大孔樹脂純化紅腰豆總黃酮的工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性比較

黎 英 曾珍清 張 薇 鄭蘭香 李子月 陳雪梅

(龍巖學(xué)院；福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，龍巖 364012)

大孔樹脂純化紅腰豆總黃酮的工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性比較

黎 英 曾珍清 張 薇 鄭蘭香 李子月 陳雪梅

(龍巖學(xué)院；福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，龍巖 364012)

紅腰豆 總黃酮 大孔樹脂 響應(yīng)面 抗氧化活性

紅腰豆(Phaseolus vulgaris)外形似“雞腰子”，色澤紅潤，為蝶形花科菜豆屬纏繞植物，原產(chǎn)于南美洲，現(xiàn)在中國廣泛種植[1]。紅腰豆富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素及鐵、磷、鎂等營養(yǎng)成分，且含有較高黃酮類、多糖類和紅色素類等活性物質(zhì)[2-4]，《中國藥典》中記載，紅腰豆味甘平，性溫，有補(bǔ)血益氣、消腫、軟化血管及降血脂和抗風(fēng)濕、抗輻射等功效[5]。

近年來，對紅腰豆的開發(fā)利用研究主要集中在營養(yǎng)保健、休閑食品和食療等方面，僅有少量研究針對紅腰豆?fàn)I養(yǎng)成分分析和活性成分提取進(jìn)行探討[2-4]，而紅腰豆總黃酮提取物的純化及對體外抗氧化作用鮮見報道，因此對其理化性質(zhì)及生物活性方面的研究有待進(jìn)一步深入。

樹脂吸附分離技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用的一種分離、純化天然產(chǎn)物有效成分的方法，可顯著提高有效成分的相對含量，具有價廉、環(huán)保、選擇性好、操作簡單、吸附速度快、吸附容量大、解吸容易及可重復(fù)使用等優(yōu)點[6-7]。目前，有關(guān)大孔吸附樹脂分離純化植物黃酮類化合物的研究較多[8，12，14]，但黃酮適用的樹脂類型和吸附解吸條件參數(shù)因不同植物黃酮化合物的組成及極性強(qiáng)弱等性質(zhì)不同而有所不同。

筆者在前期試驗獲得紅腰豆總黃酮粗提物基礎(chǔ)上，通過8種大孔樹脂對紅腰豆總黃酮的靜態(tài)吸附和解吸性能的比較，篩選出分離純化紅腰豆總黃酮提取物的最佳樹脂，并以吸附率和解吸率為評價指標(biāo)，通過動態(tài)吸附解吸單因素試驗及利用Design-Expert軟件優(yōu)化工藝條件，獲得最佳工藝參數(shù)，同時探討了紅腰豆總黃酮化合物純化前后的體外抗氧化效果，以期為紅腰豆總黃酮有效富集、生物活性研究及紅腰豆資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅腰豆：龍巖市農(nóng)科所提供；蘆丁、DPPH：美國Sigma公司；樹脂NKA-9、DA-201、S-8、DM-301、AB-8、HPD-300、D-101、HPD-100：廈門柏嘉生物科技有限公司；硝酸鋁、鄰苯三酚、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

UV-1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；JOYN-H1C1型實驗室微波爐：上海喬躍電子有限公司；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵、RE-2002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鄭州杜甫儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；SHA-C型水浴恒溫振蕩器：金壇市恒豐儀器廠；TB-114型電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Φ12 mm×200 mm和Φ30 mm×650 mm玻璃層析柱、BSZ-100自動部分收集器、DHL-A恒流泵：上海滬西分析儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅腰豆總黃酮粗提液的制備

按文獻(xiàn)[4]獲得制備紅腰豆總黃酮的工藝條件，即稱取50.0 g預(yù)處理過的紅腰豆粉，采用微波提取[乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，液料比40:1(mL/g)，微波功率560 W，微波時間8 min]，濾渣重復(fù)提取2次后減壓抽濾，合并濾液，離心(3 000 r/min，10 min)，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮(-0.09 MPa，45 ℃)除去其中乙醇成分，所得濃縮液冷凍干燥(<20 Pa，-40 ℃，48 h)備用。

