水稻堊白基因Chalk5功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

朱金燕， 王晴晴， 王 軍， 范方軍，李文奇，王芳權(quán)，王緒鵬，仲維功，楊 杰

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，國家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；4.揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

水稻是我國重要的糧食作物，種植面積和總產(chǎn)都位居第一。隨著人們生活水平的提高，消費者對稻米品質(zhì)需求越來越高。稻米品質(zhì)主要包括加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，具體內(nèi)容有：透明度、堊白、粒型、直鏈淀粉含量、膠稠度、糊化溫度、蛋白質(zhì)含量以及有無香味等。其中外觀品質(zhì)尤為重要，是水稻商品性的直接體現(xiàn)，決定了其在市場競爭中的地位[1-6]。堊白是衡量水稻外觀品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，降低稻米的堊白是培育優(yōu)質(zhì)水稻品種的前提。

稻米堊白是指胚乳充實不足，胚乳中的淀粉和蛋白顆粒排列疏松，顆粒與顆粒之間存在空氣，陽光透過其內(nèi)部時光線發(fā)生折射而形成的一種光學(xué)特性[7-10]。根據(jù)其發(fā)生部位的不同可分為背白、腹白和心白[11-13]。水稻種子灌漿的順序是從背部到腹部、從周邊到中心[14]，因此，水稻堊白中出現(xiàn)最多的是腹白，背白最少。相關(guān)研究表明，堊白與其他品質(zhì)性狀存在一定的相關(guān)性。在外觀品質(zhì)中，李欣等[15]認(rèn)為秈稻稻米堊白與粒寬存在極顯著的正相關(guān)性，與長寬比存在極顯著的負(fù)相關(guān)性，而粳稻稻米的堊白面積與粒型、粒長沒有明顯的相關(guān)性。在加工品質(zhì)上面，徐富賢等[16]認(rèn)為堊白與整精米率呈顯著負(fù)相關(guān)。在秈稻的蒸煮食味品質(zhì)中，周少川等[17]認(rèn)為在秈稻中稻米堊白與直鏈淀粉含量和糊化溫度存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，與膠稠度存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而在粳稻中，這些相關(guān)性不顯著。這一結(jié)論與劉奇華等[18]的研究結(jié)果一致。

