磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉仔魚的急性毒性試驗

張孟丹，梁俊平，李芳芳，程利嬌，聶國興

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉仔魚的急性毒性試驗

張孟丹，梁俊平，李芳芳，程利嬌，聶國興

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

為評價磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星兩種水產(chǎn)常用藥物對鯉魚仔魚的毒性強度，在水溫26℃條件下，根據(jù)改良寇氏法，進行了磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉魚仔魚急性毒性試驗。結(jié)果顯示，磺胺二甲嘧啶對鯉魚仔魚的24 h和48 h的半致死質(zhì)量濃度分別為862.56 mg/L、752.43 mg/L，鯉仔魚磺胺二甲嘧啶安全質(zhì)量濃度為196.91 mg/L。恩諾沙星對鯉仔魚24 h和48 h致死質(zhì)量濃度分別為746.75 mg/L、713.61 mg/L，鯉仔魚恩諾沙星安全質(zhì)量濃度為204.58 mg/L。

磺胺二甲嘧啶；恩諾沙星；鯉魚；急性毒性；半致死濃度；安全濃度

黃河鯉（Cyprinus carpio），屬鯉形目、鯉科、鯉亞科，是我國重要淡水經(jīng)濟魚類，是我國寶貴的魚類資源[1-2]。近年來，黃河鯉的飼養(yǎng)模式以節(jié)約化池塘養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖戶高密度的放養(yǎng)苗種、大量投飼、投喂高營養(yǎng)飼料等，使單位面積產(chǎn)量獲得大量提高[3]，然而，隨之病害也頻繁發(fā)生，如近年來爆發(fā)的鯉魚爛鰓病，給黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。養(yǎng)殖戶不得不使用各種藥物用來減少損失、獲得養(yǎng)殖成功[4]。然而由于養(yǎng)殖戶缺乏科學(xué)的用藥技術(shù)，加之許多藥物是從獸藥中移植過來，缺乏科學(xué)用藥指導(dǎo)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中存在一定的用藥誤區(qū)，因而給黃河鯉的健康養(yǎng)殖業(yè)帶來了潛在風(fēng)險，給黃河鯉質(zhì)量安全埋下了隱患。

磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）和恩諾沙星（Enrofloxacin）是目前鯉魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用的化學(xué)合成抗菌藥，對大多數(shù)革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌都有抑制作用，廣泛用于治療養(yǎng)殖魚類中常見的疾病，如細菌性出血敗血癥、赤皮病、爛鰓病、打印病等[5-8]?；前范奏奏ず投髦Z沙星在治療成魚時多拌在飼料中投喂，在治療仔魚時多以藥浴形式，而針對磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉魚仔魚的安全質(zhì)量濃度方面的研究鮮有報道。本試驗研究了磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對黃河鯉仔魚的毒性效應(yīng)，確定其安全質(zhì)量濃度，旨在為磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗魚

試驗所用的鯉魚仔魚為水產(chǎn)學(xué)院實訓(xùn)基地室內(nèi)人工繁育獲得，挑選其中健康活潑、大小一致的試驗用魚若干尾，仔魚平均體長為6.01±0.53 mm。

1.2 試驗藥物

磺胺二甲嘧啶鈉注射液（1 g/10 mL）購于株洲市神農(nóng)動物藥業(yè)有限公司，恩諾沙星注射液（5 g/100 mL）購于拜耳（四川）動物保健有限公司。

1.3 養(yǎng)殖條件

鯉魚仔魚養(yǎng)殖在2000 mL容器中，養(yǎng)殖溫度為26℃，連續(xù)充氧。

1.4 試驗方法

1.4.1 上限劑量和下限劑量確定

分別配制磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星最大質(zhì)量濃度，然后按等比關(guān)系（如2：1）稀釋成多個劑量，每組取5-10尾魚，按估計劑量試驗，觀察24-96 h，如果全部死亡則降低劑量，如果全部存活則增加劑量，找出鯉仔魚100%和0%死亡的劑量，即上限劑量（Dm）和下限劑量（Dn）。經(jīng)過預(yù)試驗確定磺胺二甲嘧啶的Dm、Dn分別為1200 mg/L和600 mg/L，恩諾沙星的Dm、Dn分別為 1200 mg/L、Dn為 800 mg/L。

1.4.2 試驗分組數(shù)及劑量確定

各組劑量要按等比級數(shù)排列，根據(jù)下列公式求出公比r：

D2=D1·r，D3=D2·r，……Dm=Dn-1·r

其中：G為試驗組數(shù)，D1=Dn=最小劑量，Dm=最大劑量

1.4.3藥物濃度梯度設(shè)置

根據(jù)預(yù)試驗分別設(shè)置磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星濃度梯度，每個濃度梯度設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾魚。24 h更換一次新配制的藥物溶液。

