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    水稻堊白基因Chalk5功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

    2017-12-12 12:04:08朱金燕王晴晴范方軍李文奇王芳權(quán)王緒鵬仲維功
    華北農(nóng)學(xué)報 2017年1期
    關(guān)鍵詞:秈稻粳稻等位基因

    朱金燕, 王晴晴, 王 軍, 范方軍,李文奇,王芳權(quán),王緒鵬,仲維功,楊 杰

    (1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,國家水稻改良中心南京分中心,江蘇 南京 210014;2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;3.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215008;4.揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

    水稻是我國重要的糧食作物,種植面積和總產(chǎn)都位居第一。隨著人們生活水平的提高,消費者對稻米品質(zhì)需求越來越高。稻米品質(zhì)主要包括加工品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì),具體內(nèi)容有:透明度、堊白、粒型、直鏈淀粉含量、膠稠度、糊化溫度、蛋白質(zhì)含量以及有無香味等。其中外觀品質(zhì)尤為重要,是水稻商品性的直接體現(xiàn),決定了其在市場競爭中的地位[1-6]。堊白是衡量水稻外觀品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一,降低稻米的堊白是培育優(yōu)質(zhì)水稻品種的前提。

    稻米堊白是指胚乳充實不足,胚乳中的淀粉和蛋白顆粒排列疏松,顆粒與顆粒之間存在空氣,陽光透過其內(nèi)部時光線發(fā)生折射而形成的一種光學(xué)特性[7-10]。根據(jù)其發(fā)生部位的不同可分為背白、腹白和心白[11-13]。水稻種子灌漿的順序是從背部到腹部、從周邊到中心[14],因此,水稻堊白中出現(xiàn)最多的是腹白,背白最少。相關(guān)研究表明,堊白與其他品質(zhì)性狀存在一定的相關(guān)性。在外觀品質(zhì)中,李欣等[15]認(rèn)為秈稻稻米堊白與粒寬存在極顯著的正相關(guān)性,與長寬比存在極顯著的負(fù)相關(guān)性,而粳稻稻米的堊白面積與粒型、粒長沒有明顯的相關(guān)性。在加工品質(zhì)上面,徐富賢等[16]認(rèn)為堊白與整精米率呈顯著負(fù)相關(guān)。在秈稻的蒸煮食味品質(zhì)中,周少川等[17]認(rèn)為在秈稻中稻米堊白與直鏈淀粉含量和糊化溫度存在極顯著正相關(guān)關(guān)系,與膠稠度存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,而在粳稻中,這些相關(guān)性不顯著。這一結(jié)論與劉奇華等[18]的研究結(jié)果一致。