堊白是典型的數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，以加性效應(yīng)為主，同時也容易受到環(huán)境的影響，如溫度、肥力水平等[19]。因此，對堊白性狀的遺傳研究比較困難。不同的研究者利用不同的遺傳群體對堊白性狀進(jìn)行了大量的研究，鑒定了部分相關(guān)QTL。到目前為止共定位到85個與堊白相關(guān)的QTL( http：//archive.gramene.org /qtl /)，其中有13個與堊白大小有關(guān)，21個與堊白度相關(guān)的，51個控制堊白率，但多數(shù)研究尚停留在QTL初步和精細(xì)定位的層面上[20-24]。目前已克隆的與堊白相關(guān)的基因共8個，其中6個是通過T-DNA 插入、輻射誘變、化學(xué)誘變等方式創(chuàng)制人工突變體而分離克隆的，2個是利用自然突變的材料克隆的，前者的優(yōu)點是能創(chuàng)造極端表型，等位基因效應(yīng)大，較易分離克隆，但是限制了其在育種實踐中的直接應(yīng)用。GW2是第一個利用自然變異克隆的堊白相關(guān)基因，位于第2染色體上，編碼一個E3泛素連接酶，它使籽粒變寬和粒重增加的同時籽粒的堊白也增加，可能是由于粒寬增大，籽粒灌漿速度加快，從而導(dǎo)致堊白的產(chǎn)生[25]。Chalk5是最近克隆的一個控制水稻堊白的主效QTL，該基因編碼一種液泡上的有無機(jī)焦磷酸水解作用和H+轉(zhuǎn)運(yùn)作用的焦磷酸轉(zhuǎn)移酶[26]。過量表達(dá)Chalk5能夠使胚乳的堊白增加，可能是干擾了種子發(fā)育過程中膜運(yùn)輸系統(tǒng)的pH穩(wěn)態(tài)，從而影響蛋白體的生物合成，使小囊泡結(jié)構(gòu)大量增加，因此,在胚乳的貯藏部位形成堊白。與低堊白品種H94等位基因序列比較，高堊白品種珍汕97等位基因序列發(fā)生39處多態(tài)性變異，其中10處變異發(fā)生在翻譯起始位點上游1.8 kb的啟動子區(qū)域，包括替換、插入和缺失3種變異類型。5處變異發(fā)生在外顯子區(qū)域，但僅在第1個和第4個外顯子上發(fā)生2個氨基酸替換，內(nèi)含子區(qū)域有24處SNP變異。對該基因進(jìn)行功能性遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，在珍汕97啟動子-721和-485位的2個SNPs變異導(dǎo)致其與種子發(fā)育相關(guān)的2個順式調(diào)控元件在H94啟動子中發(fā)生了變異，位于-721位的是調(diào)控種子特異表達(dá)和ABA相應(yīng)的RY/G-box[27-28]，位于-485位的是調(diào)控種子發(fā)育過程中光合產(chǎn)物運(yùn)輸和代謝的CACT-box[29-31]。研究結(jié)果表明，這2個突變位點上與珍汕97具有相同等位基因型的Chalk5的表達(dá)量較高，與同一時期的珍汕97表達(dá)量相近，任意一個位點發(fā)生突變，Chalk5的表達(dá)量降低，與同一時期的H94表達(dá)量相近。堊白是典型的數(shù)量性狀，容易受到環(huán)境的影響，且其表型是在成熟收獲后才能進(jìn)行選擇，因此，獲得Chalk5的功能標(biāo)記能快速、準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)基因的不同基因型，是開展Chalk5基因分子標(biāo)記輔助選擇的重要前提。

本研究根據(jù)這2個功能突變位點，每個位點分別開發(fā)了3對等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物，經(jīng)過梯度PCR篩選，每個位點均得到1對能高效特異擴(kuò)增的引物，Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。通過PCR產(chǎn)物測序的方法對這2對標(biāo)記的檢測結(jié)果進(jìn)行了驗證，并利用該標(biāo)記對不同地區(qū)的秈稻材料、江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種以及太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行了Chalk5基因型檢測，快速準(zhǔn)確地明確了該基因在這些品種和資源中的分布情況。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試水稻材料包括江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種65份；不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系30份，常規(guī)秈稻品種10份，秈稻保持系3份；太湖流域粳稻地方資源179份。以含有Chalk5基因的9311和含有chalk5基因的Basmati作為對照。

1.2 Chalk5基因功能標(biāo)記的設(shè)計與合成

在GenBank中(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索高堊白率顯性等位基因Chalk5和低堊白率隱性等位基因chalk5的序列，來源于珍汕97的顯性等位基因Chalk5的登錄號為KJ363317.1，來源于H94的隱性等位基因chalk5的登錄號為KJ363318.1。經(jīng)過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，與前人的研究結(jié)果一致[26]，在起始密碼子前第721位堿基由C突變?yōu)門，在起始密碼子前第485位堿基由A突變?yōu)門，且這2個突變位點為功能突變，根據(jù)這2個功能突變位點以及基因序列，參照Ye等[32]的方法用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物，為了增強(qiáng)引物的特異性，第721位突變位點的后引在3′端引入一個人為錯配，第485位突變位點的前引在3′端引入一個人為錯配。由于尚不清楚哪一種堿基的錯配能夠在不影響擴(kuò)增效率的前提下提高擴(kuò)增特異性，因此，每個位點分別設(shè)計3種堿基錯配方式，前引與后引配對，每個位點共6對引物以供篩選，引物具體序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