1.3.2 紅腰豆總黃酮測定方法

采用紫外可見分光光度法，參考文獻(xiàn)[4]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，NaNO2-AI(NO3)3-NaOH為顯色劑，進(jìn)行回歸分析得方程，如式(1)。在0～0.035 mg/mL線性關(guān)系良好。取1 mL濃縮供試提取液稀釋100倍后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作顯色，測吸光度值(510 nm波長處)，計算紅腰豆總黃酮含量。

A=11.982C+0.003 6R2=0.999 4

(1)

1.3.3 大孔樹脂的篩選

將8種大孔樹脂用95%乙醇浸制，傾去懸浮小顆粒。濕法裝柱(Φ30 mm×650 mm)，先用95%乙醇以0.5 mL/min洗脫至流出液加等量去離子水不變渾濁，及無醇味。然后用5% HCl以0.5 mL/min洗脫8 h后去離子水洗至中性，再用5% NaOH溶液同樣處理。去離子水浸泡備用。

分別稱取8種處理好的大孔樹脂各2.0 g，于150 mL具塞磨口錐形瓶中，依次加入50.0 mL紅腰豆總黃酮粗提液，振蕩(25 ℃，120 r/min，12 h)，將樹脂抽濾。用去離子水沖洗濾干后的樹脂3～5次，再加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇50.0 mL振蕩12 h，每隔一段時間從上清液取樣并測定計算溶液中黃酮質(zhì)量濃度，各樹脂吸附率、吸附量和解吸率按式(2)～式(4)計算。

(2)

(3)

(4)

式中，m為樹脂質(zhì)量/g；C0為粗體液黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL；C1為平衡后濾液黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL；C2解吸液黃酮質(zhì)量濃度/mg/mL；V0為上樣液體積/mL；V1為平衡后濾液體積/mL；V2為洗脫液體積/mL。

1.3.4 AB-8樹脂對紅腰豆總黃酮純化條件優(yōu)化

1.3.4.1 動態(tài)吸附和解吸的單因素試驗

室溫條件下，玻璃層析柱(Φ12 mm×200 mm，柱床體積約20 mL)中濕法裝入預(yù)處理好的AB-8樹脂(約3/4柱高)，預(yù)設(shè)上樣質(zhì)量濃度2.0 mg/mL，上樣液pH 6.0，上樣流速1.0 mL/min，上樣體積6.0 BV為吸附工藝參數(shù)中的常規(guī)量，進(jìn)行上柱，收集，測定；按確定的最佳吸附條件上柱，待樹脂吸附飽和后，先用50 mL去離子水以2～3 mL/min流速沖洗樹脂柱至流出液無色(除多糖及蛋白質(zhì)等雜質(zhì))，再預(yù)設(shè)乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，洗脫流速2.0 mL/min，洗脫體積3.0 BV為解吸工藝參數(shù)中的常規(guī)量，進(jìn)行洗脫，收集，測定，以7個單因素變量替換動態(tài)吸附和解吸工藝參數(shù)中相應(yīng)的常規(guī)量。依次考察紅腰豆總黃酮提取液的動態(tài)吸附和解吸效果[8]。設(shè)計水平見表1。

表1 單因素與水平編碼

1.3.4.2 動態(tài)吸附和解吸條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用軟件Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken設(shè)計試驗，以吸附率及解吸率為響應(yīng)值，以上樣液質(zhì)量濃度、上樣量、上樣流速和上樣液pH及乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫劑用量和洗脫流速為吸附和解吸操作中的自變量[9]，因素水平見表2。

表2 吸附和解吸試驗自變量因素與水平編碼

1.3.5 紅腰豆總黃酮體外抗氧化試驗

1.3.5.1 紅腰豆總黃酮粗提物和精提物試驗樣品制備方法

按優(yōu)化試驗得到的AB-8樹脂純化分離條件處理紅腰豆總黃酮粗提液，收集洗脫液，離心，蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥。用60%的乙醇配制成不同濃度的紅腰豆總黃酮粗提物和精提物溶液(簡稱待測液)，比較純化前后的黃酮含量和抗氧化活性[10-11]。

