天漿殼多酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價

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(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2.93263部隊醫(yī)院,遼寧錦州 121000;3.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000)

天漿殼多酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價

崔鏨1,呂芳2,王天一3,張富強3,郭斌1,*,韓冠英1,李敏3,白雨鑫1

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000;2.93263部隊醫(yī)院,遼寧錦州 121000;3.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000)

目的:確定天漿殼多酚的最佳提取工藝,并對其抗氧化活性進行初步研究。方法:以多酚提取量為指標,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化天漿殼多酚提取工藝。通過多酚的還原能力、羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基的清除作用來評價其抗氧化活性。結(jié)果:天漿殼多酚最佳提取工藝:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時間為64 min。在此條件下,天漿殼多酚的提取量為(26.86±0.37) mg/10 g。該多酚具有一定的還原能力,當多酚濃度為1 mg/mL時,對羥自由基和DPPH·自由基清除率分別為70.78%和85.22%。結(jié)論:此優(yōu)化工藝可行,該多酚具有一定的抗氧化能力。

天漿殼,多酚,響應(yīng)面法,抗氧化活性

天漿殼為蘿藦科蘿藦屬植物蘿藦的果殼。蘿藦為多年生纏繞草本,在中國分布廣泛,且在日本、朝鮮和俄羅斯亦有分布。其果殼在中藥中被稱作“天漿殼”,具有補虛助陽,止咳化痰之功效。目前對天漿殼成分的研究主要集中在多糖方面[1-2],楊蕾[3]通過對蘿藦藤的定性實驗,確定蘿藦中含有酚類物質(zhì),但并未對蘿藦果殼中酚類物質(zhì)進行進一步研究。研究表明植物多酚具有多種生理活性和藥用價值,其功能活性表現(xiàn)在抗氧化、抗輻射、抗誘變以及抗腫瘤等多個方面[4]。

目前,常見的植物多酚提取方法有溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、微波浸提法和超聲波輔助提取法。其中溶劑萃取法雖然操作簡單,但其使用的有機試劑易燃,且部分有毒,對安全生產(chǎn)十分不利[5];超臨界流體萃取法采用超臨界CO2為萃取劑,可以避免使用有毒有機溶劑,且無環(huán)境污染,產(chǎn)品分離時簡單方便,但需一次性投入較多的資金[6];微波浸提只適合短時間內(nèi)快速提取,長時間提取可能會導(dǎo)致提取液溫度過高使多酚類物質(zhì)分解,提取量減少[7]。超聲波輔助提取法以其浸提時間短、提取率高及操作簡便、對環(huán)境無污染等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于多種植物多酚的提取研究中[8],如安化黑茶[9]、石榴皮[10]、牡丹籽[11]、棗皮[12]、及蒲公英[13]等的多酚提取。本研究以超聲輔助提取為前提,并在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法來研究天漿殼中多酚提取的最佳條件,并通過體外抗氧化實驗對其藥理活性進行初步評價,為進一步研究天漿殼多酚抗氧化活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

天漿殼 采摘于遼寧省錦州市周邊,經(jīng)遼寧省錦州市藥品檢驗所翟鐵紅主任藥師鑒定為天漿殼;沒食子酸、福林酚試劑 均購自上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸(VC) 購自國藥集團;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) 購自美國Sigma公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

L5S紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UP3200HE數(shù)控超聲波清洗器 南京壘君達超聲電子設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 天漿殼多酚的提取 將天漿殼烘干、粉粹,過40目篩。稱取10.0 g天漿殼粉于500 mL錐形瓶中,將一定濃度的乙醇溶液,按照不同的液料比加入瓶中,攪拌均勻,封口,置于超聲儀中,超聲功率設(shè)定為100 W,在一定溫度下超聲提取一定時間后,過濾,得多酚提取液。