磺胺二甲嘧啶的6個質(zhì)量濃度梯度依次為：600 mg/L、689 mg/L、792 mg/L、910 mg/L、1045 mg/L 和1201 mg/L，養(yǎng)殖水體為1000 mL；恩諾沙星的9個質(zhì)量濃度梯度依次為：628 mg/L、681 mg/L、738 mg/L、800 mg/L、867 mg/L、940 mg/L、1019 mg/L、1105 mg/L和1197 mg/L，養(yǎng)殖水體為1000 mL。1.4.4 死亡率統(tǒng)計及安全濃度計算

定時記錄 24 h、48 h、72 h、96 h 鯉魚仔魚的死亡數(shù)，計算出死亡率，再根據(jù)改良寇氏法求出24 h、48 h、72 h、96 h 的半致死質(zhì)量濃度（LC50），最后按下式求其半致死質(zhì)量濃度（LC50）[9]：

Xm=最大劑量的對數(shù)值

i=相鄰兩組比值的對數(shù)（lgr）

P=各組死亡率

ΣP=各組死亡率總和

根據(jù)特倫堡（Tumbell）公式計算安全質(zhì)量濃度：

2 試驗結(jié)果

2.1 磺胺二甲嘧啶對鯉仔魚死亡率的影響

如圖1所示，不同濃度下，24 h的死亡率分別為10.00% 、18.33% 、23.33% 、43.33% 、93.33% 和 100.00%，48h時的死亡率分別為33.33%、36.67%、43.33%、76.68%、96.67%和100.00%；而72和96 h的死亡率在低濃度下均已高于80.00%，甚至達90.00%以上。由此可見24 h、48 h時鯉魚仔魚的死亡率隨著磺胺二甲嘧啶濃度升高而增加，呈現(xiàn)濃度效應(yīng)。在質(zhì)量濃度相同條件下，攻毒時間越長，鯉魚仔魚的死亡率越高，特別是72 h和96 h的死亡率在低濃度下已高于80.00%。這可能是由于磺胺二甲嘧啶在鯉魚仔魚體內(nèi)的蓄積超出了黃河鯉魚仔魚對磺胺二甲嘧啶的排泄能力，進而影響了鯉魚仔魚的正常生理功能，從而導(dǎo)致仔魚中毒死亡。

圖1 磺胺二甲嘧啶對鯉魚仔魚死亡率的影響Fig.1 Effects of sulfamethazine on mortality rates ofCyrinus carpio fry

2.2 磺胺二甲嘧啶對鯉仔魚的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度

鯉魚仔魚24h和48 h磺胺二甲嘧啶的半致死質(zhì)量濃度分別為862.56 mg/L和752.43 mg/L，根據(jù)公式計算得出磺胺二甲嘧啶的安全質(zhì)量濃度為196.91mg/L（表 1）。

表1 磺胺二甲嘧啶對鯉魚仔魚的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度（mg/L）Tab.1 The LC50and SC of sulfamethazine toCyrinus carpio fry

2.3 恩諾沙星對鯉仔魚死亡率的影響

如圖2所示，在相同時間內(nèi)，隨著恩諾沙星濃度越高，鯉魚仔魚的死亡率越來越高，24 h時鯉魚仔魚的死亡率分別為 18.33%、38.33%、41.67%、76.67%、83.33%、88.33%、93.33%、95.00%和 100.00%，48 h時鯉魚仔魚的死亡率分別為21.67%、41.67%、53.33%、86.67%、93.33%、95.00%、100.00%、100.00%和100.00%。恩諾沙星質(zhì)量濃度相同條件下，攻毒時間越長，鯉魚仔魚的死亡率越高，例如，當(dāng)恩諾沙星的質(zhì)量濃度為628 mg/L時，鯉魚仔魚在72 h、96 h的死亡率已達75.00%、91.67%，而24 h、48 h的死亡率只有18.33%、21.67%。這可能是由于恩諾沙星在鯉魚仔魚體內(nèi)的蓄積已超出鯉魚仔魚對恩諾沙星的排泄能力，影響了仔魚的正常生理功能，從而導(dǎo)致其中毒死亡。

圖2 恩諾沙星對鯉魚仔魚死亡率的影響Fig.2 Effects of enrofloxacin on mortality rates of Cyrinus carpio fry

2.4 恩諾沙星對鯉魚仔魚的半致死濃度和安全濃度

恩諾沙星對鯉魚仔魚在24 h和48 h的半致死質(zhì)量濃度分別為746.75 mg/L、713.61 mg/L，恩諾沙星對鯉魚仔魚的安全質(zhì)量濃度為204.58 mg/L（表2）。

表2 恩諾沙星對鯉魚仔魚的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度（mg/L）Tab.2 The LC50 and SC of enrofloxacin to Cyrinus carpio fry

