基質輔助激光解析電離

楊輝

【摘 要】目的探究基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀在臨床微生物鑒定中的應用，為真菌微生物的鑒定提供臨床技術支持。方法選取于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌作為實驗標本，利用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀對菌種進行鑒定，分析基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀對菌種鑒定的檢查效果。結果300株真菌中有290株（96.67%）經鑒定后可以正確歸類到種水平，6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結果出現(xiàn)錯誤，且正確率與傳統(tǒng)方法相比差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀穩(wěn)定性高，可重復性好，并且具有快速準確的優(yōu)點，是臨床鑒定微生物種類的一種快速可靠的高通量方法，可以為臨床的微生物鑒定提供一定的技術支持。

【關鍵詞】基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀；微生物鑒定；臨床應用

真菌感染是指由于機體感染真菌而引起的一系列疾病，感染類型大致包括表面感染，皮膚感染，皮下組織感染，深部感染以及條件性感染[1-4]。發(fā)生真菌感染的原因有很多，主要包括以下五個方面：（1）濫用抗生素：隨著光譜抗生素的廣泛應用，越來越多的人們選擇利用抗生素來治療細菌感染，這些抗生素在治療感染的同時也會減少有益菌的數(shù)量，從而破壞機體菌種平衡。（2）糖皮質激素的過量使用：針對炎癥患者以及皮膚病患者糖皮質激素的使用是必不可少的，然而這些藥物的使用卻會導致人體的免疫系統(tǒng)功能下降，為真菌感染創(chuàng)造了有利條件。（3）遺傳因素：遺傳因素也是機體產生真菌感染的一個重要原因，相對于正常人，這類人群由于遺傳物質的差異性導致他們更容易受到真菌的侵襲。（4）免疫系統(tǒng)功能障礙：由于化療或者免疫系統(tǒng)缺陷癥等因素導致機體免疫系統(tǒng)功能發(fā)生障礙，從而給真菌染感染創(chuàng)造了一個適宜生長的環(huán)境[5-9]。因此真菌感染在臨床上也越來越多見。常見的實驗室真菌鑒定方法是常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法，這種方法操作復雜，鑒定周期較長，對于設備以及技術水平的要求較高，因此往往會造成臨床診斷以及治療的滯后性，會廣大醫(yī)患人員帶來較大的困擾，然而隨著科學技術的不斷進步，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術出現(xiàn)在人們視野之中。基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術是一種快速鑒定微生物種類的新技術，近年來廣泛應用于醫(yī)學、生物等多個領域[10]。因此本次研究通過比較傳統(tǒng)真菌鑒定方法與基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術對菌種鑒定的準確率，探究基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀在臨床微生物鑒定上的應用。

1 資料與方法

1.1 菌種來源

本次研究一共選取300株真菌作為研究對象，全部菌株均來自于2015年3月到2017年2月我院臨床采集的真菌，質控菌種為白念珠菌ATCC14053和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 試驗儀器與設備

法國梅里埃公司的基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀以及配套的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，電子顯微鏡，水浴鍋，無菌注射器，基質液，一次性無菌試管，全自動微生物鑒定儀，真菌培養(yǎng)箱，離心機，移液槍等。

1.3 實驗方法

對采集來的真菌標本進行分離培養(yǎng)，標本接種在平板上在36℃的真菌培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，直到肉眼可見菌落時進行細菌種類鑒定。對所有菌種同時采用兩種方法進行鑒定，分別為常規(guī)傳統(tǒng)真菌鑒定方法以及基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術，對比兩種結果準確率。常規(guī)真菌鑒定方法是將菌落進行革蘭氏染色，同時對菌落進行鏡檢，通過對菌落的形態(tài)以及革蘭氏染色結果進行分析?；|輔助激光解析電離-飛行時間質譜法是將真菌接種到靶板上，然后再菌膜沒有完全干燥之前加入α-腈基-4-羥基肉桂酸基質，等待基質和菌株混合物完全干燥后將樣本放入儀器中進行分析掃描，利用數(shù)據(jù)庫進行鑒定，判斷菌株種類。結果結果可信程度在60.0%-99.9%之間且結果為一個是認為該結果可以接受。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用百分比表示，進行卡方檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 真菌鑒定種類分布

