河南省麥田豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性及ALS基因突變研究

高新菊,郭秀玲,陳 威,包來倉,馬毅輝,秦光宇,祖均懷,王恒亮

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省作物保護(hù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/河南省生物農(nóng)藥工程研究中心，河南鄭州 450002；2.鄲城縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，河南鄲城 477150； 3.河南省農(nóng)藥檢定站，河南鄭州 450002)

河南省麥田豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性及ALS基因突變研究

高新菊1,郭秀玲2,陳 威1,包來倉3,馬毅輝1,秦光宇1,祖均懷1,王恒亮1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省作物保護(hù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/河南省生物農(nóng)藥工程研究中心，河南鄭州 450002；2.鄲城縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，河南鄲城 477150； 3.河南省農(nóng)藥檢定站，河南鄭州 450002)

為明確河南省部分地區(qū)麥田豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性水平及抗性靶標(biāo)分子機(jī)制，對(duì)18個(gè)豬殃殃種群進(jìn)行了乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)離體活性測(cè)定和ALS基因突變分析。結(jié)果表明，種群PDS-1、ZK-1、LH-1對(duì)苯磺隆產(chǎn)生了較高的抗性，ALS離體活性測(cè)定所得I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，抗性指數(shù)分別為93.92、85.50、68.25。種群ZK-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第590位的C突變?yōu)門，ALS酶第197位脯氨酸(CCC)突變?yōu)榱涟彼?CTC)；種群PDS-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第1 128位的T突變?yōu)锳，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)全部突變?yōu)楣劝彼?GAA)；種群LH-1的6個(gè)檢測(cè)株中，3株未檢測(cè)到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變?yōu)镚，ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變?yōu)楣劝彼?GAG)。靶標(biāo)ALS基因突變可能是豬殃殃對(duì)苯磺隆產(chǎn)生高抗性的重要原因之一。

河南??；豬殃殃；苯磺隆；抗性；ALS基因突變

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)抑制劑類除草劑是一類廣泛應(yīng)用的除草劑，但其作用位點(diǎn)單一，長期、單一施用使雜草對(duì)其比較容易產(chǎn)生抗性[1-2]。截至2016年8月，全球已有159種雜草對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗性，使其成為抗性上升最快的一類除草劑[3]。苯磺隆(tribenuron-methyl)是由美國杜邦(DuPont)公司開發(fā)的一種ALS抑制劑類除草劑，在我國主要用于小麥田一年生闊葉雜草的防除，是我國使用面積最大、期限最長的除草劑品種之一。目前，我國許多地區(qū)的小麥田闊葉雜草，如播娘蒿(Descurainiasophia)[4-6]、薺菜(Capsellabursa-pastoris)[7-9]、麥家公(Lithospermumarvense)[10]等對(duì)苯磺隆的抗性水平已被相繼報(bào)道，其抗性問題日益突出。研究發(fā)現(xiàn)，ALS基因保守區(qū)的氨基酸突變是播娘蒿[4,6]、薺菜[8,11]對(duì)苯磺隆產(chǎn)生高水平抗性的重要原因之一。

豬殃殃(Galiumaparine)為茜草科豬殃殃屬雜草，攀援或蔓生，是我國冬小麥田的主要闊葉雜草之一，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量及收割。目前，豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性水平及抗性分子機(jī)制已被一些學(xué)者報(bào)道。彭學(xué)崗等[12]采用溫室盆栽法和培養(yǎng)皿法測(cè)定了河南、安徽、山東、江蘇、河北、山西、陜西部分地區(qū)的豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性水平，其中，河南省許昌采集點(diǎn)抗藥性最高，溫室盆栽法和培養(yǎng)皿法測(cè)得抗性指數(shù)分別為4.3和2.2倍。Sun等[13]通過對(duì)敏感和抗藥型豬殃殃的ALS測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與敏感型豬殃殃相比，抗藥型ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，這可能是豬殃殃對(duì)苯磺隆產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。目前，就河南省大部分地區(qū)麥田豬殃殃種群對(duì)苯磺隆的抗性水平及抗性分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