1.2.2 天漿殼多酚的提取量測定 標準曲線的繪制根據(jù)福林酚法[14],以沒食子酸為標準品,以其濃度為橫坐標,765 nm波長下的吸光度為縱坐標,所得回歸方程為:A=0.00882C+0.0814(R2=0.9989),線性范圍:20～100 μg/mL。提取量表達式:M=(10×C×V)/M0。其中M為提取量(mg/10 g);C為濃度(mg/mL);V為溶液體積(mL);M0:為原料質(zhì)量(g)。多酚提取液按照上述方法測定吸光度并根據(jù)回歸方程計算多酚提取量,每組測定3次,取平均值。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 采用1.2.1中提到的方法,在液料比10∶1 (mL/g),超聲時間60 min,溫度60 ℃的條件下,考察乙醇濃度(25%、35%、45%、55%、65%、75%,v/v)對天漿殼多酚提取量的影響;在乙醇濃度(v/v)55%,超聲時間60 min,溫度60 ℃的條件下,考察液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)對天漿殼多酚提取量的影響;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇濃度(v/v)55%,超聲時間60 min的條件下,考察溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對天漿殼多酚提取量的影響;在液料比10∶1 (mL/g),乙醇濃度(v/v)55%,溫度60 ℃的條件下,考察不同時間(15、30、45、60、75、90 min)對天漿殼多酚提取含量的影響。進行單因素實驗,分析各因素對天漿殼多酚提取量(mg/10 g)的影響。

1.2.4 Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計 以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ),根據(jù)Box-Benhnken實驗設(shè)計原理,以天漿殼多酚提取量作為響應(yīng)值,選取單因素實驗中的四個因素:A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(溫度)和D(超聲時間),建立四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗,每組平行測定3次,取平均值。設(shè)計因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素及水平

1.2.5 天漿殼多酚的體外抗氧化活性實驗

1.2.5.1 總還原能力測定 參考文獻[15],在1 mL不同濃度的樣品溶液中,分別加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液,充分混勻后,在50 ℃下水浴反應(yīng)20 min,冷卻后,向各個反應(yīng)液中加入10%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)并離心。取2.5 mL上清液與等體積蒸餾水混勻后,加入0.5 mL的0.1%三氯化鐵溶液,充分混勻,室溫下反應(yīng)10 min,在700 nm波長下測吸光度,用VC作為陽性對照,每組實驗平行進行3次。

1.2.5.2 清除羥自由基測定 參考文獻[16],在1 mL不同濃度的樣品溶液中,分別加入1 mL FeSO4溶液(2 mmol/L),1 mL水楊酸乙醇溶液(2 mmol/L),1 mL H2O2(2 mmol/L)溶液,充分振蕩后,在37 ℃下水浴反應(yīng)30 min后,在510 nm波長下測吸光度,用VC作為陽性對照,每組實驗平行進行3次,并計算羥自由基的清除率。清除率計算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0為1 mL蒸餾水與反應(yīng)試劑的吸光度;A1為樣品或VC與反應(yīng)試劑的吸光度;A2為樣品或VC反應(yīng)液不加入H2O2的吸光度(H2O2以等體積蒸餾水代替)。

1.2.5.3 清除DPPH·測定 參考文獻[17],在2 mL不同濃度的樣品溶液中,加入等體積的DPPH·乙醇溶液(0.1 mmol/L),混合均勻,置于37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min后,在517 nm波長下測吸光度。用VC作為陽性對照,每組實驗平行進行3次,并計算DPPH·的清除率。清除率計算公式:

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

其中，A0為2 mL蒸餾水加入DPPH·乙醇溶液的吸光度;A1為樣品/VC反應(yīng)液中加入DPPH乙醇溶液的吸光度;A2為樣品/VC反應(yīng)液不加入DPPH·乙醇溶液的吸光度(DPPH·乙醇溶液以等體積乙醇代替)。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖;Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對多酚提取量的影響 所得結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1結(jié)果可知,在其它提取條件不變的情況下,在乙醇濃度小于45%時，多酚提取量隨著乙醇濃度的升高而增加,這可能是因為當有機溶劑的體積分數(shù)較低時,不能破壞多酚與多糖、蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力,不利于多酚提取。當乙醇濃度升高到45%后,其提取量隨著乙醇濃度的升高而減少,這是由于天漿殼中的色素,醇溶性物質(zhì)等成分的溶出量增加,這些成分與多酚類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合,同時天漿殼組織中的通透性下降,從而導(dǎo)致多酚的提取率下降[18]。因此,選擇乙醇濃度為45%。