    堊白是典型的數(shù)量性狀,受多基因調(diào)控,以加性效應(yīng)為主,同時也容易受到環(huán)境的影響,如溫度、肥力水平等[19]。因此,對堊白性狀的遺傳研究比較困難。不同的研究者利用不同的遺傳群體對堊白性狀進(jìn)行了大量的研究,鑒定了部分相關(guān)QTL。到目前為止共定位到85個與堊白相關(guān)的QTL( http://archive.gramene.org /qtl /),其中有13個與堊白大小有關(guān),21個與堊白度相關(guān)的,51個控制堊白率,但多數(shù)研究尚停留在QTL初步和精細(xì)定位的層面上[20-24]。目前已克隆的與堊白相關(guān)的基因共8個,其中6個是通過T-DNA 插入、輻射誘變、化學(xué)誘變等方式創(chuàng)制人工突變體而分離克隆的,2個是利用自然突變的材料克隆的,前者的優(yōu)點是能創(chuàng)造極端表型,等位基因效應(yīng)大,較易分離克隆,但是限制了其在育種實踐中的直接應(yīng)用。GW2是第一個利用自然變異克隆的堊白相關(guān)基因,位于第2染色體上,編碼一個E3泛素連接酶,它使籽粒變寬和粒重增加的同時籽粒的堊白也增加,可能是由于粒寬增大,籽粒灌漿速度加快,從而導(dǎo)致堊白的產(chǎn)生[25]。Chalk5是最近克隆的一個控制水稻堊白的主效QTL,該基因編碼一種液泡上的有無機(jī)焦磷酸水解作用和H+轉(zhuǎn)運(yùn)作用的焦磷酸轉(zhuǎn)移酶[26]。過量表達(dá)Chalk5能夠使胚乳的堊白增加,可能是干擾了種子發(fā)育過程中膜運(yùn)輸系統(tǒng)的pH穩(wěn)態(tài),從而影響蛋白體的生物合成,使小囊泡結(jié)構(gòu)大量增加,因此,在胚乳的貯藏部位形成堊白。與低堊白品種H94等位基因序列比較,高堊白品種珍汕97等位基因序列發(fā)生39處多態(tài)性變異,其中10處變異發(fā)生在翻譯起始位點上游1.8 kb的啟動子區(qū)域,包括替換、插入和缺失3種變異類型。5處變異發(fā)生在外顯子區(qū)域,但僅在第1個和第4個外顯子上發(fā)生2個氨基酸替換,內(nèi)含子區(qū)域有24處SNP變異。對該基因進(jìn)行功能性遺傳變異分析發(fā)現(xiàn),在珍汕97啟動子-721和-485位的2個SNPs變異導(dǎo)致其與種子發(fā)育相關(guān)的2個順式調(diào)控元件在H94啟動子中發(fā)生了變異,位于-721位的是調(diào)控種子特異表達(dá)和ABA相應(yīng)的RY/G-box[27-28],位于-485位的是調(diào)控種子發(fā)育過程中光合產(chǎn)物運(yùn)輸和代謝的CACT-box[29-31]。研究結(jié)果表明,這2個突變位點上與珍汕97具有相同等位基因型的Chalk5的表達(dá)量較高,與同一時期的珍汕97表達(dá)量相近,任意一個位點發(fā)生突變,Chalk5的表達(dá)量降低,與同一時期的H94表達(dá)量相近。堊白是典型的數(shù)量性狀,容易受到環(huán)境的影響,且其表型是在成熟收獲后才能進(jìn)行選擇,因此,獲得Chalk5的功能標(biāo)記能快速、準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)基因的不同基因型,是開展Chalk5基因分子標(biāo)記輔助選擇的重要前提。

    本研究根據(jù)這2個功能突變位點,每個位點分別開發(fā)了3對等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物,經(jīng)過梯度PCR篩選,每個位點均得到1對能高效特異擴(kuò)增的引物,Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。通過PCR產(chǎn)物測序的方法對這2對標(biāo)記的檢測結(jié)果進(jìn)行了驗證,并利用該標(biāo)記對不同地區(qū)的秈稻材料、江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種以及太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行了Chalk5基因型檢測,快速準(zhǔn)確地明確了該基因在這些品種和資源中的分布情況。

    1 材料和方法

    1.1 供試材料

    供試水稻材料包括江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種65份;不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系30份,常規(guī)秈稻品種10份,秈稻保持系3份;太湖流域粳稻地方資源179份。以含有Chalk5基因的9311和含有chalk5基因的Basmati作為對照。

    1.2 Chalk5基因功能標(biāo)記的設(shè)計與合成

    在GenBank中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索高堊白率顯性等位基因Chalk5和低堊白率隱性等位基因chalk5的序列,來源于珍汕97的顯性等位基因Chalk5的登錄號為KJ363317.1,來源于H94的隱性等位基因chalk5的登錄號為KJ363318.1。經(jīng)過序列比對分析發(fā)現(xiàn),與前人的研究結(jié)果一致[26],在起始密碼子前第721位堿基由C突變?yōu)門,在起始密碼子前第485位堿基由A突變?yōu)門,且這2個突變位點為功能突變,根據(jù)這2個功能突變位點以及基因序列,參照Ye等[32]的方法用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物,為了增強(qiáng)引物的特異性,第721位突變位點的后引在3′端引入一個人為錯配,第485位突變位點的前引在3′端引入一個人為錯配。由于尚不清楚哪一種堿基的錯配能夠在不影響擴(kuò)增效率的前提下提高擴(kuò)增特異性,因此,每個位點分別設(shè)計3種堿基錯配方式,前引與后引配對,每個位點共6對引物以供篩選,引物具體序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