本研究擬對(duì)河南省部分小麥主產(chǎn)區(qū)的18個(gè)豬殃殃種群進(jìn)行ALS離體活性測(cè)定和ALS基因突變分析，以明確河南省不同地區(qū)豬殃殃種群對(duì)苯磺隆的抗性水平及抗性靶標(biāo)分子機(jī)制，為制定合理、有效的防治對(duì)策、科學(xué)使用除草劑防治抗藥性雜草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試豬殃殃種子：2013年5月底和2014年5月底采集于平頂山市、周口市等18個(gè)采樣點(diǎn)的小麥田，詳見表1。每個(gè)采樣點(diǎn)面積300～600 m2，所采集的豬殃殃種子混合作為一個(gè)種群。

1.2 方 法

1.2.1 試材培養(yǎng)

在直徑12 cm的塑料盆缽內(nèi)，裝入風(fēng)干過篩、混勻后的壤土，每盆播種經(jīng)0.05%赤霉素處理24 h 后培養(yǎng)至露白的豬殃殃種子20粒，置于人工氣候箱(MGC-350HP型，上海天呈)內(nèi)培養(yǎng)。光暗比14 h/10 h，溫度22 ℃/15 ℃，相對(duì)濕度為75%。出苗后，每盆定苗10株。

1.2.2 ALS離體活性測(cè)定

酶液制備：參考Ray[14]的方法，略有改動(dòng)。將3～5輪葉期豬殃殃地上部分剪碎，取1 g放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮快速研磨成細(xì)粉，再加入4 mL勻漿緩沖液[含1 mmol·L-1丙酮酸鈉(美國Amresco公司)，0.5 mmol·L-1氯化鎂，0.5 mmol·L-1TPP(氯化硫胺素焦磷酸鹽，索萊寶)和10 μmol·L-1FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸，索萊寶)的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液]快速研磨，置于離心管中，用勻漿緩沖液定容至8 mL，用SORVALL Stratos冷凍型高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技)于25 000 r·min-1、4 ℃下離心20 min；取上清液，緩慢加入硫酸銨晶體至50%飽和度，沉淀2 h后，于25 000 r·min-1、4 ℃下離心30 min；棄上清液，將沉淀用6 mL重懸浮緩沖液(含20 mmol·L-1丙酮酸鈉和0.5 mmol·L-1氯化鎂的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液)重新懸浮，即得酶液，4 ℃保存，待測(cè)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

ALS活力測(cè)定：參考范志金等[15]的方法。在10 mL具塞試管中加入0.9 mL酶反應(yīng)液(含20 mmol·L-1丙酮酸鈉，0.5 mmol·L-1氯化鎂，0.5 mmol·L-1TPP和10 μmol·L-1FAD的0.1 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液)、1 mL酶液和0.1 mL不同濃度的苯磺隆(98%原藥，山東華陽科技)藥液，使苯磺隆終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol·L-1，以加入0.1 mL蒸餾水的處理為對(duì)照。搖勻后置于35 ℃恒溫水浴中，1 h后加入0.2 mL 3 mol·L-1的硫酸終止反應(yīng)；60 ℃水浴15 min后，分別加入1 mL 0.5%肌酸和5% α-萘酚(用2.5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液配制)；60 ℃水浴顯色15 min，迅速置于冰浴中冷卻1 min，用752紫外可見分光光度計(jì)于525 nm 波長下測(cè)定吸光度值A(chǔ)525。計(jì)算各處理的ALS相對(duì)活性，ALS相對(duì)活性=不同苯磺隆濃度處理的A525/空白對(duì)照的A525×100%。

表1 豬殃殃采集地點(diǎn)與苯磺隆用藥歷史Table 1 Collecting sites of Galium aparine and their background of tribenuron-methyl application

1.2.3ALS基因突變分析

引物設(shè)計(jì)：根據(jù)豬殃殃ALS基因序列(GenBank登錄號(hào)：GU377313)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(表2)，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，擴(kuò)增片段包含目前已報(bào)道抗性雜草ALS基因保守區(qū)的8個(gè)突變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)應(yīng)擬南芥(Arabidopsisthaliana)的ALS氨基酸分別是Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654[16-18]。

DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序：用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技)對(duì)18個(gè)種群的3～5輪葉期豬殃殃葉片進(jìn)行單株DNA提取，每個(gè)種群6株。每個(gè)DNA樣本的PCR擴(kuò)增(9700型PCR擴(kuò)增儀，美國ABI公司)重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系為：Taq酶(寶生物)0.25 μL、10×PCR Buffer 5 μL、25 mmol·L-1MgCl23 μL、dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各2 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技)回收后送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。將測(cè)序完成的目的DNA片段序列與擬南芥敏感生物型的ALS基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。

表2 擴(kuò)增豬殃殃ALS基因片段的引物Table 2 Primers for ALS gene of Galium aparine

1.3 數(shù)據(jù)處理

ALS離體活性測(cè)定得到的數(shù)據(jù)參考Seefeldt等[19]的方法進(jìn)行分析。使用Sigma Plot 12.5軟件中非線性回歸方程y=C+(D-C)/[1+(x/I50)b]進(jìn)行劑量反應(yīng)曲線擬合，計(jì)算各種群的I50。式中，y為特定除草劑用量下所測(cè)雜草的ALS相對(duì)活性；C為劑量反應(yīng)下限；D為劑量反應(yīng)上限；x為除草劑用量；I50為豬殃殃不同生物型ALS活性被抑制50%時(shí)的苯磺隆濃度；b為斜率。

抗性指數(shù)(RI)=抗性種群的I50/敏感種群的I50。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下苯磺隆對(duì)豬殃殃ALS活性的影響

由表3可知，豬殃殃種群XX-1的ALS對(duì)苯磺隆最敏感，其I50僅為0.12 μmol·L-1(抗性指數(shù)為1.00)；豬殃殃種群PDS-1、ZK-1、LH-1對(duì)苯磺隆的I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，其抗性指數(shù)分別為93.92、85.50、68.25，表明這些采集點(diǎn)的豬殃殃種群的ALS對(duì)苯磺隆的敏感性明顯降低；其他采集點(diǎn)豬殃殃種群的I50在0.20～1.14 μmol·L-1之間，抗性指數(shù)在1.67～9.50之間。

2.2 不同豬殃殃種群ALS基因突變分析

與擬南芥敏感生物型及不同豬殃殃種群間的ALS基因?qū)Ρ确治隹芍?表4)，豬殃殃種群ZK-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第590位堿基C突變?yōu)門，導(dǎo)致ALS酶的第197位脯氨酸(CCC)突變?yōu)榱涟彼?CTC)；種群PDS-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第1 128位的T突變?yōu)锳，導(dǎo)致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變?yōu)楣劝彼?GAA)；種群LH-1的6個(gè)檢測(cè)株中，3株未檢測(cè)到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變?yōu)镚，導(dǎo)致ALS酶第376位天冬氨酸(GAT)突變?yōu)楣劝彼?GAG)；其他種群均未檢測(cè)到突變。

表3 苯磺隆對(duì)不同豬殃殃種群ALS離體活性的抑制作用Table 3 Inhibition of tribenuron-methyl on ALS activity in vitro of different populations of Galium aparine

C：劑量反應(yīng)下限；D：劑量反應(yīng)上限；I50：ALS離體活性抑制中濃度；b：斜率；R：相關(guān)系數(shù)；RI：抗性指數(shù)。

CandD：Lower and upper limit of dose-dependent response,respectively;I50：The tribenuron-methyl concentration required for 50% inhibition of ALS activityinvitro;b：The slope at theI50;R：Correlation coefficient;RI：Resistance index.

表4 豬殃殃種群ALS基因突變點(diǎn)及相應(yīng)的氨基酸Table 4 Mutant of ALS gene and amino acid sequences among different populations of Galium aparine

3 討 論

離體條件下，靶標(biāo)酶相對(duì)活性測(cè)定可以反映供試雜草對(duì)除草劑的抗藥性[20]。本研究中，由于種群XX-1的采集點(diǎn)從未施用過除草劑，其ALS離體活性的I50僅為0.12 μmol·L-1，在供試的18個(gè)種群中最低，對(duì)苯磺隆比較敏感；而豬殃殃種群PDS-1、ZK-1、LH-1的I50分別為11.27、10.26、8.19 μmol·L-1，相對(duì)于種群XX-1的抗性指數(shù)分別為93.92、85.50、68.25，表明這些采集點(diǎn)豬殃殃種群的ALS對(duì)苯磺隆有較高的抗性。這與Han等[21]對(duì)播娘蒿ALS的研究結(jié)果類似。

