煙草雙生病毒RaMoV在煙粉虱中的檢測

白建保,歐陽智剛,聞 剛,賴榮泉,王聯(lián)德?

(1.中國煙草總公司職工進修學院，河南鄭州450008；2.贛南師范大學生命與環(huán)境科學學院，江西贛州341000；3.中國煙草總公司海南省公司，海南?？?70000；4.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建福州350002)

煙草雙生病毒RaMoV在煙粉虱中的檢測

白建保1,歐陽智剛2,聞 剛3,賴榮泉4,王聯(lián)德4?

(1.中國煙草總公司職工進修學院，河南鄭州450008；2.贛南師范大學生命與環(huán)境科學學院，江西贛州341000；3.中國煙草總公司海南省公司，海南?？?70000；4.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建福州350002)

苧麻花葉病毒(Ramie mosaic virus,RaMoV)是常見由煙粉虱傳播的雙生病毒(Geminivirus)。用特異性引物進行PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),B型煙粉虱(Bemisia tabaci)能夠在煙草上傳播該雙生病毒。

煙粉虱；煙草；雙生病毒；苧麻花葉病毒；分子檢測

煙草、苧麻均是南方常見的經(jīng)濟作物。苧麻花葉病毒(Ramie mosaic virus,RaMoV)是苧麻上的一種重要病害,在全國范圍內(nèi)都有不同程度的發(fā)生,一般可使原麻減產(chǎn)10%－60%。苧麻花葉病毒是由煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播的一種雙生病毒(Geminivirus)(Li et al.,2010；Saunders et al.,2002；Wang et al.,2004)。由于雙生病毒能夠通過突變、重組、假重組快速變異,進化出新的病毒株系(Seal et al.,2006),新的病毒株系不斷發(fā)生在其相鄰作物上,如煙草、木瓜、辣椒等(Mansoor et al.,2003,2006),給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害,因此,加強對這類病毒的研究十分必要。我們利用PCR技術(shù),檢測B型煙粉虱能否在煙草上傳播苧麻花葉病毒,研究結(jié)果將為煙草病毒病的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物:心葉煙(Nicotiana glutinosa)和普通煙(Nicotiana tabacum)K326品種均由福建農(nóng)林大學植物保護學院植物病毒研究所提供。心葉煙和普通煙用于苧麻花葉病毒接種試驗,普通煙用于煙粉虱傳毒試驗。

供試雙生病毒:RaMoV、攜帶RaMoV DNA-A和RaMoV DNA-B全長基因侵染性克隆載體的農(nóng)桿菌EHA105的毒源均由福建農(nóng)林大學植物保護學院植物病毒研究所提供。

供試蟲源:B型煙粉虱由福建農(nóng)林大學植物保護學院昆蟲學實驗室溫室飼養(yǎng),飼養(yǎng)寄主植物以甘薯(Ipomoea batatas Lam)、黃瓜(Cucumis sativus L.)為主。

試劑:DNA聚合酶購自于TAKARA公司；核酸標準分子量(Lambda DNA EcoR I/HindⅢmarker)購自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌接種 將含有RaMoV DNA-A和RaMoV DNA-B全長基因的侵染性克隆載體的農(nóng)桿菌菌液等比例混勻,使用一支1 mL的一次性注射器,吸取混合的農(nóng)桿菌菌液,分別在距離供試煙草根部1－2 cm處、葉柄處取三點進行植物韌皮部注射,接種煙草置于防蟲室中培養(yǎng),觀察其發(fā)病癥狀。以發(fā)病的煙草作為毒源植物,進行傳毒試驗。

1.2.2 煙粉虱傳播雙生病毒 將健康煙粉虱成蟲接于毒源寄主植物上,飼毒48 h作為帶毒煙粉虱,后將帶毒煙粉虱轉(zhuǎn)接于健康普通煙和心葉煙上,平均每株供試煙草接30頭帶毒成蟲,煙粉虱成蟲釋毒2 d后噴灑農(nóng)藥(吡蟲啉,原液稀釋1 000倍)以殺死煙粉虱。普通煙或心葉煙繼續(xù)在防蟲籠中生長,直至表現(xiàn)出癥狀。

1.2.3 煙草植株體內(nèi)病毒DNA的檢測 供試煙草注射農(nóng)桿菌菌液接種30 d后,或煙粉虱傳毒的煙草發(fā)病后,采集煙草葉片,提取煙草總DNA,按照楊彩霞(2009)方法,采用CTAB法提取煙草葉片總DNA,采用特異性引物進行PCR檢測,引物見表1。

1.2.4 煙粉虱體內(nèi)病毒DNA的檢測 按照糾敏(2006)方法提取煙粉虱總DNA,提取后的DNA加入20 μL ddH2O溶解,放置－20℃保存?zhèn)溆?。采用特異性引物進行PCR檢測(表1)。

表1 檢測所用PCR引物1)Table 1 PCR primers used for identification

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的RaMoV煙草侵染

試驗表明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的RaMoV DNA-A和DNA-B混合侵染,30 d后能在普通煙上引起矮化癥狀(圖1A),而在心葉煙上產(chǎn)生典型的曲葉癥狀(圖1B),并且接種發(fā)病的煙草體內(nèi)均檢測到RaMoV F3 DNA-A和DNA-B片段,其大小均為1 000 bp左右(圖2A和2B)。

圖1 RaMoV F3 DNA-A、DNA-B接種在普通煙(A)和心葉煙(B)上的結(jié)果Figure 1 Symptoms induced by RaMoV RaMoV F3 DNA-A、DNA-B on N.tabacum(A)and N.glutinosa(B)

