ 2.5 min， 共35個(gè)循環(huán)；最后4 ℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，根據(jù)比對(duì)Marker條帶，鑒定為目的基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Axygen， China， AP-GX-4)純化后送深圳華大公司測(cè)序。

1.3 序列分析

利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools /plantcare/html/)[16]在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析所克隆序列的順式作用元件。

1.4 RNA 的提取和cDNA的合成

使用RNA提取試劑盒(BioFLUX， BSC65S1B)，對(duì)所取樣品進(jìn)行總RNA提取。再用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量，而后RNA儲(chǔ)存于- 80 ℃?zhèn)溆?。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)約2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA采用棉花內(nèi)參基因Actin檢測(cè)質(zhì)量，并保存于-20 ℃。

1.5 基因表達(dá)量測(cè)定

以反轉(zhuǎn)錄得到的各組織cDNA為模板，以棉花Actin基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR分析。棉花GhRCAα和Actin基因的特異性熒光定量PCR引物分別為：QGhRCAα-F：5′-AGCCGCCGACATAATCAAAAAG-3′； QGhRCAα-R：5′-ACGGATGAGAGGAGCATACA GT-3′； QActin-F：5′-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′； QActin-R：5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′。

熒光定量PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：2 × SYBR Premix ExTaq(TaKaRa) 10 μL，正反引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-rad Chromo4熒光定量PCR儀上運(yùn)行，擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

已克隆的2 000 bp啟動(dòng)子片段通過(guò)載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和PstⅠ)連入含有GUS報(bào)告基因的雙元載體pCAMBIA1381Z(Cambia， Australia)中。構(gòu)建好的雙元載體(GhRCAα∷GUS)以及載體pCAMBIA1301(陽(yáng)性對(duì)照：CaMV35S∷GUS)和pCAMBIA1381Z(陰性對(duì)照：無(wú)啟動(dòng)子)分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

1.7 組織化學(xué)染色

GUS活性檢測(cè)參照J(rèn)efferson等[17]的方法并略加修改。取待檢測(cè)的植物組織，加入GUS染色液，37 ℃溫育過(guò)夜24 h。接著，用體積分?jǐn)?shù)為70%，80%，90%，100%的乙醇系列進(jìn)行脫色。最后，在體式顯微鏡下觀察組織的染色情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhRCAα啟動(dòng)子的克隆

以已克隆出的陸地棉GhRCAαcDNA序列(GenBank 登錄號(hào)：AF329935)為查詢(xún)序列BlastN陸地棉全基因組[18]，得到起始密碼子ATG上游2 000 bp調(diào)控序列，然后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，在百棉1號(hào)DNA(圖1-A)中擴(kuò)增GhRCAα啟動(dòng)子。GhRCAα的理論大小為2 309 bp，所得片段電泳結(jié)果顯示，與預(yù)期的片段大小相符(圖1-B)。經(jīng)Blast比對(duì)確認(rèn)，該片段為GhRCAα啟動(dòng)子序列。

2.2 GhRCAα啟動(dòng)子的序列分析

將分離獲得的棉花GhRCAαATG上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列提交到啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站plantCARE在線(xiàn)分析啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件組成。結(jié)果表明，許多重要的順式作用元件，包括TATA-box、 HSE、 G-box、5UTR Py-rich和ciradian等特異地存在于GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)(圖2)，且不同順式作用元件的拷貝數(shù)也存在很大差異(表1)。進(jìn)一步分析表明，這些順式作用元件主要分為以下6類(lèi)(表1)。第1類(lèi)是光響應(yīng)元件，包括G-box、I-box和GT1-motif等可能參與GhRCAα光調(diào)控的順式作用元件；第2類(lèi)是生物鐘調(diào)控元件ciradian，該元件可能參與GhRCAα的晝夜表達(dá)模式調(diào)控；第3類(lèi)是與植物激素響應(yīng)有關(guān)的GARE-motif和ABRE元件，表明GhRCAa的表達(dá)可能受植物激素的調(diào)節(jié)；第4類(lèi)是與逆境響應(yīng)有關(guān)的元件，包括響應(yīng)干旱脅迫的MBS元件，熱激響應(yīng)元件HSE等；第5類(lèi)是基礎(chǔ)表達(dá)相關(guān)的元件，包括CAAT-box (與增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率有關(guān))和TATA-box等，說(shuō)明GhRCAα啟動(dòng)子是一個(gè)典型的由RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合的啟動(dòng)子；第6類(lèi)是包括CGTCA-motif、TGACG-motif、as1、Skn-1_motif以及CAT-box等其他類(lèi)順式作用元件，其中as1具有參與根特異性表達(dá)的功能，CGTCA-motif和TGACG-motif具有參與茉莉酸響應(yīng)的功能。以上這些結(jié)果表明GhRCAα的表達(dá)可能受光、生物鐘、逆境及植物激素等的調(diào)控。

