魚類病毒性出血性敗血癥病毒診斷膠體金免疫層析方法的建立

孫 濤,高瑞剛,孫明君,王 群,雷質(zhì)文,岳志芹

(1. 山東出入境檢驗檢疫局,山東青島 266002;2. 青島出入境檢驗檢疫局,山東青島 264000)

魚類病毒性出血性敗血癥病毒診斷膠體金免疫層析方法的建立

孫 濤1,高瑞剛2,孫明君1,王 群1,雷質(zhì)文1,岳志芹1

(1. 山東出入境檢驗檢疫局,山東青島 266002;2. 青島出入境檢驗檢疫局,山東青島 264000)

為建立一種快速檢測魚類病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)的膠體金免疫層析方法(GICA),采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,以標記純化的VHSV G蛋白單克隆抗體(MAb)10A7為捕捉抗體,將純化的抗VHSV N蛋白的MAb 10EN單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體包被在硝酸纖維素膜上,作為檢測帶與質(zhì)控帶,經(jīng)試驗條件優(yōu)化,組裝形成膠體金免疫層析試紙條.用本試驗研制的膠體金試紙條檢測VHSV感染的CHSE細胞培養(yǎng)物.結(jié)果顯示:在檢測線和質(zhì)控線均呈現(xiàn)紅色條帶,而健康的CHSE細胞培養(yǎng)物對照僅在質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色條帶;試紙條檢出病毒培養(yǎng)物的病毒量最低限為104.0TCID50;隨機挑取3個不同批次的試紙條,對陽性樣品和陰性樣品進行重復(fù)試驗,未發(fā)現(xiàn)差異.特異性試驗表明,該試紙條與傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)、傳染性胰壞死病毒(IPNV)、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、牙鲆彈狀病毒(HRV)、草魚呼腸孤病毒(GCRV)無交叉反應(yīng).將同一批次的試紙條在4 ℃條件下保存不同時間后進行檢測,發(fā)現(xiàn)保存6個月的試紙條仍具有良好的穩(wěn)定性.本試驗研發(fā)的膠體金診斷試紙條具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性,在快速輔助檢測方面具有推廣應(yīng)用價值.

魚病毒性出血性敗血癥病毒;膠體金;免疫層析法

病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV) 可引起鮭鱒魚類和多種海水魚類發(fā)生暴發(fā)性流行的烈性傳染病,屬彈狀病毒科、粒外彈狀病毒屬成員[1].由于魚類是變溫動物,很難在體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的抗體[2-3],因此在水生動物檢測中,很少采用包被蛋白的間接ELISA方法進行相關(guān)疫病的抗體鑒定和診斷.而直接法中的分子診斷方法檢測到的是核酸[4-6],不是抗原蛋白或活病毒,因此無法用其進行確診.

目前標準的VHSV監(jiān)測方法(監(jiān)測魚群帶毒情況)基本是直接檢測,即用細胞培養(yǎng)分離來鑒定.其操作復(fù)雜、過程繁多、檢測用時長、成本高.膠體金免疫層析技術(shù)是在膠體金標記技術(shù)、免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)[7-8].其原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細層析作用,使抗原、抗體在固相膜上反應(yīng).由于是運用可目測的標記物(膠體金或染色乳膠)而得到的直觀實驗現(xiàn)象(顯色),從而使這種分析技術(shù)具備操作快速簡便,無須儀器,結(jié)果準確、靈敏,可常溫下運輸保存等優(yōu)點.

世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動物疾病診斷手冊》規(guī)定,在沒有或不能進行病毒分離的情況下,可以利用兩種不同的方法來進行病原確診.本研究利用自行開發(fā)的VHSV特異性單克隆抗體,結(jié)合GICA,研制出快速、簡便診斷VHSV的膠體金免疫層析試紙條,以此作為VHSV檢測技術(shù)的補充.

1 材料和方法

1.1 抗體、病毒株及試劑

特異性識別抗VHSV G蛋白[9]的單克隆抗體10A7:由本實驗室保存;抗VHSV N蛋白[10]的MAb 10EN:由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院饋贈.氯金酸、牛血清白蛋白(BSA)和聚乙烯醇:均購自Sigma公司;重組蛋白瓊脂糖親和層析柱:購自Invitrogen公司;羊抗小鼠IgG:購自上海朗頓生物科技有限公司;硝酸纖維素膜(NC膜):購自深圳三方圓公司;吸水紙、玻璃纖維和膠板:均購自上海金標生物科技有限公司;ZX3000噴膜機和CM4000切條機:均為美國Bio-Dot公司產(chǎn)品;鮭魚胚胎細胞CHSE:由本實驗室保存;Viral Hemorrhagic Septicemia Virus(VHSV)、Infectious haematopoietic necrosis virus(IHNV)、Infectious pancreatic necrosis virus(IPNV)、Spring Viremia of Carp Virus(SVCV)、Rhabdovirus olivacens virus(HRV)、Grass Carp Reovirus virus(GCRV):均由深圳局水生動物檢疫實驗室分離、鑒定、保存.