1.3.5.2 對DPPH·自由基清除作用測定

在各試管中取2.0 mL待測液加入2.0 mL 0.5 mmol/L DPPH乙醇溶液，搖勻，避光放置30 min，離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，以無水乙醇為參比液調(diào)零，于517 nm波長處測吸光度(Ai)。空白組以2.0 mL無水乙醇代替樣品測定吸光度(A0)，同時測對照組2.0 mL樣品液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度(Aj)，按式(5)計算。

(5)

1.3.5.3 對·OH清除作用測定

建立Fenton反應(yīng)體系模型，于15 mL具塞比色管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL，立即搖勻，水浴(37 ℃、15 min)，取出，加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，再分別加入不同質(zhì)量濃度的待測液，用去離子水定容至15 mL搖勻后繼續(xù)水浴加熱15 min，于510 nm波長處分別測吸光度A1(樣品液)、A0(去離子水代替樣品液)、A2(本底吸光度，即不加H2O2溶液)，根據(jù)式(6)計算清除率。

(6)

在堿性條件下利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)比色法檢測，于15 mL具塞試管中，加入4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L，pH 8.2)，分別加入不同質(zhì)量濃度的待測液，25 ℃水浴20 min，加入預(yù)熱至25 ℃的10 mmol/L鄰苯三酚溶液2.0 mL，混勻放置4 min后，立即滴加2滴10 mol/L HCl溶液終止體系的反應(yīng)，加去離子水定容，在325 nm波長處分別測定吸光度A1(樣品液)、A0(去離子水代替樣品溶液)、A2(不加鄰苯三酚溶液)，根據(jù)式(7)計算清除率。

(7)

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理方法

每組試驗做3次平行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 20.0軟件和Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂類型的確定

從圖1可看出，8種樹脂均能在較短時間內(nèi)完成對紅腰豆總黃酮的吸附和解吸作用，隨著時間的延長,吸附和解吸動力學(xué)曲線逐漸趨于平緩，吸附和解吸作用分別在4 h和2 h左右基本達(dá)到平衡。從吸附率看，樹脂DA-201和AB-8始終優(yōu)于其他樹脂，而解吸率較高的樹脂為HPD-100、AB-8和HPD-300。

圖1 8種大孔樹脂的靜態(tài)吸附、解吸曲線

從表3可以看出，8種樹脂對紅腰豆總黃酮均有一定的吸附量，但其吸附和解吸性能差異較大，其中吸附量最大的為DA-201，AB-8次之，S-8最小，解吸率最大的是AB-8，D-101最小。通常樹脂的篩選要綜合考慮樹脂的極性、比表面積、孔徑等因素，當(dāng)樹脂孔徑為被吸附物分子大小的多倍數(shù)時，吸附效果較好；此外，樹脂的極性與被吸附物的極性相近或相同時，吸附性能最好。而多數(shù)黃酮類化合物分子具有一定親水性和極性，極性或弱極性樹脂對黃酮吸附效果相對較好[12]，如DA-201、AB-8，但兩者吸附量差異不顯著(P>0.05)；不過AB-8樹脂解吸率較高，可能是由于其孔徑、比表面積較大，更利于解吸?？紤]到樹脂對紅腰豆總黃酮類化合物的分離富集效果和洗脫難易，故選定AB-8大孔樹脂作進(jìn)一步研究。

表3 8種大孔樹脂對紅腰豆總黃酮靜態(tài)吸附、解吸性能比較

注：同一列中不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 AB-8樹脂分離純化紅腰豆總黃酮動態(tài)吸附解吸條件優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

