高效液相色譜法測(cè)定丙戊酸鎂血藥濃度的方法改進(jìn)及質(zhì)控評(píng)價(jià)

楊穎達(dá)，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430000）

高效液相色譜法測(cè)定丙戊酸鎂血藥濃度的方法改進(jìn)及質(zhì)控評(píng)價(jià)

楊穎達(dá)，何秋月，李德秀，王天

（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430000）

目的 改進(jìn)測(cè)定人血清中丙戊酸鎂濃度的高效液相色譜法。方法 血清樣品經(jīng)1.0 mol／L硫酸沉淀，以環(huán)己甲酸為內(nèi)標(biāo)，以2－溴 －4′－硝基苯乙酮為衍生試劑。采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為Hypersil C18柱（200 mm×4.6 mm，10 m），流動(dòng)相為甲醇－水（81∶19），檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速為1.0 mL／min，柱溫為25℃。并對(duì) 2016年度醫(yī)院216份質(zhì)控樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 內(nèi)標(biāo)和丙戊酸鎂衍生物的保留時(shí)間分別為 4.1 min 和 5.4 min，質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為 11.0 ～200.0 g／mL（r＝0.999 3），平均回收率為 98.2% ～102.5%，批內(nèi)、批間精密度 RSD＜2.3%，穩(wěn)定性試驗(yàn) RSD＜3.9%，2016年度質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)批間 RSD＜15%，符合2015年版《中國(guó)藥典(四部)》要求。2016年度質(zhì)控基本符合正態(tài)分布，所有質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均為在控。結(jié)論 改進(jìn)后的方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于臨床丙戊酸鎂血藥濃度監(jiān)測(cè)，室內(nèi)質(zhì)控評(píng)價(jià)保證了血藥濃度監(jiān)測(cè)質(zhì)量。

丙戊酸鎂；高效液相色譜法；血藥濃度監(jiān)測(cè)；質(zhì)控評(píng)價(jià)

丙戊酸鎂（magnesium valproate）是繼丙戊酸鈉后的臨床一線(xiàn)抗癲癇藥[1]。近年來(lái)，用于治療偏頭痛[2－3]、精神分裂癥攻擊行為[4－5]、腦卒中后抑郁[6]等，療效較好。由于該藥在使用過(guò)程中存在惡心、嘔吐、嗜睡、皮疹、水腫等不良反應(yīng)[7－8]，合并用藥的慢性病患者較多[3，9]，有使用不當(dāng)引起的中毒報(bào)告[10]。依據(jù)其療效和不良反應(yīng)發(fā)生率與血藥濃度有一定的相關(guān)性[1]，定期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其血藥濃度是其應(yīng)用安全有效的保障。目前，已報(bào)道的質(zhì)量濃度測(cè)定方法主要有色譜分析法，包括氣相色譜[11－12]和液相色譜[13－14]。本研究中在單位實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下，參考文獻(xiàn)[13]，改進(jìn)并建立了測(cè)定患者血清丙戊酸鎂濃度的高效液相色譜（HPLC）法，并對(duì)2016年測(cè)定的質(zhì)量控制進(jìn)行了評(píng)價(jià)，準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，可為臨床合理用藥提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（Waters 2998光電二極管陣列檢測(cè)器，Empower 3工作站，美國(guó)Waters公司）；Discovery DV215CD型電子分析天平（美國(guó)奧豪斯公司）；XH－CX型漩渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠(chǎng)）；NW－10UV型超純水機(jī)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；SC－2556型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥

丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 101151－201001）；環(huán)己甲酸（梯希愛(ài)＜上海＞化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；2－溴－4′－硝基苯乙酮（上海弘順生物科技有限公司）；甲醇（美國(guó)天地有限公司），其他試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司）；空白血清（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18柱（200 mm × 4.6 mm，10 μm）；流動(dòng)相：甲醇 －水（81 ∶19）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1.0 mL ／min；柱溫：25 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL。定量分析：內(nèi)標(biāo)峰面積定量計(jì)算。