1.2 單克隆抗體的特異性鑒定與純化

將單克隆抗體通過不同病毒抗原包被的ELISA試驗測定特異性及其效價,然后用蛋白G親和層析柱純化后,用SDS-PAGE[11]法檢測其純度.

1.3 膠體金顆粒的制備及均勻度鑒定

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,然后將其4 ℃避光保存.通過透射電鏡直接觀察顆粒大小和均勻程度.

1.4 膠體金標記MAb的制備

參照文獻[7]方法,確定MAb 10A7與膠體金溶液的最佳標記量為16.74 μg/mL.取最佳MAb的量與膠體金溶液磁力攪拌混合30 min,加入5%的BSA溶液至終濃度為1%,2 000 r/min離心20 min;取上清,10 000 r/min離心1 h;對所得沉淀用0.02 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.2、含1%的BSA和0.1%疊氮鈉)重懸至原體積的1/10,4 ℃保存?zhèn)溆?

1.5 膠體金墊的制備

將玻璃纖維紙浸入膠體金標記的MAb溶液中1 h,室溫干燥后4 ℃保存.

1.6 NC膜轉(zhuǎn)印膜的制備

檢測線(Test line,T線)和控制線(Control line,C線)抗體工作濃度參照文獻[12].用噴膜儀將濃度為2 mg/mL的MAb10EN和羊抗鼠IgG抗體噴于NC膜中央,將噴樣速度設(shè)為1.0 μL/cm,使其形成間距0.5 cm的T線和C線.將NC膜于室溫干燥1 h,用含有1%聚乙烯醇的20 mmol/L Tris-HCl(pH7.4)室溫封閉30 min,用去離子水漂洗,室溫干燥,然后于相對濕度為10%以下的干燥條件下抽濕4 h,然后4 ℃保存?zhèn)溆?

1.7 膠體金免疫層析試紙條的組裝

將膠體金墊、NC膜、樣品墊、吸水紙和塑料底板,按照圖1的順序裝配.將NC膜粘貼于襯板上,在NC膜的兩端分別粘貼吸水墊和樣品墊,使吸水墊和樣品墊均與NC膜重疊3 mm,進而采用Bio-Dot的CM4000切條機將其裁成5 mm寬的條狀.

圖1 膠體金免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)

1.8 檢測程序與結(jié)果判定

1.8.1 待檢樣品的處理.將VHSV病料無菌接種于CHSE細胞,72 h后收獲細胞,加入1/2原培養(yǎng)體積的0.01 mol/L PBS(pH7.2),漩渦震蕩1 h,然后10 000 r/min 4 ℃離心,取上清作為被檢抗原.取健康CHSE細胞按照上述方法處理作為陰性對照.

1.8.2 樣品檢測及結(jié)果判定.將100 μL處理的樣品滴入樣品墊,10～15 min內(nèi)觀察結(jié)果.結(jié)果判定如下:陽性為T線和C線均呈現(xiàn)清晰紅色條帶,樣品中VHSV含量越高,T線紅色越深;陰性為只有C線呈現(xiàn)紅色條帶;無效為C線不呈現(xiàn)紅色條帶.

1.9 膠體金免疫層析試紙條性能評價

1.9.1 特異性試驗.用試紙條分別檢測VHSV、IHNV、IPNV、SVCV、HRV和GCRV,根據(jù)檢測結(jié)果判定其特異性.

1.9.2 敏感性試驗.將半數(shù)細胞培養(yǎng)感染劑量105.5TCID50的VHSV樣品,用PBS進行10倍梯度稀釋;將試紙條檢測到的VHSV陽性參考樣品的最高稀釋倍數(shù)(最小病毒滴度)定為試紙條的靈敏度.

1.9.3 重復(fù)性試驗.將5份病毒抗原作為陽性樣品,5份CHSE細胞培養(yǎng)上清為陰性樣品,用于試紙條的重復(fù)試驗.隨機取出不同批次和同一批次的試紙條,分別對陽性和陰性樣品進行重復(fù)檢測,觀察結(jié)果評估其重復(fù)性.