2.2.1.1 動態(tài)吸附過程各因素對大孔樹脂AB-8吸附效果的影響

從圖2可看出，上樣液質(zhì)量濃度的吸附率，隨質(zhì)量濃度增加先上升后下降。當(dāng)質(zhì)量濃度在3.0～5.0 mg/mL時變化幅度不大，之后快速下降。上樣質(zhì)量濃度較小時吸附率低，可能是由于樹脂吸附基團(tuán)與被吸附分子之間接觸的機(jī)會少；而當(dāng)質(zhì)量濃度增大到一定值后，吸附率也會下降，可能是由于當(dāng)大孔樹脂AB-8的表面吸滿了紅腰豆黃酮后，發(fā)生多層吸附，導(dǎo)致樹脂內(nèi)部微孔堵塞，使內(nèi)孔的利用率降低。考慮到樹脂的吸附性能和效率，故上樣液質(zhì)量濃度選擇4.0 mg/mL為宜。

上樣液pH的吸附率，隨pH的增大而呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，在6.0左右時達(dá)最大值。可能與大孔樹脂吸附原理有關(guān)，因吸附過程中堿性化合物在堿性溶液中易吸附，酸性化合物在酸性條件下易吸附。同時上樣液pH會影響黃酮在溶液中溶解度、存在形式和溶液極性，且總黃酮物質(zhì)大多含有多羥基酚類呈一定的弱酸性，在酸性或弱酸性條件下易被樹脂吸附[13]。又因為本試驗中紅腰豆黃酮原pH(5.91～6.03)呈弱酸性，因此欲達(dá)到較好的吸附效果，選擇弱酸性條件下吸附比較合適，即pH 6.0。

上樣流速的吸附率，隨上樣流速的增加而下降，這可能是因為在相同時間內(nèi)，流速越小，黃酮提取液與樹脂接觸時間越長，越有利于提取液向樹脂表面擴(kuò)散，吸附量也就越大；反之，流速越大，接觸時間越短，泄漏點就越早[14]。流速為1.0 mL/min時，流速慢吸附效果最好，但會造成吸附在樹脂柱上的紅腰豆黃酮類物質(zhì)與樹脂結(jié)合過緊密，較遲出現(xiàn)泄漏點，同時使其他雜質(zhì)成分易滯留，造成整個操作周期延時，且與流速為2.0 mL/min時相差不顯著。綜合考慮純化和生產(chǎn)效率，吸附流速選擇2.0 mL/min比較適宜。

上樣體積的吸附率，隨進(jìn)樣液體積的增大呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中當(dāng)體積為4.0～6.0 BV時，其吸附率基本趨于穩(wěn)定增降幅度不明顯，這可能是因為此時樹脂的吸附量基本達(dá)到飽和。所以選擇上樣量為5.0 BV較為合理。

圖2 不同上樣液質(zhì)量濃度、pH、流速及體積對大孔樹脂AB-8吸附效果的影響

2.2.1.2 動態(tài)解吸過程各因素對大孔樹脂AB-8解吸效果的影響

由圖3可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)的解吸率，在小于60%時解吸率較低，60%～80%區(qū)間時解吸率比較高，但60%、70%和80%三者之間無顯著差異，隨后解吸率略有下降。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，紅腰豆提取液中混雜的糖類、蛋白質(zhì)等水溶性物質(zhì)大量溶出不利于黃酮類物質(zhì)的洗脫；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過大時，提取液中的醇溶性雜質(zhì)和親脂性強(qiáng)的成分溶出量加大，與黃酮類化合物形成競爭，造成了其溶解量減小。故選擇70%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液洗脫。

洗脫流速的解吸率，在2.0～4.0 mL/min區(qū)間時解吸率變化幅度不大，超過4.0 mL/min后隨洗脫流速的增加解吸率快速下降。表明洗脫流速較慢時，解吸的效果較好。原因可能是洗脫流速過快時，洗脫劑與被吸附的紅腰豆黃酮接觸時間過短，相互作用減弱，造成深層吸附的紅腰豆黃酮不能很好地被置換出來，導(dǎo)致洗脫不完全，拖尾嚴(yán)重；而流速過慢，盡管洗脫率比較高，但耗時，洗脫效率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，在不影響解吸率的情況下，選擇洗脫速度為3.0 mL/min較合理。

洗脫體積的解吸率，隨著洗脫液用量增加而上升，當(dāng)洗脫液體積超過2.0 BV以后，隨洗脫液用量的增加，洗脫效果趨于平緩，說明此時黃酮已基本洗脫下來。因此洗脫劑用量選擇2.0 BV即可。