2.2 溶液制備

丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品血清及質(zhì)控血清：稱(chēng)取丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品11.0 mg，精密稱(chēng)定，用甲醇定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為110.0 μg／mL的貯備液，精密吸取系列體積溶液，置5 mL離心管中，氮吹儀吹干甲醇，置4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。待測(cè)定時(shí)向離心管中分別加入200 μL空白血清，制成系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品血清及質(zhì)控血清。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取環(huán)己甲酸5 mg，精密稱(chēng)定，用正己烷定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為50 g／L的內(nèi)標(biāo)溶液。

衍生化試劑：稱(chēng)取2－溴－4′－硝基苯乙酮5.0 mg，精密稱(chēng)定，用乙腈定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為0.5 g／L的溶液。

三乙胺乙腈液：精密吸取三乙胺0.2 mL，用乙腈稀釋至100 mL，即得。

以上所有配制溶液均置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理

取離心后的樣品血清 200 μL，加 1.0 mol／L 硫酸200 μL酸化，用500 μL環(huán)己甲酸正己烷內(nèi)標(biāo)液萃取離心，取上層有機(jī)相 200 μL，加三乙胺乙腈液 200 μL堿化，加衍生化試劑 50 μL，密置，50 ℃水浴 20 min，氮?dú)獯蹈?，?00 μL甲醇溶解殘?jiān)?，?0 μL進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 方法學(xué)考察

分離度與專(zhuān)屬性試驗(yàn)：按擬訂色譜條件測(cè)定，結(jié)果環(huán)己甲酸和丙戊酸鎂衍生物保留時(shí)間分別為4.1 min和 5.4 min，與血漿中的其他成分色譜峰分離度超過(guò)1.5，各成分基線(xiàn)分離良好，無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和最低檢測(cè)限確定：取 11.0，22.0，44.0，66.0，132.0，200.0 μg ／mL 系列質(zhì)量濃度丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品血清，按2.3項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，以丙戊酸鎂衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品血清質(zhì)量濃度(C，μg／mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 Y＝0.008 7 C ＋0.040 8， r＝0.999 3(n＝6)。結(jié)果表明，丙戊酸鎂質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍為11.0 ～200.0 μg／mL，血清中最低檢測(cè)限為 11.0 μg／mL，最小定量限為 4 μg／mL（S ／N≥3）。

回收率及精密度試驗(yàn)：取含丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品低、中、高 3 個(gè)質(zhì)量濃度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的質(zhì)控血清，按2.3項(xiàng)下方法處理，分別于1 d內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)測(cè)定丙戊酸鎂濃度，計(jì)算批內(nèi)及批間的回收率，批內(nèi)及批間的精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝5，%)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取含丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（11.0，66.0，200.0 μg ／mL）的質(zhì)控血清各 2 mL，室溫放置，分別于0，4，21 h時(shí)測(cè)定丙戊酸鎂的質(zhì)量濃度。另配上述質(zhì)量濃度血清樣品各3份，每份2 mL，在4℃冰箱中放置，分別在2，4，7 d取樣，測(cè)定丙戊酸鎂的質(zhì)量濃度。結(jié)果見(jiàn)表2，表明丙戊酸鎂血清樣品在室溫放置21 h內(nèi)穩(wěn)定，在4℃冷凍條件下放置7 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 質(zhì)控評(píng)價(jià)

2.5.1 回顧性質(zhì)控圖分析

2016年1月至12月共測(cè)定質(zhì)控樣本216份，其中低(11.0 μg ／mL)、中(66.0 μg ／mL)、高(200.0 μg ／mL)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本各72個(gè)。以各質(zhì)量濃度質(zhì)控樣本質(zhì)量濃度（均值）為“靶值線(xiàn)”，即；以±2 s為“警告線(xiàn)”；以±3 s為“失控線(xiàn)”。以測(cè)定批次為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制質(zhì)控圖，詳見(jiàn)圖2。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)基本分布在“靶值線(xiàn)”兩側(cè)，無(wú)數(shù)據(jù)超出±3 s“失控線(xiàn)”，故所有質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均為“在控”。但低質(zhì)量濃度質(zhì)控有2次超出±2 s，提示警告2次；中質(zhì)量濃度質(zhì)控有4次超出±2 s，提示警告4次；高質(zhì)量濃度質(zhì)控有2次超出±2 s，提示警告2次。3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣本都出現(xiàn)了連續(xù)幾點(diǎn)落在“靶值線(xiàn)”下側(cè)，提示可能存在一定程度的系統(tǒng)誤差，可能與質(zhì)控樣本的批次配制或新標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作有關(guān)。