圖1 乙醇濃度對多酚提取量的影響

2.1.2 液料比對多酚提取量的影響 所得結(jié)果見圖2,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著所加提取溶劑體積的增加而逐漸升高,這是因為在一定范圍內(nèi)增加液料比有利于增大浸提物與溶劑的接觸面積,使多酚充分溶出,從而提高萃取效率。當液料比達到15∶1 (mL/g)時,多酚提取量達到最高,液料比繼續(xù)增加多酚提取量趨于穩(wěn)定,可能是因為接觸面積相對飽和,此時再增加溶劑體積對多酚提取量影響不大[19]。液料比越大,溶劑消耗越多。因此,選擇液料比15∶1 (mL/g)為宜。

圖2 液料比對多酚提取量的影響

2.1.3 溫度對多酚提取量的影響 所得結(jié)果見圖3,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著提取溫度的升高而增加,當溫度達到60 ℃,多酚提取量達到最高,溫度繼續(xù)上升時,其含量有所下降,原因可能是多酚化合物隨著溫度的升高有部分不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)受到破壞[20]。故選擇提取溫度60 ℃為宜。

圖3 提取溫度對多酚提取量的影響

2.1.4 超聲時間對多酚提取量的影響 所得結(jié)果見圖4,在其它提取條件不變的情況下,多酚提取量隨著超聲時間的延長而增加,當超聲時間達到60 min時,繼續(xù)延長超聲時間,其含量有所下降,原因可能是較長時間的超聲作用會增加雜質(zhì)的溶出,破壞多酚結(jié)構(gòu)[21]。故選擇超聲時間為60 min。

圖4 提取時間對多酚提取量的影響

2.2BBD實驗結(jié)果

2.2.1 BBD實驗設(shè)計方案及結(jié)果 響應(yīng)面實驗方案及多酚提取量的響應(yīng)值見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注:**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 由Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析,所得回歸方程:M=26.23-2.39A+0.47B+0.14C+0.66D-0.23AB+0.24AC+0.50AD+0.54BC-0.11BD-0.060CD-3.49 A2-1.01B2-1.19C2-0.86D2

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)實驗所得的AD和BC的響應(yīng)面曲線圖(見圖5),顯示響應(yīng)曲面陡峭,說明交互作用顯著,這與方差分析結(jié)果一致。當液料比和提取溫度固定時,乙醇濃度變化曲面比提取時間的變化曲面陡峭。表明乙醇濃度變化對多酚提取量的影響比提取時間大。當乙醇濃度和提取時間固定時,液料比曲面變化比提取溫度變化大,表明料液比的變化對多酚提取量的影響比溫度大。

圖5 AD、BC對多酚提取量影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳提取條件的確定及驗證實驗 通過軟件分析,得出最佳提取工藝條件為:在超聲功率固定為100 W的前提下,乙醇濃度(v/v)為41.69%,液料比為16.4∶1 (mL/g),提取溫度為60.85 ℃,超聲時間為63.97 min,最大提取量為26.79 mg/10 g。但考慮到具體操作的方便與可行性,將最佳提取工藝條件確定為:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時間為64 min,在此最佳提取工藝條件下,進行3次驗證實驗,平均提取量為(26.86±0.37) mg/10 g。由此可知響應(yīng)面法建立的回歸模型可靠,最佳提取工藝可行。將此條件下所得的多酚提取液進行濃縮、冷凍干燥,得多酚固體,備用。

2.3天漿殼多酚的體外抗氧化活性

2.3.1 總還原能力實驗結(jié)果 鐵氰化鉀可在酸性條件下與Fe3+反應(yīng),生成有色物質(zhì),在700 nm處具有特征吸收,且濃度越大,其吸光值越大,即還原能力越強。圖6表明,天漿殼多酚具有一定的還原能力,且還原能力隨著多酚濃度的升高而增強,呈現(xiàn)出濃度依賴性,但清除能力弱于VC。