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速及體積對大孔樹脂AB-8解吸效果的影響

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.2.1 動態(tài)吸附和解吸優(yōu)化設(shè)計及其模型的建立

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.06軟件，以吸附率和解吸率為分析指標(biāo)，獲到響應(yīng)面分析方案與結(jié)果，見表4～表5。

應(yīng)用軟件對表4和表5中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析擬合，可得吸附率(R1)和解吸率(R2)與各因素變量間的二次多項式方程，如式(8)、式(9)。

表4 動態(tài)吸附響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表5 動態(tài)解吸響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

R1=-403.160 70+34.086 02×A+31.697 90×B+111.359 70×C+88.576 42×D+0.178 25×A×B+2.968 00×A×C+1.643 00×A×D+2.888 50×B×C-1.007 00×B×D-12.969 50×C×D-6.239 20×A2-2.653 32×B2-18.592 30×C2-6.272 95×D2

(8)

R2=-168.918 75+5.840 63×A+24.412 50×B+7.743 75×C-0.105 00×A×B+0.078 750×A×C-0.525 00×B×C-0.038 062×A2-2.493 75×B2-2.756 25×C2

(9)

為了闡明回歸方程的有效性和各因素對吸附率和洗脫率的影響程度，對回歸方程進(jìn)一步方差分析，結(jié)果如表6～表7所示。

表6 吸附率模型回歸方差分析

注：用**表示極顯著(P<0.01)；用*表示顯著(P<0.05)；P>0.05為不顯著。表7同。

表7 解吸率模型回歸方差分析

由表6可以看出，各因素對吸附率的影響順序依次為：B(上樣液pH)>C(上樣流速)>A上樣質(zhì)量濃度)>D(上樣體積)。一次項、二次項和交互項中對大孔樹脂吸附紅腰豆總黃酮影響除了D、AB不顯著(P>0.05)及A、BD影響顯著(P<0.05)外，其余的都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。此吸附模型極顯著(P<0.001)，失擬項P=0.502 5>0.05不顯著，表明試驗設(shè)計誤差小，擬合程度良好；同時其決定系數(shù)R2=0.988 1，校正決定系數(shù)Adj.R2=0.976 2，變異系數(shù)CV=0.87%，也說明試驗精確度和可靠性都較好，因此可用此模型對大孔樹脂吸附紅腰豆總黃酮進(jìn)行分析和預(yù)測。

從表7可以看出，解吸模型P<0.000 1，模型極顯著，失擬項P=0.295 1>0.05，影響不顯著，說明試驗設(shè)計可靠，各因素之間擬合程度良好；同時從其決定系數(shù)R2=0.961 3，校正決定系數(shù)Adj.R2=0.911 5，變異系數(shù)CV=1.34%，可看出試驗可靠性和精確度都較好，也表明可用該模型能夠正確預(yù)測和分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速和洗脫體積與解吸率之間的關(guān)系。模型中一次項、二次項和交互項中的A、A2、B2、C2對解吸率影響達(dá)到極顯著(P<0.01)，B影響顯著(P<0.05)，C、AB、AC、BC影響不顯著(P>0.05)。各因素對解吸率影響主次順序為：A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(洗脫流速)>C(洗脫體積)。

2.2.2.2 動態(tài)吸附和解吸響應(yīng)面分析

為直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響，將一個因素設(shè)為中心值，描繪對應(yīng)其他因素的三維響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果如圖4～圖5所示。