表2 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

圖2 2016年質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分布圖

2.5.2 數(shù)據(jù)分布

圖3 各質(zhì)量濃度質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分布比例圖

2.5.3 年度質(zhì)控結(jié)果

將2016年1月至12月質(zhì)控監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)，求得其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、回收率、RSD，詳見(jiàn)表3。結(jié)果表明，低、中、高3組質(zhì)量濃度的實(shí)測(cè)值在標(biāo)示值的±15%以?xún)?nèi)，批間 RSD小于15%，符合2015年版《中國(guó)藥典（四部）》中“9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，提示改進(jìn)的方法測(cè)定丙戊酸鎂血藥濃度的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和精密度均良好。

表3 2016年度質(zhì)控結(jié)果

3 討論

3.1 色譜件選擇

本研究中丙戊酸鎂標(biāo)準(zhǔn)品血清及質(zhì)控血清的配制可有效避免溶液保存引起的系統(tǒng)誤差，且無(wú)需復(fù)融質(zhì)控血清，可簡(jiǎn)化操作步驟。為除去樣品血清中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的干擾，要充分加入硫酸溶液，樣品血清與硫酸體積比最好為1∶1。參考文獻(xiàn)[13]，考察流動(dòng)相條件時(shí)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇－水（75∶25）時(shí)環(huán)己甲酸和丙戊酸鎂衍生物保留時(shí)間分別為 5.8 min和 9.0 min，耗時(shí)較長(zhǎng)；選擇甲醇－水（81∶19）時(shí)保留時(shí)間分別為4.1 min和5.4 min，分離度(R)＞ 1.5。提示內(nèi)標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)品均與血清中的其他組分色譜峰能很好地分離，檢測(cè)時(shí)間可由原來(lái)的10 min縮短至6 min，因而流動(dòng)相選擇甲醇－水(81∶19)將色譜條件改進(jìn)為后者。衍生化反應(yīng)在50℃水浴必須保證反應(yīng)20 min，反應(yīng)充分完全，否則將影響檢測(cè)結(jié)果。文獻(xiàn)[13]中采用內(nèi)標(biāo)峰高法進(jìn)行定量分析，由于峰高法受柱效、峰形、保留時(shí)間影響較大，而峰面積法受上述影響不大，因而本研究中采用內(nèi)標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量計(jì)算。

3.2 質(zhì)控評(píng)價(jià)

本研究中所測(cè)定丙戊酸鎂血藥濃度的批內(nèi)、批間及年度質(zhì)控樣本的精密度和準(zhǔn)確度均符合2015年版《中國(guó)藥典（四部）》“9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”的規(guī)定。年度質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)基本成正態(tài)分布，提示誤差來(lái)源主要為隨機(jī)誤差。盡管質(zhì)控圖提示可能有一定的系統(tǒng)誤差存在，但所有質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)仍在“在控”范圍內(nèi)，因此本方法通過(guò)室內(nèi)質(zhì)控保證了血藥濃度監(jiān)測(cè)質(zhì)量。年度質(zhì)控評(píng)價(jià)提示可能出現(xiàn)的系統(tǒng)誤差將密切關(guān)注，采取儀器校正、規(guī)范操作、內(nèi)標(biāo)對(duì)照等措施，及時(shí)糾正，以便為臨床提供快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠的血藥濃度監(jiān)測(cè)服務(wù)。

[1]肖 波，謝光潔，唐敦立.丙戊酸鎂治療癲痛的臨床療效及其血濃度觀察[J].湖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1987，12(2)：161 － 164.

[2]杜文兵，羅遠(yuǎn)帶，甑麗芳，等.丙戊酸鎂治療偏頭痛有效性和安全性的Meta分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11(5)：560 － 561.

[3]胡昌盛，周良斌.丙戊酸鎂聯(lián)合文拉法辛防治偏頭痛54例的臨床療效觀察[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18(10)：62 －63.