    引物由Invitrogen公司合成,將合成的引物用TE緩沖液(pH值8.0)稀釋為10 mol/L,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 Chalk5基因功能區(qū)段的測序和序列比對

    為了進(jìn)一步驗證該功能標(biāo)記的準(zhǔn)確性以及明確常規(guī)粳稻和秈稻品種中目標(biāo)基因的等位基因型,利用引物C1F和C2R分別為前引和后引組合配對,擴(kuò)增目標(biāo)基因功能區(qū)段,產(chǎn)物清晰,大小為846 bp,對其中9份品種的目標(biāo)基因功能區(qū)段進(jìn)行了測序。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收、純化、檢測后送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,拼接后的序列與登錄的chalk5進(jìn)行比對。

    1.4 DNA提取

    在水稻分蘗盛期取新鮮幼嫩的葉片,采用SDS法提取水稻基因組DNA[33]。

    1.5 PCR擴(kuò)增和電泳

    20 μL的反應(yīng)體系包括:模板DNA(約15 ng/μL)2 μL,引物(4 pmol/μL)2 μL,10×緩沖液(25 mmol/L)2 μL,MgCl2(25 mmol/L)1.2 μL,dNTP(2.5 mmol/L)0.4 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL,滅菌雙蒸水12.2 μL。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃,30 s,58 ℃,30 s,72 ℃,1 min,共32個循環(huán);72 ℃再延伸10 min。其中在梯度反應(yīng)中將退火溫度設(shè)置為53~63 ℃。反應(yīng)產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,DuRed染色,然后在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Chalk5基因序列的分析和功能標(biāo)記的開發(fā)

    對珍汕97中包含的高堊白率顯性等位基因Chalk5和H94的低堊白率隱性等位基因chalk5的序列進(jìn)行比對分析,在起始密碼子前第721位堿基由C突變?yōu)門,在起始密碼子前第485位堿基由A突變?yōu)門,且這2個突變位點為功能突變,根據(jù)這2個功能突變位點以及基因序列設(shè)計等位基因特異PCR (ARMS-PCR)引物,為了增強(qiáng)引物的特異性,第721位突變位點的后引在3′端引入一個人為錯配,第485位突變位點的前引在3′端引入一個人為錯配。由于尚不清楚哪一種堿基的錯配能夠在不影響擴(kuò)增效率的前提下提高擴(kuò)增特異性,因此,每個位點分別設(shè)計3種堿基錯配方式,前引與后引配對,每個位點共6對引物,引物具體序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

    將C1F與C1R1配對的引物命名為Chalk11,C1F與NC1R1配對的引物命名為NChalk11,C1F與C1R2配對的引物命名為Chalk12,C1F與NC1R2配對的引物命名為NChalk12,C1F與C1R3配對的引物命名為Chalk13,C1F與NC1R2配對的引物命名為NChalk13;將C2F1與C2R配對的引物命名為Chalk21,NC2F1與C2R配對的引物命名為NChalk21,C2F2與C2R配對的引物命名為Chalk22,NC2F2與C2R配對的引物命名為NChalk22,C2F3與C2R配對的引物命名為Chalk23,NC2F3與C2R配對的引物命名為NChalk23。

    對與珍汕97具有相同等位基因型(高堊白率顯性等位基因Chalk5)的水稻品種,引物Chalk11、Chalk12、Chalk13和Chalk21、Chalk22 、Chalk23分別能擴(kuò)增出197,450 bp的片段,而引物NChalk11、NChalk12、NChalk13和NChalk21、NChalk22、NChalk23則無擴(kuò)增產(chǎn)物;對與H94具有相同等位基因型(低堊白率隱性等位基因chalk5)的水稻品種,引物NChalk11、NChalk12、NChalk13和NChalk21、NChalk22、NChalk23分別能擴(kuò)增出197,450 bp的片段,而引物Chalk11、Chalk12、Chalk13和Chalk21、Chalk22、Chalk23則無擴(kuò)增產(chǎn)物。

    表1 基于顯性隱性等位基因序列單堿基功能突變位點設(shè)計的ARMS-PCR標(biāo)記Tab.1 ARMS-PCR primers designed in this paper