1.9.4 保存期試驗.將保存于4 ℃條件下的100條膠體金免疫層析試紙條,每隔1個月取出10條,對相應(yīng)病毒抗原、CHSE細胞培養(yǎng)上清及PBS進行檢測,通過結(jié)果分析來確定試紙條的質(zhì)保期限.

2 結(jié)果

2.1 單抗特異性分析及純化

將2種單克隆抗體(細胞培養(yǎng)上清)分別與VHSV、IHNV、IPNV、SVCV、HRV、GCRV 和CHSE細胞培養(yǎng)物包被的ELISA板反應(yīng).結(jié)果顯示,2種單抗與VHSV病毒抗原包被ELISA板反應(yīng)時呈強陽性,與其它病毒包被ELISA板反應(yīng)時均為陰性(表1).利用單抗細胞株制備的小鼠腹水效價達1:51 200.

表1 單克隆抗體特異性試驗

用層析法對2種單克隆抗體(腹水)進行IgG純化,用核酸/蛋白分析儀檢測,發(fā)現(xiàn)純化后的2單克隆抗體10A7、10EN濃度分別為1.632、1.824 mg/mL;將未純化的腹水和純化后的2種單克隆抗體進行SDS-PAGE電泳分析,發(fā)現(xiàn)未純化腹水上清泳道出現(xiàn)多條雜帶(Lane 1),而純化后的單克隆抗體僅在53、22 ku處出現(xiàn)IgG輕鏈和重鏈的條帶,無雜帶出現(xiàn)(Lane 2～3),表明純化效果良好(圖2).

圖2 單抗純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.2 膠體金顆粒形態(tài)

將膠體金通過透射電子顯微鏡觀察顆粒大小和均一程度.結(jié)果顯示,100個金顆粒的平均直徑為25 nm,符合標記要求(圖3).

圖3 膠體金顆粒透射電鏡照片

2.3 標準樣品檢測

接種VHSV-H株的陽性細胞裂解液和陰性樣品經(jīng)膠體金免疫層析試紙條檢測,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與預(yù)期相符:陽性樣品在試紙條上呈現(xiàn)2條清晰可見的紅色條帶;陰性樣品僅在控制線呈現(xiàn)1條紅色條帶(圖4).

圖4 標準陽性樣本的檢測結(jié)果

2.4 膠體金免疫層析試紙條性能評價

2.4.1 特異性試驗.將試紙條裝配入實驗室統(tǒng)一定制的塑料卡槽內(nèi),制成膠體金測試卡.對不同病毒樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)與其他常見病毒的反應(yīng)均呈陰性(圖5)

圖5 VHSV膠體金試紙條的特異性試驗結(jié)果

2.4.2 敏感性試驗.將105.5TCID50的VHSV,用PBS分別稀釋成TCID50為105.0/0.1 mL、104.5/0.1 mL、104.0/0.1 mL和103.5/0.1 mL,然后分別用試紙條檢測,將每個稀釋度重復(fù)2次,發(fā)現(xiàn)檢測濃度在104.0/0.1 mL以上的樣品均為陽性結(jié)果,濃度為103.5/0.1mL的樣品為可疑(表2).這表明該試紙條的檢測靈敏度至少能達到104.0/0.1 mL.

表2 VHSV膠體金試紙條敏感性試驗結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗.對隨機挑取的3個批次的試紙條進行重復(fù)試驗,每批次挑取10個試紙條,分別對陽性樣品和陰性樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全一致.取30個同批次試紙條,分別對陽性樣品和陰性樣品進行3次重復(fù)檢測,發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全一致.這些試驗結(jié)果表明,該試紙條的檢測重復(fù)性良好.

2.4.4 保存期試驗.將同批次的100個試紙條,在4 ℃條件下保存不同時間(0～9個月).每次取出10條,分別檢測相應(yīng)的病毒及EPC細胞裂解液,發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下保存6個月以內(nèi)試紙條的檢測結(jié)果沒有任何變化,用4℃保存7個月的試紙條檢測,發(fā)現(xiàn)試紙條出現(xiàn)假陽性(表3).檢測結(jié)果表明試紙條在4 ℃條件下可以保存6個月.