2.3 GhRCAα表達(dá)模式的分析

由于GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)包含許多響應(yīng)光、特定組織或生物鐘的順式作用元件，為了摸清這些元件的存在對(duì)GhRCAα表達(dá)有何影響，采用熒光定量PCR方法來(lái)研究GhRCAα在棉花不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：GhRCAα在葉片中大量表達(dá)，而葉片是光合作用進(jìn)行的主要位置，在纖維、莖、萼片、根、花瓣和鈴殼中表達(dá)量很低(圖3)。先前對(duì)棉花GhRCAα進(jìn)行晝夜表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，GhRCAα基因的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性，在光周期開(kāi)始后1 h表達(dá)量最高，午夜表達(dá)量最低[15]。這些結(jié)果表明，GhRCAα的表達(dá)具有組織特異性且受晝夜模式的影響。該結(jié)果與啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析結(jié)果相一致。

圖1 棉花基因組DNA的提取(A)及GhRCAα啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增(B)Fig. 1 The extraction of genomic DNA (A) and the PCR amplification (B) of GhRCAα promoter in cotton

ATG上游的2 000 bp片段定義為啟動(dòng)子區(qū)域，部分預(yù)測(cè)的順式作用元件在圖中用灰色陰影表示；

表1 GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)包含的順式作用元件Tab.1 Cis-acting elements in promoter of GhRCAα

表1(續(xù))

圖3 棉花 GhRCAα的組織特異性表達(dá)分析Fig. 3 Analysis of organ-specific expression of GhRCAα in cotton

2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及活性分析

將克隆的2 000 bp的片段，用雙酶切法連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1條約為2 000 bp的特異性條帶(圖4)，與預(yù)期片段一致，表明已成功構(gòu)建了由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體(GhRCAα∷GUS)。

圖4 表達(dá)載體GhRCAα∷GUS 的酶切分析Fig.4 Restriction analysis of GhRCAα∷GUS vector

將重組表達(dá)載體(GhRCAα∷GUS)、pCAMBIA1301(陽(yáng)性對(duì)照，CaMV35S∷GUS)以及pCAMBIA1381Z(陰性對(duì)照)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照CaMV35S 啟動(dòng)子(圖5-A)以及重組載體GhRCAα∷GUS(圖5-B)轉(zhuǎn)化的煙草葉片均能檢測(cè)到GUS的表達(dá)產(chǎn)物，但是與陽(yáng)性對(duì)照(CaMV35S 啟動(dòng)子)相比，目的載體染色弱于陽(yáng)性對(duì)照，表明其活性比CaMV35S啟動(dòng)子低；pCAMBIA1381Z 載體沒(méi)有啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)，所以檢測(cè)不到GUS表達(dá)(圖5-C)。這些結(jié)果表明，本研究克隆的GhRCAα啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)下游基因GUS的表達(dá)，具有驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)的活性。

A.35S啟動(dòng)子； B.GhRCAα啟動(dòng)子；C.不含啟動(dòng)子的對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

啟動(dòng)子是決定外源基因在受體植物中轉(zhuǎn)錄效率高低的關(guān)鍵因子，合適的啟動(dòng)子將會(huì)促進(jìn)外源基因的高效表達(dá)[19]。組成型啟動(dòng)子能使外源基因在受體植物中高效、持續(xù)的表達(dá)，但在特定時(shí)間或特定組織部位的表達(dá)達(dá)不到預(yù)期效果[20]。因此，誘導(dǎo)型或特異型啟動(dòng)子的研究越來(lái)越受到廣大研究者們的青睞，發(fā)掘一種組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物育種具有重要意義[21-23]。RCA基因作為光合作用過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，其表達(dá)除了受光誘導(dǎo)和晝夜模式的影響以外，還具有組織特異性，且受發(fā)育時(shí)期和植物激素的影響[5-8]。與其表達(dá)模式相一致，RCA啟動(dòng)子在高等植物的綠色組織及光誘導(dǎo)下具有活性，可作為一種組織特異型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[9-11]。因此，克隆植物RCA基因的啟動(dòng)子，明確其組織特異性表達(dá)，可為轉(zhuǎn)基因育種提供一種組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