引物由Invitrogen公司合成，將合成的引物用TE緩沖液(pH值8.0)稀釋為10 mol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Chalk5基因功能區(qū)段的測序和序列比對

為了進(jìn)一步驗證該功能標(biāo)記的準(zhǔn)確性以及明確常規(guī)粳稻和秈稻品種中目標(biāo)基因的等位基因型，利用引物C1F和C2R分別為前引和后引組合配對，擴(kuò)增目標(biāo)基因功能區(qū)段，產(chǎn)物清晰，大小為846 bp，對其中9份品種的目標(biāo)基因功能區(qū)段進(jìn)行了測序。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、純化、檢測后送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，拼接后的序列與登錄的chalk5進(jìn)行比對。

1.4 DNA提取

在水稻分蘗盛期取新鮮幼嫩的葉片，采用SDS法提取水稻基因組DNA[33]。

1.5 PCR擴(kuò)增和電泳

20 μL的反應(yīng)體系包括：模板DNA(約15 ng/μL)2 μL，引物(4 pmol/μL)2 μL，10×緩沖液(25 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，滅菌雙蒸水12.2 μL。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min，共32個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。其中在梯度反應(yīng)中將退火溫度設(shè)置為53～63 ℃。反應(yīng)產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，DuRed染色，然后在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 Chalk5基因序列的分析和功能標(biāo)記的開發(fā)

對珍汕97中包含的高堊白率顯性等位基因Chalk5和H94的低堊白率隱性等位基因chalk5的序列進(jìn)行比對分析，在起始密碼子前第721位堿基由C突變?yōu)門，在起始密碼子前第485位堿基由A突變?yōu)門，且這2個突變位點為功能突變，根據(jù)這2個功能突變位點以及基因序列設(shè)計等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物，為了增強(qiáng)引物的特異性，第721位突變位點的后引在3′端引入一個人為錯配，第485位突變位點的前引在3′端引入一個人為錯配。由于尚不清楚哪一種堿基的錯配能夠在不影響擴(kuò)增效率的前提下提高擴(kuò)增特異性，因此，每個位點分別設(shè)計3種堿基錯配方式，前引與后引配對，每個位點共6對引物，引物具體序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

將C1F與C1R1配對的引物命名為Chalk11，C1F與NC1R1配對的引物命名為NChalk11，C1F與C1R2配對的引物命名為Chalk12，C1F與NC1R2配對的引物命名為NChalk12，C1F與C1R3配對的引物命名為Chalk13，C1F與NC1R2配對的引物命名為NChalk13；將C2F1與C2R配對的引物命名為Chalk21，NC2F1與C2R配對的引物命名為NChalk21，C2F2與C2R配對的引物命名為Chalk22，NC2F2與C2R配對的引物命名為NChalk22，C2F3與C2R配對的引物命名為Chalk23，NC2F3與C2R配對的引物命名為NChalk23。

對與珍汕97具有相同等位基因型(高堊白率顯性等位基因Chalk5)的水稻品種，引物Chalk11、Chalk12、Chalk13和Chalk21、Chalk22 、Chalk23分別能擴(kuò)增出197，450 bp的片段，而引物NChalk11、NChalk12、NChalk13和NChalk21、NChalk22、NChalk23則無擴(kuò)增產(chǎn)物；對與H94具有相同等位基因型(低堊白率隱性等位基因chalk5)的水稻品種，引物NChalk11、NChalk12、NChalk13和NChalk21、NChalk22、NChalk23分別能擴(kuò)增出197，450 bp的片段，而引物Chalk11、Chalk12、Chalk13和Chalk21、Chalk22、Chalk23則無擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 基于顯性隱性等位基因序列單堿基功能突變位點設(shè)計的ARMS-PCR標(biāo)記Tab.1 ARMS-PCR primers designed in this paper