表3 VHSV膠體金試紙條保質(zhì)期實驗

3 討論

一般認為,大分子物質(zhì)是以其表面的正電基團牢固的與膠金粒的吸附層(帶負電)結(jié)合在一起的,是屬于物理過程.所以,調(diào)節(jié)標記體系的pH及蛋白質(zhì)用量相對重要.馬紅艷等[13]報道,pH在9.6時,蛋白和膜的結(jié)合力最強,而pH在6～8時,膜對蛋白的吸附力差別不大,都比在9.6時明顯減小.此外,標記時,蛋白質(zhì)與納米金粒子之間是以一定的比例結(jié)合的.過多加入抗體并不能增加標記物的產(chǎn)率,只能增加金標抗體中游離抗體的量,并不能提高檢測的靈敏性,而且游離的單克隆抗體還會與質(zhì)控孔結(jié)合,從而影響對結(jié)果的判定;若加入抗體的量不足,則會導(dǎo)致膠體聚集物而沉淀.因而確定穩(wěn)定膠體金所需的最小抗體量是試驗的一個重要環(huán)節(jié).在本試驗中,每次標記都按照實測值,計算具體的穩(wěn)定點;將pH控制在較高水平上,加入正確比例的金溶膠與被標蛋白質(zhì)量,可以保證獲得最佳標記率.經(jīng)測試合適的MAb 10A7與膠體金溶液的最佳標記量確定為16.74 μg/mL.

膠體金試紙條載體主要為硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃棉、吸水紙和支持板.其中,NC膜膜的孔徑、厚度與蛋白樣品的結(jié)合力,液體待檢物流動速率、擴張強度等,對檢測系統(tǒng)的靈敏性均有一定影響,其中孔徑與層析速率的影響較大.膜孔徑越小,層析速度也越小;金標復(fù)合物通過T線的時間也就越長,反應(yīng)也就越充分,靈敏度就越高.但這樣也同時減慢了跑板速度,增加了非特異性結(jié)合的機會,從而使假陽性率增高.所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜[14],并找到合適的平衡點.

許多報道[15-17]采用多抗檢測動物疫病病原,但發(fā)現(xiàn)特異性往往不夠理想[18].本研究采用針對不同基因蛋白的單抗和單抗結(jié)合,建立了VHSV病毒免疫層析檢測方法.與其他彈狀病毒類病原IHNV、HRV的細胞培養(yǎng)物進行同時檢測,發(fā)現(xiàn)均為陰性,而且標記的單克隆抗體具有良好的特異性.敏感性結(jié)果顯示,在檢測倍比稀釋的陽性參考樣本時,隨著稀釋倍數(shù)的增加,試紙條的檢測能力不斷下降,并會出現(xiàn)樣本臨界值的誤判現(xiàn)象.本研究曾嘗試加大檢測線和控制線的濃度來避免該問題,但效果不很理想.加之被檢樣本大多為細胞純培養(yǎng)物,在一定程度上限制了該試紙條在臨床檢測上的應(yīng)用.但其對細胞培養(yǎng)物的檢測具有簡便、快速的特點,因此具有較好的輔助檢測意義.

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(責(zé)任編輯:朱迪國)

Development of a Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for Antigen Detection of Viral Hemorrhagic Septicemia Virus

Sun Tao1,Gao Ruigang2,Sun Mingjun1,Wang Qun1,Lei Zhiwen1,Yue Zhiqin1
(1. Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong 266002;2. Qingdao Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong 266002)

In order to establish a colloidal gold immunochromatographic assay GICA)for rapid detection of Viral haemorrhagic septicaemia virus VHSV)in fish,colloidal gold particles were prepared by trisodium citrate reduction method. Monoclonal antibodies(MAb)10A7 labeled with purified VHSV G protein were used as the capture antibodies. The purified MAb 10EN monoclonal antibody against VHSV N protein and sheep anti mouse IgG antibody were coated on nitrocellulose membrane,as a test strip and a quality control band. The colloidal gold immunochromatographic strip was prepared by optimizing the experimental conditions. The colloidal gold strip was used to detect VHSV infected CHSE cell cultures. The results showed that red lines appeared in the detection line and the quality control line,while the healthy CHSE cell culture control only appeared red stripe in the quality control line. The detection limit of the strip was 104.0TCID50VHSV. Three different batch of the strips were selected randomly,and test on samples of positive samples and negative were repeated,but no difference were found. Specificity tests showed that there was no cross reaction between the test strips and infectious Haematopoietic necrosis virus(IHNV),infectious pancreatic necrosis virus(IPNV),Spring viremia of carp virus(SVCV),Rhabdovirus olivacens virus(HRV) and Grass carp reovirus virus(GCRV). After different time under the 4 ℃ condition,the testing results showed that the same batch of strip remained good stability during six months.The test strip was specific,sensitive and reproducible,which could be of great significance for the on-site testing.

VHSV;colloidal gold;immunochromatography

S852.65

A

1005-944X(2017)12-0092-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.026

quot;十二五quot;國家科技支撐計劃(2013BAD12B02-03)

岳志芹