    2.2 Chalk5基因功能標(biāo)記的篩選

    對這12對引物進(jìn)行梯度篩選,梯度反應(yīng)過程中退火溫度為53~63 ℃,分別為53.0,53.2,53.8,54.7,55.8,57.1,58.4,59.7,60.9,61.9,62.6,62.9 ℃。根據(jù)前人的研究結(jié)果,DNA模板選用與珍汕97具有相同等位基因型的常規(guī)秈稻品種9311和與H94具有相同等位基因型的秈稻恢復(fù)系明恢63,擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖電泳分析。

    如圖1所示,以9311為模板,引物Chalk11、Chalk12、Chalk13能擴(kuò)增出197 bp的片段,對應(yīng)引物NChalk11、NChalk12、NChalk13無擴(kuò)增產(chǎn)物;以明恢63為模板,引物Chalk11、Chalk12、Chalk13無擴(kuò)增產(chǎn)物,對應(yīng)引物NChalk11、NChalk12、NChalk13能擴(kuò)增出197 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果完全一致。同時,從圖1中可以看出第2個引物對Chalk12與NChalk12在退火溫度為59.7 ℃條件下的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性最好,因此,選用等位基因特異PCR引物Chalk12與NChalk12作為第一個功能突變位點的篩選標(biāo)記,可用于目標(biāo)基因等位基因型的快速檢測。

    M. DL2000;A. 引物Chalk11、NChalk11擴(kuò)增結(jié)果;B. 引物Chalk12、NChalk12擴(kuò)增結(jié)果;C. 引物Chalk13、NChalk13擴(kuò)增結(jié)果。

    如圖2所示,以9311為模板,引物Chalk21、Chalk22、Chalk23能擴(kuò)增出450 bp的片段,對應(yīng)引物NChalk21、NChalk22、NChalk23無擴(kuò)增產(chǎn)物;以明恢63為模板,引物Chalk21、Chalk22、Chalk23無擴(kuò)增產(chǎn)物,對應(yīng)引物NChalk21、NChalk22、NChalk23能擴(kuò)增出450 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果完全一致。同時,從圖2中可以看出第2個引物對Chalk22與NChalk22在退火溫度為60.9 ℃條件下的擴(kuò)增效率及擴(kuò)增特異性最好,因此,選用等位基因特異PCR引物Chalk22與NChalk22作為第2個功能突變位點的篩選標(biāo)記,可用于目標(biāo)基因等位基因型的快速檢測。

    2.3 Chalk5基因功能標(biāo)記的驗證

    為了進(jìn)一步驗證等位基因特異PCR引物Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22對不同水稻品種包含的等位基因型檢測的準(zhǔn)確性,將引物C1F、C2R配對命名為ChalkCX,用于功能目標(biāo)片段的測序分析,該引物能擴(kuò)增出846 bp的目標(biāo)片段,包含了上述2個功能突變位點。

    利用引物ChalkCX對7個水稻品種9311、明恢63、日本晴、連粳4號、淮稻11號、華粳6號和鹽粳11號進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。如圖3所示,與對照珍汕97和H94進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn),9311、日本晴、連粳4號、淮稻11號、華粳6號和鹽粳11號在2個功能突變位點的等位基因型與珍汕97一致,而明恢63在2個功能突變位點的等位基因型與H94一致,測序分析結(jié)果與等位基因特異PCR檢測的結(jié)果完全一致,因此,利用Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22中的任何一對引物均可以準(zhǔn)確地鑒定出水稻品種中包含的Chalk5的不同等位基因型(圖3)。

    M. DL2000;A. 引物Chalk21、NChalk21擴(kuò)增結(jié)果;B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增結(jié)果;C. 引物Chalk23、NChalk23擴(kuò)增結(jié)果。

    圖3 部分粳稻和秈稻品種Chalk5位點功能區(qū)的測序比對結(jié)果Fig.3 Sequence alignment of Chalk5 functional domain for partial rice varieties