2.2 Chalk5基因功能標(biāo)記的篩選

對這12對引物進(jìn)行梯度篩選，梯度反應(yīng)過程中退火溫度為53～63 ℃，分別為53.0，53.2，53.8，54.7，55.8，57.1，58.4，59.7，60.9，61.9，62.6，62.9 ℃。根據(jù)前人的研究結(jié)果，DNA模板選用與珍汕97具有相同等位基因型的常規(guī)秈稻品種9311和與H94具有相同等位基因型的秈稻恢復(fù)系明恢63，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖電泳分析。

如圖1所示，以9311為模板，引物Chalk11、Chalk12、Chalk13能擴(kuò)增出197 bp的片段，對應(yīng)引物NChalk11、NChalk12、NChalk13無擴(kuò)增產(chǎn)物；以明恢63為模板，引物Chalk11、Chalk12、Chalk13無擴(kuò)增產(chǎn)物，對應(yīng)引物NChalk11、NChalk12、NChalk13能擴(kuò)增出197 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致。同時，從圖1中可以看出第2個引物對Chalk12與NChalk12在退火溫度為59.7 ℃條件下的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性最好，因此，選用等位基因特異PCR引物Chalk12與NChalk12作為第一個功能突變位點的篩選標(biāo)記，可用于目標(biāo)基因等位基因型的快速檢測。

M. DL2000；A. 引物Chalk11、NChalk11擴(kuò)增結(jié)果；B. 引物Chalk12、NChalk12擴(kuò)增結(jié)果；C. 引物Chalk13、NChalk13擴(kuò)增結(jié)果。

如圖2所示，以9311為模板，引物Chalk21、Chalk22、Chalk23能擴(kuò)增出450 bp的片段，對應(yīng)引物NChalk21、NChalk22、NChalk23無擴(kuò)增產(chǎn)物；以明恢63為模板，引物Chalk21、Chalk22、Chalk23無擴(kuò)增產(chǎn)物，對應(yīng)引物NChalk21、NChalk22、NChalk23能擴(kuò)增出450 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果完全一致。同時，從圖2中可以看出第2個引物對Chalk22與NChalk22在退火溫度為60.9 ℃條件下的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性最好，因此，選用等位基因特異PCR引物Chalk22與NChalk22作為第2個功能突變位點的篩選標(biāo)記，可用于目標(biāo)基因等位基因型的快速檢測。

2.3 Chalk5基因功能標(biāo)記的驗證

為了進(jìn)一步驗證等位基因特異PCR引物Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22對不同水稻品種包含的等位基因型檢測的準(zhǔn)確性，將引物C1F、C2R配對命名為ChalkCX，用于功能目標(biāo)片段的測序分析，該引物能擴(kuò)增出846 bp的目標(biāo)片段，包含了上述2個功能突變位點。

利用引物ChalkCX對7個水稻品種9311、明恢63、日本晴、連粳4號、淮稻11號、華粳6號和鹽粳11號進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。如圖3所示，與對照珍汕97和H94進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，9311、日本晴、連粳4號、淮稻11號、華粳6號和鹽粳11號在2個功能突變位點的等位基因型與珍汕97一致，而明恢63在2個功能突變位點的等位基因型與H94一致，測序分析結(jié)果與等位基因特異PCR檢測的結(jié)果完全一致，因此，利用Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22中的任何一對引物均可以準(zhǔn)確地鑒定出水稻品種中包含的Chalk5的不同等位基因型(圖3)。

M. DL2000；A. 引物Chalk21、NChalk21擴(kuò)增結(jié)果；B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增結(jié)果；C. 引物Chalk23、NChalk23擴(kuò)增結(jié)果。

圖3 部分粳稻和秈稻品種Chalk5位點功能區(qū)的測序比對結(jié)果Fig.3 Sequence alignment of Chalk5 functional domain for partial rice varieties