[4]李 瑋，穆少麗.丙戊酸鎂緩釋片治療精神分裂癥攻擊行為的增效作用及安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥業(yè)，2016，25(13)：51－53.

[5]馬希威.丙戊酸鎂對(duì)精神分裂癥的輔助治療作用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5(12)：43 － 44.

[6]孫 陽(yáng)，朱曉波，金薇薇.丙戊酸鎂緩釋片聯(lián)合帕羅西汀治療老年腦卒中后抑郁患者的臨床療效觀察[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2016，24(6)：100 －103.

[7]李春生.丙戊酸鎂緩釋片治療癲癇的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(2)：71 － 72.

[8]李 祥 .丙戊酸鎂致水腫一例[J].精神醫(yī)學(xué)雜志，2011，24(1)：10.

[9]歐國(guó)濤.丙戊酸鎂緩釋片聯(lián)合拉莫三嗪治療癲癇強(qiáng)直性陣攣發(fā)作的療效評(píng)估[J].臨床合理用藥，2014，7(4)：35 －36.

[10]王樹(shù)陽(yáng).丙戊酸鎂中毒28例臨床分析[J].四川精神衛(wèi)生，1996，9(4)：272.

[11]黃希順，潘更毅，鄭惠良.丙戊酸鎂治療兒童偏頭痛的療效及血藥濃度監(jiān)測(cè)[J].實(shí)用兒科臨床雜志，1999，14(5)：287.

[12]胡曼玲，黃 松，林肖波.血清中丙戊酸鎂濃度的氣相色譜測(cè)定法[J].色譜，1987，5(6)：362 －364.

[13]郝潤(rùn)喜，閆彩萍.高效液相色譜－柱前衍生法測(cè)定丙戊酸鎂血藥濃度[J].藥物分析雜志，1997，17(3)：172 －174.

[14]謝 華，王 榮，賈正平，等.液－質(zhì)聯(lián)用監(jiān)測(cè)丙戊酸鎂臨床血藥濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(8)：630 － 632.

Improvement of HPLC for Determination of Serum Concentration of Magnesium Valproate and Assesssment of Quality Control

Yang Yingda,He Qiuyue,Li Dexiu,Wang Tianqi
(Department of Pharmacy,Hubei Provincial Hospital of Itegrated Chinese＆ Western Medicine,Wuhan,Hubei,China 430000)

Objective To improve the HPLC method for determining the concentration of magnesium valproate in human serum.Methods The serum was precipitated by sulfuric acid(1.0 mol／L),the cyclohexane carboxylic acid was used as an internal standard and 2 －bromo － 4′－ nitroacetophenone was used as derivation agent.The HPLC method was used,the chromatographic column was C18column(200 mm × 4.6 mm,10 μm),the mobile phase was methanol－ water(81:19),the detection wavelength was 265 nm,the flow rate was 1.0 mL ／min,and the column temperature was 25 ℃ .Totally 216 quality control samples of the hospital in 2016 were statistically analyzed.Results The retention time of cyclohexanecarboxylic acid derivate and magnesium valproate derivative were 4.1 min and 5.4 min,respectively,the linearrange was 11.0 － 200.0 μg／mL(r＝ 0.999 3),and the average recovery was98.2% －102.5%,the RSDs of within batch and between batch were less than 2.3%,RSD of stability was less than 3.9%,RSD of quality control data in 2016 were less than 15%,which accorded with the requirement of Chinese Pharmacopoeia(2015 Edition,Volume Ⅳ).The quality controlbasically accorded with the normaldistribution in 2016,and allthe quality controldata were in control.Conclusion The improved method is simple,rapid and accurate,it is suitable for monitoring the concentration of magnesium valproate in serum,and the internal quality control ensures the monitoring quality of serum concentration.

magnesium valproate;HPLC;blood concentration monitoring;assesssment of quality control

R914.1；R971＋.6

A

1006－4931(2017)23－0010－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.23.003

武漢藥學(xué)會(huì)醫(yī)院藥學(xué)研究基金[武藥會(huì)201502003]。

楊穎達(dá)（1981－），女，博士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)，(電子信箱)502099281＠qq.com。

王天 ，男，大學(xué)本科，主管藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)，（電子信箱）jeff200082＠163.com。

2017－07－19)