圖6 多酚總還原能力

2.3.2 清除羥自由基實驗結(jié)果 圖7表明,多酚清除羥自由的能力隨著多酚濃度的升高而增強,呈現(xiàn)出濃度依賴性,當多酚濃度到達1 mg/mL時,其清除率可達70.78%,IC50(半抑制濃度)為0.61 mg/mL,說明天漿殼多酚對羥自由基具有一定的清除能力,但清除能力弱于VC。

圖7 多酚對羥自由基的清除能力

2.3.3 清除DPPH·實驗結(jié)果 可以通過記錄DPPH·在517 nm處的吸光度值變化來評價抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力強弱。圖8表明,清除能力隨著濃度的升高而增強,呈現(xiàn)出濃度依賴性,濃度到達1 mg/mL時,其清除率可達到85.22%,IC50(半抑制濃度)為0.37 mg/mL,但清除能力較VC稍弱。說明天漿殼多酚對DPPH·具有一定的清除能力。

圖8 多酚對DPPH·的清除能力

3 結(jié)論與討論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法對天漿殼多酚的提取工藝進行了優(yōu)化,確定天漿殼多酚最佳提取工藝為:乙醇濃度(v/v)為42%,液料比為16∶1 (mL/g),提取溫度為61 ℃,超聲時間為64 min,在此條件下多酚提取量可達到(26.86±0.37) mg/10 g。乙醇濃度、液料比及超聲時間對多酚提取含量有顯著影響,溫度影響不顯著,影響大小順序為:乙醇濃度>超聲時間>液料比>提取溫度。

機體內(nèi)的羥自由基是直接或間接導(dǎo)致組織損傷的一種重要活性氧自由基。研究表明,人體內(nèi)的羥自由基的存在可以引發(fā)人體內(nèi)的多種疾病,促進人體衰老[22]。DPPH·清除率測定法廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力[23]。通過對天漿殼多酚清除羥自由基和DPPH·的能力評價,表明天漿殼多酚具有一定的抗氧化能力,且其抗氧化能力呈現(xiàn)濃度依賴性,此外該多酚還具有一定的還原能力。植物來源的抗氧化活性成分研究遍及醫(yī)藥及功能食品等方面[24],本研究中的天漿殼多酚為開發(fā)利用功能保健食品提供了一定的理論依據(jù)。

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OptimizationofextractionprocessofpolyphenolsfromfruitshellofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makinoandevaluationofitsantioxidantactivity

CUIZan1,LVFang2,WANGTian-yi3,ZHANGFu-qiang3,GUOBin1,*,HANGuan-ying1,LIMin3,BAIYu-xin1

(1.Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2.93263 Military Hospital,Jinzhou 121000,China;3.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

Objective:To determine the optimum extraction process of polyphenols from fruit shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino and preliminarily evaluate its antioxidant activity. Method:On the basis of single factor experiments,the extraction conditions of polyphenols were optimized by response surface methodology with the content of polyphenols as index. The antioxidant capacity was measured by reducing power,scavenging of hydroxyl radicals and DPPH. Result:The optimum extraction conditions were as follows:ethanol concentration(v/v)was 42%,ratio of liquid to solid was 16∶1 (mL/g),extraction temperature was 61 ℃ and extraction time was 64 min. Under the conditions,the extraction amount of polyphenols was(26.86±0.37)mg/10 g. The polyphenols had certain reducing power. When the concentration of polyphenols was 1 mg/mL,the clearance rate on hydroxyl radicals and DPPH· was 70.78% and 85.22%,respectively. Conclusion:The optimized technology was feasible and the polyphenols had certain antioxidant capacity.

shell ofMetaplexisjaponica(Thunb.)Makino;polyphenols;response surface methodology;antioxidant activity

2017-04-21

崔鏨(1986-)，男，碩士，藥師，主要從事植物有效成分方面的研究，E-mail:jycuizan@hotmail.com。

*

郭斌(1969-)，男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物有效成分方面的研究，E-mail:lyguobin@hotmail.com。

國家自然科學(xué)基金項目(81302681)；國家科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(14C26242100741)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(201510160000004；201510160000016)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)22-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.033