3 討論

3.1 磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉仔魚的毒性

關(guān)于磺胺類藥物對水產(chǎn)動物急性毒性研究相對較少，但一般認為磺胺類藥物對魚類毒性較小，安全質(zhì)量濃度都高于10 mg/L[10]。研究也發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物對魚類毒性相對較小，如鹽酸環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星對孔雀魚的安全質(zhì)量濃度分別高達300、200、25 mg/L[11]，氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星對金魚的安全質(zhì)量濃度為100 mg/L[12]。與抗菌藥物相比，殺蟲類農(nóng)藥對魚類毒性相對較強。王軍等[13]研究表明，菊酯類對農(nóng)藥鯉幼魚96 h LC50僅為0.33 μg/L，安全質(zhì)量濃度為 0.033 μg/L。徐文彥等[14]研究表明，阿維菌素和甲苯咪對鯉幼魚的安全質(zhì)量濃度分別為1.91 μg/L、1.23 mg/L。福瑞鯉幼魚對硫酸銅、敵百蟲的安全質(zhì)量濃度分別為0.17 mg/L、8.05 mg/L[15]。本研究結(jié)果顯示，磺胺二甲嘧啶對鯉仔魚24 h LC50和48 h LC50分別為862.56 mg/L、752.43 mg/L，安全質(zhì)量濃度為196.91mg/L；恩諾沙星對鯉仔魚24 h LC50和48 h LC50分別為746.75 mg/L、713.61 mg/L，安全質(zhì)量濃度為204.58 mg/L。劉艷輝等[16]研究結(jié)果顯示，恩諾沙星對德國框鏡鯉夏花魚種24 h LC50和48 h LC50分別為693 mg/L、629 mg/L，安全質(zhì)量濃度為155 mg/L。由此看出，在本實驗條件下，磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星對鯉仔魚的毒性相對較弱。

3.2 磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星抑菌作用與科學(xué)用藥

磺胺藥物結(jié)構(gòu)與對氨苯甲酸相似，可與對氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻礙二氫葉酸的合成，從而起到抑菌作用、達到疾病治療效果[10]?；前范奏奏κ人畾鈫伟?(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillurum)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiela tarda)的 MIC 均為 0.20 mg/L[17]；而林春友等[18]研究結(jié)果顯示磺胺二甲嘧啶對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)不同菌株的MIC均大于128 mg/L，一般認為磺胺二甲嘧啶致病菌的MIC多為10-50 mg/L[19]。恩諾沙星通過與細菌DNA回旋酶亞基A結(jié)合，抑制該酶的活性，影響DNA復(fù)制過程，從而起到抑菌和殺菌作用。恩諾沙星對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)的MIC為 0.16-0.50 mg/L[20-21]，對蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas sobria)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)和粘球菌(Myxococcus piscicola)等的MIC為0.02-0.63 mg/L[22]。對于常見淡水魚類細菌疾病，建議恩諾沙星藥浴劑量為4 mg/L，而關(guān)于磺胺二甲嘧啶藥浴劑量尚未有明確規(guī)定[19]。本研究結(jié)果顯示，鯉仔魚對磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星安全質(zhì)量濃度遠遠大于抑菌濃度。因此，對于鯉仔魚疾病防治而言，磺胺二甲嘧啶和恩諾沙星使用量只要達到抑菌濃度即可，且不會對仔魚產(chǎn)生毒性。特別注意的是，在疾病防治過程中應(yīng)避免過量用藥，過量藥物不僅會使人類病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時過量殘留在水產(chǎn)品中的藥物會對人體產(chǎn)生溶血性貧血、再生障礙性貧血等危害[23]。水產(chǎn)科技工作者應(yīng)廣泛宣傳科學(xué)用藥規(guī)范，對養(yǎng)殖戶進行技術(shù)培訓(xùn)，提高養(yǎng)殖戶科學(xué)用藥意識和技術(shù)水平，從而促進水產(chǎn)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展、提升水產(chǎn)品質(zhì)量安全水平。

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Acute toxicity test of sulfamethazine and enrofloxacin on the fry ofCyrinus carpio

Zhang Mengdan,Liang Junping,Li Fangfang,Cheng Lijiao,Nie Guoxing

(College of Fisheries,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

In order to evaluate the toxicity of sulfamethazine and enrofloxacin on the fry ofCyrinus carpio,the acute toxicity test of sulfamethazine and enrofloxacin toC.carpiofry was made by using the improved Karber's method,at the water temperature of 26℃.The results showed that the 24h and 48h median lethal concentrations of sulfamethazine were 862.56 mg/L,752.43 mg/L,and the safe concentration of sulfamethazine was 196.91 mg/L.The 24h and 48h median lethal concentrations of enrofloxacin were 746.75 mg/L,713.61 mg/L,and the safe concentration of enrofloxacin was 204.58 mg/L.

sulfamethazine;enrofloxacin;Cyrinus carpio;acute toxicity;median lethal concentration;safe concentration

國家自然科學(xué)基金資助項目（31502185）；河南省科技攻關(guān)項目（142102310037）

張孟丹（1992-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物營養(yǎng)與安全

聶國興（1971-），男，教授，研究方向：水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：niegx@htu.cn