2.4 ARMS-PCR標(biāo)記對部分秈稻材料、江蘇省粳稻品種和太湖流域粳稻地方資源的檢測

利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對43份秈稻材料進(jìn)行檢測，其中有30份不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系、10份常規(guī)秈稻品種以及3份秈稻保持系，2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。其中，南京14號、圭630、蘇農(nóng)3037、明恢78等20份材料表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型，其余23份材料表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型。這些含有chalk5低堊白率等位基因水稻材料在育種中可以作為優(yōu)異親本用于水稻稻米外觀品質(zhì)的改良(圖4)。

M. DL2000；A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果；B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果； 1. 南京1號； 2. 南京11號；3. 南京14號；4. 南京15號； 5. 南京16號；6. BG90-2；7. 圭630；8. 蘇農(nóng)3037； 9. 明恢78； 10. 9311；11. IRBB21；12. 廣陸矮4號；13. 粵晶絲苗；14. 浙恢7954；15. 樂恢188；16. 廣恢128；17. IR64；18. 矮腳南特；19. 蜀恢527；20. 多恢1號；21. 綿恢725；22. Ⅱ-32B；23. 粵泰B；24. 華豐B。

利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對江蘇省歷年來大面積推廣的65份粳稻品種進(jìn)行檢測，2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。65份粳稻品種均表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型，說明江蘇近幾年大面積推廣的粳稻品種中大部分包含的是Chalk5高堊白率等位基因，缺少chalk5低堊白率等位基因型的粳稻品種，部分品種的檢測結(jié)果見圖5。

利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對179份太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行檢測，2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。179份太湖流域粳稻地方資源中，僅有8份表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型，其余171份資源表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型，說明這些粳稻地方資源中一小部分包含了chalk5低堊白率等位基因，可以作為水稻育種中稻米外觀品質(zhì)改良的重要資源，部分品種的檢測結(jié)果見圖6。

M. DL2000；A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果；B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果；1. 連粳4號； 2. 武運(yùn)粳21；3. 淮稻11號；4. 華粳6號； 5. 鹽粳11號；6. 連粳6號；7. 連粳7號；8. 華瑞稻1號；9. 連粳11號； 10. 武運(yùn)粳27；11. 淮稻14號；12. 泗稻785；13. 淮糯12號；14. 通糯3號；15. 揚(yáng)農(nóng)稻1號；16. 南粳45；17. 寧粳5號；18. 鎮(zhèn)稻14號；19. 揚(yáng)育粳2號；20. 蘇稻5號；21. 南粳49；22. 寧9108；23. 揚(yáng)粳805；24. 鎮(zhèn)稻10號。

M. DL2000；A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果；B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果；1. 上海青；2. 老來青；3. 立冬青；4. 筆桿青；5. 立更青；6. 盛郎青；7. 老來紅；8. 長綠種；9. 紅藩稻；10. 小羅漢；11. 短芒孟子粳；12. 牛芒黃；13. 糯稻；14. 白石稻；15. 大量稻；16. 白薄稻；17. 三光稻；18. 白稻頭；19. 慢綠種；20. 葡萄種；21. 二粒??；22. 紅殼糯；23. 黃金糯；24. 晚亂頭。

3 討論

作物常規(guī)育種是一門基于經(jīng)驗的藝術(shù)，為作物的改良做出了巨大的貢獻(xiàn)。目前，生產(chǎn)上的品種基本上都是由常規(guī)育種培育的，但是常規(guī)育種的成功往往取決于經(jīng)驗和一定程度的機(jī)遇，“效率低、周期長、預(yù)見性差”是作物育種長期存在的老大難問題，當(dāng)前水稻遺傳改良中存在的問題很難通過傳統(tǒng)育種得到解決。利用常規(guī)育種技術(shù)已經(jīng)很難育成突破性新品種，而基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析的分子育種已經(jīng)成為突破傳統(tǒng)育種瓶頸的唯一有效途徑。