    2.4 ARMS-PCR標(biāo)記對部分秈稻材料、江蘇省粳稻品種和太湖流域粳稻地方資源的檢測

    利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對43份秈稻材料進(jìn)行檢測,其中有30份不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系、10份常規(guī)秈稻品種以及3份秈稻保持系,2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。其中,南京14號、圭630、蘇農(nóng)3037、明恢78等20份材料表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型,其余23份材料表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型。這些含有chalk5低堊白率等位基因水稻材料在育種中可以作為優(yōu)異親本用于水稻稻米外觀品質(zhì)的改良(圖4)。

    M. DL2000;A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果;B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果; 1. 南京1號; 2. 南京11號;3. 南京14號;4. 南京15號; 5. 南京16號;6. BG90-2;7. 圭630;8. 蘇農(nóng)3037; 9. 明恢78; 10. 9311;11. IRBB21;12. 廣陸矮4號;13. 粵晶絲苗;14. 浙恢7954;15. 樂恢188;16. 廣恢128;17. IR64;18. 矮腳南特;19. 蜀恢527;20. 多恢1號;21. 綿恢725;22. Ⅱ-32B;23. 粵泰B;24. 華豐B。

    利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對江蘇省歷年來大面積推廣的65份粳稻品種進(jìn)行檢測,2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。65份粳稻品種均表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型,說明江蘇近幾年大面積推廣的粳稻品種中大部分包含的是Chalk5高堊白率等位基因,缺少chalk5低堊白率等位基因型的粳稻品種,部分品種的檢測結(jié)果見圖5。

    利用2對ARMS-PCR標(biāo)記Chalk12、NChalk12 和Chalk22、NChalk22分別對179份太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行檢測,2對標(biāo)記的檢測結(jié)果一致。179份太湖流域粳稻地方資源中,僅有8份表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型,其余171份資源表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型,說明這些粳稻地方資源中一小部分包含了chalk5低堊白率等位基因,可以作為水稻育種中稻米外觀品質(zhì)改良的重要資源,部分品種的檢測結(jié)果見圖6。

    M. DL2000;A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果;B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果;1. 連粳4號; 2. 武運(yùn)粳21;3. 淮稻11號;4. 華粳6號; 5. 鹽粳11號;6. 連粳6號;7. 連粳7號;8. 華瑞稻1號;9. 連粳11號; 10. 武運(yùn)粳27;11. 淮稻14號;12. 泗稻785;13. 淮糯12號;14. 通糯3號;15. 揚(yáng)農(nóng)稻1號;16. 南粳45;17. 寧粳5號;18. 鎮(zhèn)稻14號;19. 揚(yáng)育粳2號;20. 蘇稻5號;21. 南粳49;22. 寧9108;23. 揚(yáng)粳805;24. 鎮(zhèn)稻10號。

    M. DL2000;A. 引物Chalk12、NChalk12 擴(kuò)增的結(jié)果;B. 引物Chalk22、NChalk22擴(kuò)增的結(jié)果;1. 上海青;2. 老來青;3. 立冬青;4. 筆桿青;5. 立更青;6. 盛郎青;7. 老來紅;8. 長綠種;9. 紅藩稻;10. 小羅漢;11. 短芒孟子粳;12. 牛芒黃;13. 糯稻;14. 白石稻;15. 大量稻;16. 白薄稻;17. 三光稻;18. 白稻頭;19. 慢綠種;20. 葡萄種;21. 二粒??;22. 紅殼糯;23. 黃金糯;24. 晚亂頭。

    3 討論

    作物常規(guī)育種是一門基于經(jīng)驗的藝術(shù),為作物的改良做出了巨大的貢獻(xiàn)。目前,生產(chǎn)上的品種基本上都是由常規(guī)育種培育的,但是常規(guī)育種的成功往往取決于經(jīng)驗和一定程度的機(jī)遇,“效率低、周期長、預(yù)見性差”是作物育種長期存在的老大難問題,當(dāng)前水稻遺傳改良中存在的問題很難通過傳統(tǒng)育種得到解決。利用常規(guī)育種技術(shù)已經(jīng)很難育成突破性新品種,而基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析的分子育種已經(jīng)成為突破傳統(tǒng)育種瓶頸的唯一有效途徑。