經過鑒定，300株真菌種類分別為：熱帶念珠菌、白色念珠菌、阿薩斯酵母菌、煙曲霉米曲霉、宛氏擬青霉、煙草赤星病菌，詳細數(shù)據(jù)見下表。

2.2 兩種方法鑒定真菌的正確率比較

本次研究采用了兩種真菌鑒定方法，常規(guī)鑒定組共檢查300株真菌，其中正確的有156株，正確率為52.00%，100例檢查錯誤，44例未檢出；基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術共檢查300株真菌，其中290株檢查正確，正確率為96.67%， 6株（2%）未能給出鑒定成果，4株（1.33%）鑒定結果出現(xiàn)錯誤。兩組檢查方法正確率存在差異，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術檢查正確率遠高于常規(guī)鑒定組，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳細數(shù)據(jù)見表2

3 討論

基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術是近年來出現(xiàn)的一種軟電離新型有機質譜，這種新的技術手段已經廣泛應用于生物、醫(yī)學行業(yè)，是檢測和鑒定多肽大分子物質以及蛋白質的有效手段，具有十分高的靈敏度，并且檢測的準確率高，操作簡單，檢測周期短，穩(wěn)定性高，是十分方便快捷的技術[11-13]?；|輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術可應用于多個領域，其中基于細菌表面蛋白分子量進行細菌鑒定的技術尤為引人注意。通過將微生物和等量的基質分別點加在加樣板上形成混合物，然后利用激光的能量使樣品解離，通過計算不同物質飛行時間不同來檢測離子分子量，然后應用質譜技術對結果進行處理，生成特異性的蛋白質組指紋圖，從而進行對比分析，鑒定微生物種類[14-16]。由于這種檢測方法是利用蛋白質圖譜來進行的，而每種微生物的蛋白組成受遺傳因素的影響，不受外界環(huán)境等因素的制約，因此相對于其他的檢測手法，這種蛋白質圖譜法能更為直觀準確的進行微生物的鑒定。endprint

在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)新的基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術檢查的正確率為96.67%，遠遠高于傳統(tǒng)的檢查手法，說明基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術具有準確率高的特點，并且在進行實際的操作實驗中，傳統(tǒng)的實驗方法是基于形態(tài)學或生理生化特性進行鑒定，需要的時間較長，且操作繁瑣，而且對于一些相似的菌種鑒別過程仍然存在一定的困難；但是利用這種新型技術操作的時間就大大減少，首先進行2-3天的菌株培養(yǎng)，等待菌株生長完成后進行樣本的制備，該過程僅需花費不到半個小時，因此時間大大的減少。曾有研究表明[17]，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術常見的人畜病原菌檢測中具有較好的準確率，對于單增李斯特菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌等病原菌都有十分高的準確率。Phillips等曾經對對來自病人的437個菌株進行基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜測試，差異結果用16S 基因進行分析，結果發(fā)現(xiàn)該方法鑒定菌株的正確率高達95.1%[18]。同時對980 株來自臨床的細菌和酵母菌株進行確認，發(fā)現(xiàn)基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術鑒定種的正確率（95.34%）明顯高于傳統(tǒng)的生化鑒定系統(tǒng)（83.1%）。并且，這種新型技術可以直接檢測來自醫(yī)院臨床病人的樣本，不需要經過純培養(yǎng)，因此檢測時間短，對于患者的臨床診斷以及治療有很大的幫助作用，在急性病原菌感染患者的檢測和治療上均有十分廣闊的應用前景[19，20]。

綜上所述，基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜技術在微生物鑒定上具有高正確率、高敏感性以及高穩(wěn)定性，并且操作簡單，鑒定周期短，價格低廉，適合在臨床上進行推廣應用。

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