從圖4和圖5的曲面傾斜度和等值線的形狀可直觀看出，動態(tài)吸附時，上樣液pH對大孔樹脂吸附紅腰豆總黃酮的吸附率影響最大，其次為上樣流速和上樣質(zhì)量濃度，影響最小的為上樣體積，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線陡峭程度下降和等值線形狀從橢圓形逐漸接近圓形。同理，可看出動態(tài)解吸時，洗脫體積對解吸率影響最差，其次為洗脫流速，乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最大，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線越來越陡峭和等值線形狀越來越密集。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對模型回歸方程R1、R2的逆矩陣進(jìn)行計算，獲得最佳吸附條件為：上樣質(zhì)量濃度3.97 mg/mL、上樣液pH 6.31、上樣流速2.09 mL/min、上樣體積4.92 BV，求得吸附率最大理論值為98.45%；考慮實際操作可行性修正為：上樣質(zhì)量濃度4.0 mg/mL、上樣液pH 6.3、上樣體積5.0 BV、上樣流速2.0 mL/min。最佳解吸條件參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.71%、洗脫體積2.18 BV、洗脫流速3.09 mL/min，得到解吸率最大預(yù)測值為95.44%；為方便操作修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、洗脫體積2.0 BV、洗脫流速3.0 mL/min。

圖4 動態(tài)吸附黃酮各因素交互作用的響應(yīng)面等值線及曲面圖

圖5 動態(tài)解吸黃酮各因素交互作用的響應(yīng)面等值線及曲面圖

2.2.2.3 優(yōu)化條件下動態(tài)吸附和解吸的驗證試驗

按上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行動態(tài)吸附和解吸試驗，得吸附率值平均為(98.03±0.30)%[(98.03±0.07)%、(97.14±0.49)%、(98.92±0.25)%，RSD=0.91%]，解吸率值平均為(94.52±0.24)%[(95.18±0.13)%、(93.87±0.40)%、(94.53±0.31)%，RSD=0.69%]。吸附率與解吸率的實際值與其預(yù)測值相對誤差為0.43%和0.96%，因此該回歸方程模型優(yōu)化得

到的吸附和解吸工藝參數(shù)組合是可靠、有效的。

2.3 AB-8樹脂對紅腰豆總黃酮的純化效果

圖6 紅腰豆總黃酮體外抗氧化作用

表8 純化前后紅腰豆總黃酮純度、抗氧化能力比較

評價指標(biāo)總黃酮純度/(mg/g)IC50值/(mg/mL)DPPH·自由基清除率·OH清除率O-2·清除率純化前3128±030a118140651純化后8919±028a037082177

注：同一列中不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

目前大多關(guān)于樹脂分離純化類黃酮化合物的研究，主要從樹脂種類、上樣質(zhì)量濃度、上樣及洗脫流速等單因素方面研究分析試驗條件對純化黃酮的效果，未考慮各單因素的相互作用；或結(jié)合傳統(tǒng)正交設(shè)計，但因其是一種線性數(shù)學(xué)模型只能分析離散型數(shù)據(jù)，這些都對黃酮純化效果有較大的局限性。而響應(yīng)面法(RSM)采用非線性模型擬合響應(yīng)值與各因素之間的函數(shù)關(guān)系，能求得高精度的多元二次回歸方程，并通過合理預(yù)測分析來尋求最佳純化工藝參數(shù)，因此該研究方法也將為對其他植物類黃酮分離純化提供一定的參考。本研究同時存在許多不足，比如，在動態(tài)解吸試驗中未探究洗脫劑的pH對解吸效果的影響，對紅腰豆總黃酮的分離純化和抗氧化只局限在大孔樹脂和體外的初級階段，對深層次方面(如用DEAE纖維素、Sephadex凝膠層析等方法進(jìn)行分級分離，通過硅膠薄層層析和HPLC、NMR等儀器分析組分結(jié)構(gòu)，用系統(tǒng)的體外和體內(nèi)抗氧化試驗闡明生物活性作用機(jī)理)的探究有待進(jìn)一步深入。

4 結(jié)論

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Optimization of Purification Process of Total Flavonoids From Red Kidney Beans with Macroporous Absorbent Resin and Comparision ofinvitroAntioxidant Activity

Li Ying Zeng Zhenqing Zhang Wei Zheng Lanxiang Li Ziyue Chen Xuemei

(Longyan University,Fujian Provincial Key Laboratory for the Prevention and Control of Animal Infectious Diseases and Biotechnology,Longyan 364012)

The process and results of macroporous resins for the purification of flavonoids from red kidney beans were studied,and the performances of static adsorption-desorption of the eight kinds of resin were compared by using adsorption rate and desorption rate as indexes.Single factor test and Box-Behnken central composite design were