分子育種能夠把表現(xiàn)型和基因型選擇結(jié)合起來，可以實現(xiàn)單個或多個目標(biāo)基因的直接選擇和聚合，大幅度提高育種效率，縮短育種年限，在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等方面已表現(xiàn)出巨大潛力，成為現(xiàn)代作物育種的主要方向[34-35]。根據(jù)分子手段參與形式的不同，分子育種可分為分子標(biāo)記育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計育種。分子標(biāo)記育種即分子標(biāo)記輔助選擇，近年來被廣泛運(yùn)用到水稻育種中[36-38]。根據(jù)分子標(biāo)記檢測的結(jié)果與田間表型的相關(guān)性水平，分子標(biāo)記輔助選擇中采用的標(biāo)記主要分為DNA標(biāo)記、基因標(biāo)記和功能標(biāo)記3種類型。Andersen等[39]最早提出了功能標(biāo)記的概念，通過鑒別基因序列的表型功能，挖掘該序列中的多態(tài)性信息，開發(fā)出能夠區(qū)分和預(yù)測該基因的不同等位基因型及其表型的一種新型分子標(biāo)記。由于是根據(jù)目標(biāo)基因的功能序列差異設(shè)計出來的分子標(biāo)記，檢測目標(biāo)基因等位基因型的結(jié)果準(zhǔn)確，即使是不同的遺傳背景也不需要進(jìn)一步驗證就可以確定目標(biāo)基因的等位基因型。

水稻堊白性狀是水稻的重要品質(zhì)性狀，是由多個微效基因共同控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，且極易受到環(huán)境等其他因素的影響，在水稻育種中難以直接通過表型來進(jìn)行準(zhǔn)確選擇，而且稻米堊白性狀要等成熟收獲后才能進(jìn)行鑒定，鑒定前需要出糙，費時費力。因此，通過設(shè)計目標(biāo)基因的功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇能夠快速準(zhǔn)確的鑒定目標(biāo)基因的不同等位基因型，能夠快速準(zhǔn)確篩選到包含目標(biāo)基因的單株。本研究根據(jù)Chalk5基因的2個功能突變位點，每個位點分別開發(fā)了3對等位基因特異PCR引物，經(jīng)過梯度PCR篩選，每個位點均得到一對能高效特異擴(kuò)增的引物，Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。通過PCR產(chǎn)物測序的方法對這2對標(biāo)記的檢查結(jié)果進(jìn)行了驗證，表明新開發(fā)的2對功能標(biāo)記能夠準(zhǔn)確快速檢測目標(biāo)基因的等位基因型，能夠很好地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，提高選擇效率。

利用2對標(biāo)記對30份不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系、10份常規(guī)秈稻品種、3份秈稻保持系、65份近年來江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種、179份太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行了Chalk5基因型檢測，結(jié)果表明在43份秈稻材料中有20份材料表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型，其余23份材料表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型；65份粳稻品種均表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型；179份太湖流域粳稻地方資源中，僅有8份表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型，其余171份資源表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型。以上結(jié)果說明該基因在秈稻材料中存在一定的分布，這些材料在秈稻育種中可以作為優(yōu)異親本用于水稻稻米外觀品質(zhì)的改良，而在常規(guī)粳稻品種中未檢測到chalk5低堊白率等位基因型，僅在少數(shù)地方資源中檢測到，缺乏可以直接應(yīng)用的粳稻資源，這就存在目標(biāo)基因在粳稻育種中難以直接應(yīng)用的難題。如何將秈稻材料以及地方資源中的目標(biāo)基因應(yīng)用于粳稻稻米外觀品質(zhì)的改良是需要思考的一個問題，通過雜交后回交借助于分子標(biāo)記輔助選擇能否高效的實現(xiàn)目標(biāo)基因的導(dǎo)入且能擺脫其他的不良基因，從而不影響其他性狀，這還需要更多的實踐工作來檢驗。