圖2 發(fā)病煙草RaMoV F3 DNA-A(A)和DNA-B(B)PCR檢測結(jié)果Figure 2 Identification of RaMoV F3 DNA-A(A)and DNA-B(B)in infected tobaco by PCR

2.2 煙粉虱體內(nèi)雙生病毒的檢測

煙粉虱體內(nèi)分別擴增到了RaMoV DNA-A和DNA-B,其大小均為1 000 bp左右(圖3)。

健康煙粉虱成蟲接于農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)病的煙草上飼毒2 d后,再轉(zhuǎn)接于健康普通煙草上釋毒。14 d后,普通煙頂端葉片出現(xiàn)輕微的卷縮癥狀(圖4A),28 d后,煙草頂端所有葉片都卷縮起來。在發(fā)病的普通煙上分別檢測到F3 DNA-A和F3 DNA-B,其大小均為1 000 bp左右(圖4B)。

煙粉虱傳毒后30 d,普通煙和心葉煙分別表現(xiàn)出癥狀(圖5),心葉煙的葉背面已明顯出現(xiàn)脈腫、耳突等癥狀(圖5E和5F)。

圖3 煙粉虱體內(nèi)雙生病毒的PCR檢測結(jié)果Figure 3 Identification of geminivirus by PCR from infected B.tabaci

圖4 傳毒后30 d普通煙表現(xiàn)的癥狀(A)和F3 DNA-A、DNA-B的檢測結(jié)果(B)Figure 4 Symptoms in N.tabacum after transmitted 30 d(A)and identification of F3 DNA-A、DNA-B by PCR(B)

圖5 煙粉虱傳毒后30 d普通煙和心葉煙的表現(xiàn)癥狀Figure 5 Symptoms of N.tabacum(A,B and C)and N.glutinosa(D,E and F)induced by F11 and F12 through 30 days after transmitted by whitefly

3 討論

煙粉虱是多種雙生病毒的傳播介體。在本試驗中,證明了B型煙粉虱能有效傳播RaMoV。雙生病毒不能經(jīng)機械傳播,因此煙粉虱在RaMoV病害的傳播中起著重要作用,同時在B型煙粉虱體內(nèi)均能檢測到RaMoV,說明雙生病毒能在煙粉虱體內(nèi)越冬和越夏,這又為雙生病毒病害的循環(huán)提供了初始病毒毒源。說明近年來,由RaMoV引起煙草、苧麻花葉病在我國迅速蔓延的原因與B型煙粉虱逐漸成為優(yōu)勢種群及高的帶毒、傳毒能力緊密相關(guān)。

致謝:試驗中得到楊彩霞博士的幫助,謹此謝意。

糾敏,2006.煙粉虱、二種植物雙生病毒(TYLCCNV、TbCSV)和寄主植物三者之間的互作[D].杭州:浙江大學.

楊彩霞,2009.福建省六種雙生病毒的分子鑒定及RaMoV NSP互作蛋白的篩選[D].福州:福建農(nóng)林大學.

Li J,Zhang X Y,Qian Y J,2010.Molecular characterization of Ramie mosaic virus isolates detected in Jiangsu and Zhejiang provinces,China[J].Acta Virologica,54(3):225-228.

Mansoor S,Briddon R W,Bull S E,et al,2003.Cotton leaf curl disease is associated with multiple monopartite begomoviruses supported by single DNA beta[J].Archives of Virology,148(10):1 969-1 986.

Mansoor S,Zafar Y,Briddon R W,2006.Geminivirus disease complexes:the threat is spreading[J].Trends in Plant Science,11(5):209-212.

Seal S E,Jeger M J,Bosch F V D,2006.Begomovirus evolution and disease management[J].Advances in Virus Research,67:297-316.

Saunders K,Bedford I D,Stanley J,2002.Adaptation from whitefly to leafhopper transmission of an autonomously replicating nanovirus-like DNA component associated with ageratum yellow vein disease[J].Journal of General Virology,83(4):907-913.

Wang X,Xie Y,Zhou X,2004.Molecular characterization of two distinct begomoviruses from Papaya in China[J].Virus Genes,29(3):303-309.

Molecular identification verify geminivirus RaMoV transmiting to tobacco vectored by Bemisia tabaci

BAI Jian-Bao1,OUYANG Zhi-Gang2,WEN Gang3,LAI Rong-Quan4,WANG Lian-De4?
(1.College of Workers Continuing Education,China National Tobacco Corporation,Zhengzhou,Henan 450008,China；2.College of Life and Environmental Sciences,Gannan Normal University,Ganzhou,Jiangxi 341000,China；3.Hainan Provincial Company of China Tobacco Corporation,Haikou,Hainan 570000,China；4.College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

Ramie mosaic virus is a common geminivirus transmitted by Bemisia tabaci.Using the molecular identification by PCR with specific primer showed that the geminivirus could transmit to tobacco vectored by B.tabaci.

Bemisia tabaci； tabaco； Geminivirus； RaMoV； molecular identification

S432.4＋1

A

1001－4276－(2017)01－0069－05

白建保，歐陽智剛，聞剛，等，2017.煙草雙生病毒RaMoV在煙粉虱中的檢測[J].武夷科學，33:69-73.

2017－05－31。

福建省煙草公司科技項目(閩煙科2013[2]號)；2012年江西省農(nóng)業(yè)科技推廣專項。

白建保(1959－)，男，高級講師。研究方向:煙草植保。Email:bjb598＠126.com。?共同通訊作者歐陽智剛(1984－)，男，講師。研究方向:植物病理。Email:oyfry＠163.com。王聯(lián)德(1967－)，男，教授。研究方向:生物農(nóng)藥，生物防治。 Email:wang＿liande＠ 126.com。

(責任編輯:陳曉雯)