雜草體內(nèi)除草劑作用位點(diǎn)發(fā)生改變、雜草代謝解毒能力增強(qiáng)、雜草的屏蔽作用或與作用位點(diǎn)的隔離作用是雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性的三大主要機(jī)制，其中，靶標(biāo)基因突變是最重要的原因之一[22]。本研究通過對(duì)不同豬殃殃種群的ALS基因片段擴(kuò)增并測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與敏感型擬南芥和豬殃殃的ALS相比，豬殃殃種群ZK-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第950位堿基C突變?yōu)門，使相應(yīng)的197位脯氨酸為亮氨酸；種群PDS-1的6個(gè)檢測(cè)株中，ALS基因第1 128位的T突變?yōu)锳，使相應(yīng)的376位天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?；種群LH-1的6個(gè)檢測(cè)株中，3株未檢測(cè)到突變，另外3株的ALS基因第1 128位的T突變?yōu)镚，使相應(yīng)的376位天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?，這可能是導(dǎo)致豬殃殃對(duì)苯磺隆產(chǎn)生高抗性的重要原因之一。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)抗苯磺隆豬殃殃的ALS第574位色氨酸被甘氨酸取代，本研究中ALS第197位脯氨酸被亮氨酸取代，第376位天冬氨酸被谷氨酸取代是在抗苯磺隆豬殃殃中首次發(fā)現(xiàn)。

本課題組對(duì)供試的豬殃殃種群進(jìn)行了整株抗性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其抗性水平與ALS離體活性測(cè)定所得抗性水平基本一致。本研究中靶標(biāo)ALS基因檢測(cè)明確了河南省部分地區(qū)麥田豬殃殃對(duì)苯磺隆的抗性機(jī)理，但有關(guān)解毒代謝酶與抗藥性的關(guān)系、交互抗性等問題有待于進(jìn)一步研究。

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ResistancetoTribenuron-MethylandALSMutationsinGaliumaparineinWheatFieldsinHenanProvince

GAOXinju1,GUOXiuling2,CHENWei1,BAOLaicang3,MAYihui1,QINGuangyu1,ZUJunhuai1,WANGHengliang1

(1.Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/IPM Key Laboratory in Southern Part of North China for Ministry of Agriculture/ International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan/Biological Pesticides Engineering Research Center of Henan Province/Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou,Henan 450002,China; 2.Dancheng Institute of Agricultural Sciences,Dancheng,Henan 477150,China; 3.Institute for the Control of Agrochemicals of Henan province,Zhengzhou,Henan 450002,China)

To investigate the resistance levels and molecular mechanism ofGaliumaparineto tribenuron-methyl in winter wheat fields in Henan province,eighteenGaliumaparinepopulations were assessed by acetolactate synthase(ALS) activityinvitroassay and analysis ofALSmutations.The results showed thatGaliumaparinepopulations PDS-1,ZK-1,and LH-1 had higher levels of resistance than those of others,and theirI50of ALS activityinvitroassay were 11.27,10.26 and 8.19 μmol·L-1,respectively,and the corresponding relative resistance index were 93.92,85.50 and 68.25,respectively.ALSsequences analysis indicated that C→T at 590th base proline(CCC) at position 197 of the ALS was substituted by leucine(CTC) in six PDS-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAA) in six ZK-1 plants.Aspartic acid(GAT) at position 376 was substituted by glutamic acid(GAT) in three LH-1 plants.The Pro197 or Asp376 mutations in ALS could be one of important reasons for the observed high resistance to tribenuron-methyl.

Henan province;Galiumaparine; Tribenuron-methyl; Resistance;ALSmutation

時(shí)間：2017-11-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171114.1028.032.html

2017-01-06

2017-04-26

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項(xiàng)(2013ZZ22,2016ZC43)

E-mail：gaoxj19@qq.com(高新菊)；E-mail:hlw2000@126.com(王恒亮，與第一作者同等貢獻(xiàn))

王恒亮(E-mail:hlw2000@126.com)

S512.1；S451.1

A

1009-1041(2017)11-1518-07