    分子育種能夠把表現(xiàn)型和基因型選擇結(jié)合起來,可以實現(xiàn)單個或多個目標(biāo)基因的直接選擇和聚合,大幅度提高育種效率,縮短育種年限,在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等方面已表現(xiàn)出巨大潛力,成為現(xiàn)代作物育種的主要方向[34-35]。根據(jù)分子手段參與形式的不同,分子育種可分為分子標(biāo)記育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計育種。分子標(biāo)記育種即分子標(biāo)記輔助選擇,近年來被廣泛運(yùn)用到水稻育種中[36-38]。根據(jù)分子標(biāo)記檢測的結(jié)果與田間表型的相關(guān)性水平,分子標(biāo)記輔助選擇中采用的標(biāo)記主要分為DNA標(biāo)記、基因標(biāo)記和功能標(biāo)記3種類型。Andersen等[39]最早提出了功能標(biāo)記的概念,通過鑒別基因序列的表型功能,挖掘該序列中的多態(tài)性信息,開發(fā)出能夠區(qū)分和預(yù)測該基因的不同等位基因型及其表型的一種新型分子標(biāo)記。由于是根據(jù)目標(biāo)基因的功能序列差異設(shè)計出來的分子標(biāo)記,檢測目標(biāo)基因等位基因型的結(jié)果準(zhǔn)確,即使是不同的遺傳背景也不需要進(jìn)一步驗證就可以確定目標(biāo)基因的等位基因型。

    水稻堊白性狀是水稻的重要品質(zhì)性狀,是由多個微效基因共同控制的復(fù)雜數(shù)量性狀,且極易受到環(huán)境等其他因素的影響,在水稻育種中難以直接通過表型來進(jìn)行準(zhǔn)確選擇,而且稻米堊白性狀要等成熟收獲后才能進(jìn)行鑒定,鑒定前需要出糙,費時費力。因此,通過設(shè)計目標(biāo)基因的功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇能夠快速準(zhǔn)確的鑒定目標(biāo)基因的不同等位基因型,能夠快速準(zhǔn)確篩選到包含目標(biāo)基因的單株。本研究根據(jù)Chalk5基因的2個功能突變位點,每個位點分別開發(fā)了3對等位基因特異PCR引物,經(jīng)過梯度PCR篩選,每個位點均得到一對能高效特異擴(kuò)增的引物,Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22。通過PCR產(chǎn)物測序的方法對這2對標(biāo)記的檢查結(jié)果進(jìn)行了驗證,表明新開發(fā)的2對功能標(biāo)記能夠準(zhǔn)確快速檢測目標(biāo)基因的等位基因型,能夠很好地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種,提高選擇效率。

    利用2對標(biāo)記對30份不同地區(qū)秈稻恢復(fù)系、10份常規(guī)秈稻品種、3份秈稻保持系、65份近年來江蘇省歷年來大面積推廣的粳稻品種、179份太湖流域粳稻地方資源進(jìn)行了Chalk5基因型檢測,結(jié)果表明在43份秈稻材料中有20份材料表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型,其余23份材料表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型;65份粳稻品種均表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型;179份太湖流域粳稻地方資源中,僅有8份表現(xiàn)為chalk5低堊白率等位基因型,其余171份資源表現(xiàn)為Chalk5高堊白率等位基因型。以上結(jié)果說明該基因在秈稻材料中存在一定的分布,這些材料在秈稻育種中可以作為優(yōu)異親本用于水稻稻米外觀品質(zhì)的改良,而在常規(guī)粳稻品種中未檢測到chalk5低堊白率等位基因型,僅在少數(shù)地方資源中檢測到,缺乏可以直接應(yīng)用的粳稻資源,這就存在目標(biāo)基因在粳稻育種中難以直接應(yīng)用的難題。如何將秈稻材料以及地方資源中的目標(biāo)基因應(yīng)用于粳稻稻米外觀品質(zhì)的改良是需要思考的一個問題,通過雜交后回交借助于分子標(biāo)記輔助選擇能否高效的實現(xiàn)目標(biāo)基因的導(dǎo)入且能擺脫其他的不良基因,從而不影響其他性狀,這還需要更多的實踐工作來檢驗。

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