近年來(lái)，關(guān)于棉花RCA基因啟動(dòng)子的克隆及功能研究很少，而關(guān)于RCA的結(jié)構(gòu)、活性和蛋白表達(dá)已開(kāi)展很多研究[14-15，24]。本研究對(duì)棉花GhRCAα啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及順式作用元件分析表明，GhRCAα啟動(dòng)子除了具有基本的調(diào)控元件，還包含許多與光、生物鐘、植物激素以及逆境響應(yīng)有關(guān)的調(diào)控元件，這些元件特異地存在于GhRCAα啟動(dòng)區(qū)，并在拷貝數(shù)上存在很大差異。已有報(bào)道表明，啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的強(qiáng)度主要依賴(lài)于順式作用元件的拷貝數(shù)，更具體的來(lái)說(shuō)就是順式作用元件相對(duì)于TATA-box的間距[25-26]。對(duì)大豆的RCA研究表明，重要啟動(dòng)子元件如G-box和pyrimidine-rich 5′-UTR在拷貝數(shù)目上的差異可能是導(dǎo)致GmRCAα和GmRCAβ表達(dá)量差異的一個(gè)原因[3]。棉花中GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)這些重要順式調(diào)控元件拷貝數(shù)變異可能參與了調(diào)控下游基因GhRCAα表達(dá)的強(qiáng)度及模式，但是關(guān)于其影響GhRCAα表達(dá)的分子機(jī)制還不清楚，在今后的研究中仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利用熒光定量PCR對(duì)GhRCAα表達(dá)特性進(jìn)行分析表明，GhRCAα在棉花的不同組織表達(dá)量存在很大差異，在光合作用進(jìn)行的主要位置葉片中表達(dá)量最高，其他組織表達(dá)量很低，其表達(dá)具有組織特異性。與此相一致的是大量光響應(yīng)元件(G-box、ACE及I-box等)，組織特異表達(dá)元件(as1等)特異地存在于GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)。已有研究表明，植物的組織特異性表達(dá)可能是來(lái)源于根特異性表達(dá)元件的負(fù)調(diào)控，也可能是來(lái)源于葉特異性表達(dá)元件的正調(diào)控[10，27-28]。GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)根特異性表達(dá)元件as1的存在可能是作為一個(gè)負(fù)調(diào)控元件參與組織特異性表達(dá)，但仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，光不但作為一種重要的信號(hào)來(lái)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，而且還直接參與光合作用[29]。GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)光響應(yīng)元件的大量存在可能參與GhRCAα的光調(diào)控及光合組織葉片中GhRCAα的大量表達(dá)。另外，晝夜節(jié)律響應(yīng)元件circadian及同時(shí)參與生物鐘及光響應(yīng)的調(diào)控元件I-box[30-32]均存在于GhRCAα的啟動(dòng)子區(qū)，說(shuō)明其表達(dá)可能受到光周期的調(diào)節(jié)，這與先前報(bào)道的GhRCAα的表達(dá)具有晝夜節(jié)律性的結(jié)果相一致[15]。對(duì)棉花[15]、水稻[33]和菠菜[34]的RCA研究表明，45 kDa(RCAα)亞型可能在光合機(jī)構(gòu)適應(yīng)體外中度熱脅迫方面起著重要作用，熱激響應(yīng)元件HSE特異存在于GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)可能賦予該基因在熱脅迫條件維持下Rubisco活性方面的重要作用。總的來(lái)說(shuō)，與其他物種一樣[5-8]，棉花的GhRCAα表達(dá)具有組織特異性，且可能受熱脅迫和晝夜模式的影響，該基因啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)調(diào)控元件的存在可能決定了該基因的表達(dá)特性。然而，GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)哪些核心元件參與調(diào)控GhRCAα的表達(dá)仍不清楚。大量逆境響應(yīng)元件及植物激素響應(yīng)元件存在GhRCAα啟動(dòng)子區(qū)是否意味著該基因在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫方面也具有重要作用，在今后的研究中，通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)的缺失試驗(yàn)分析、定點(diǎn)突變及逆境條件下基因表達(dá)特性研究，將有助于了解GhRCAα啟動(dòng)子調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的分子機(jī)制。

本研究克隆獲得的GhRCAα啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，表明該啟動(dòng)子片段具有驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因表達(dá)的活性，因此，有望用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而更好地調(diào)控重要基因的特異性表達(dá)。本研究結(jié)果不僅有助于進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)棉花GhRCAα基因功能及其表達(dá)調(diào)控規(guī)律，也可為植物遺傳轉(zhuǎn)化提供一種組織特異型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。