阿江欖仁酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的抗炎作用初步研究

權(quán)洪峰+閆欣+彭曉東

摘要：目的 探討阿江欖仁酸對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的抗炎作用。方法 分別以5 μg/ml LPS和1、5、10、20、40、80和160 μmol/L阿江欖仁酸加入小鼠RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，Griess法檢測(cè)一氧化氮（NO）的含量，ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL- 6水平。結(jié)果 阿江欖仁酸劑量在80 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞生存力無(wú)顯著影響。阿江欖仁酸可顯著降低LPS引起的NO，TNF-α和IL-6水平的升高。結(jié)論 阿江欖仁酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有抗炎作用。

關(guān)鍵詞：阿江欖仁酸；炎癥；一氧化氮；TNF-α

中圖分類號(hào)：R96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1959（2017）23-0030-03

Preliminary Study on the Anti-inflammatory Effect of Azartipic Acid on LPS-induced Mouse RAW264.7 Macrophages

QUAN Hong-feng1，YAN Xin2，PENG Xiao-dong1

（1.School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China；

2.Department of Pharmacy，the First People's Hospital of Yinchuan 750004；Ningxia，China）

Abstract：Objective To investigate the antiinflammatory effect of azartipic acid on lipopolysaccharide（LPS）induced inflammatory response.Methods The mice were cultured with 5 μg/ml LPS and 1，5，10，20，40，80 and 160 μmol/L azartiprofen acid respectively in RAW 264.7 cell culture medium for 24 h.The cell viability was determined by MTT assay.The content of nitric oxide（NO）was measured by Griess method，and the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA.Results There was no significant effect on the cell viability at 80 μmol/L.Azartic acid can significantly reduce the levels of NO， TNF-α and IL-6 induced by LPS.Conclusion Azinolinic acid has anti-inflammatory effect on LPS-induced inflammatory response.

Key words：Azartic acid；Inflammation；Nitric oxide；TNF-α

炎癥是一種應(yīng)對(duì)感染或組織損傷的正常和有益的自我保護(hù)反應(yīng)。在炎癥發(fā)生的初期，大量炎癥介質(zhì)被釋放，最終使組織恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，持續(xù)或慢性炎癥會(huì)繼發(fā)許多慢性疾病，如心血管疾病及糖尿病[1-3]。脂多糖（LPS）常用于建立體外巨噬細(xì)胞在炎癥模型進(jìn)而評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗炎作用。LPS可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子（TNF-α，IL-6）的表達(dá)，以及許多其他介質(zhì)的高表達(dá)，如 NO[4-5]。三萜類化合物具有廣泛的生物活性，如降血糖、抗腫瘤及抗炎作用[6-7]。本課題深入研究了阿江欖仁酸的抗炎作用，旨在為其研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）。

1.1.2材料與試劑 阿江欖仁酸（CAS：465-00-9，上海源葉生物科技有限公司）小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院）；青霉素/鏈霉素（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；二甲亞砜（DMSO）（美國(guó)Corning公司）；MTT、LPS、Mouse NO試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；Mouse TNF-α，IL-6 ELISA試劑盒（Bio Swamp公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，用含100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素、10%熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，接種密度為1.5×104細(xì)胞/孔。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為空白對(duì)照組（不加LPS），模型對(duì)照組（加入LPS）、陽(yáng)性對(duì)照組（雷公藤紅素，0.5 μmol/L）、阿江欖仁酸組（1，5，10，20，40， 80，160 μmol/L），培養(yǎng)24 h后，吸取上清液，檢測(cè)細(xì)胞生存率，以及NO、TNF-α和IL-6的水平。

1.2.2細(xì)胞生存率檢測(cè) RAW 264.7細(xì)胞液接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度為1.5×104細(xì)胞/孔，貼壁生長(zhǎng)24 h后，加入 5 μg/ml LPS和不同濃度阿江欖仁酸。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄掉MTT溶液，每孔加150 μl DMSO溶解沉淀，在570 nm測(cè)定OD值。endprint

1.2.3 Griess法檢測(cè)NO含量 RAW 264.7細(xì)胞液接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度為1.5×104細(xì)胞/孔，貼壁生長(zhǎng)24 h。24 h后加入阿江欖仁酸（1，5，10，20，

40，80，160 μmol/L）、雷公藤紅素（0.5 μmol/L）并分別加入LPS（5 μg/ml）培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后在40 μl/孔的細(xì)胞上清液中加入40 μl的Griess反應(yīng)試劑。在570 nm下測(cè)定OD值，計(jì)算NO含量。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)TNF-α及IL-6表達(dá)量 按照試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)TNF-α及IL-6的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以means±SD來(lái)表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0和作圖軟件Graphpad prism 5對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與處理，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1阿江欖仁酸藥物濃度的篩選

在加入LPS及不同給藥濃度后，以MTT法檢測(cè)阿江欖仁酸對(duì)細(xì)胞生存力的影響，結(jié)果顯示阿江欖仁酸不同濃度（0，1，5，10，20，40，80，160 μmol/L）處理組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)圖1），表明阿江欖仁酸濃度在80 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞生存力均>90%。

2.2阿江欖仁酸對(duì) LPS誘導(dǎo)的 NO含量的影響

采用Griess法檢測(cè)NO的表達(dá)量。結(jié)果表明，加入LPS后的細(xì)胞液中NO的含量顯著升高，而阿江欖仁酸給藥組可以使升高的NO含量降低，并與劑量呈正相關(guān)性（P<0.05）。阿江欖仁酸給藥濃度為40 μmol/L和80 μmol/L時(shí)，對(duì)NO的含量的抑制率可達(dá)到50%（見(jiàn)圖2）。

2.3阿江欖仁酸對(duì) LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子含量的影響

采用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)量。結(jié)果顯示，加入LPS后的細(xì)胞液中TNF-α（見(jiàn)圖3A）和IL-6（見(jiàn)圖3B）的表達(dá)量顯著升高，而阿江欖仁酸給藥組能夠劑量依賴性地使升高的炎性細(xì)胞因子含量降低（P<0.05）。

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種廣泛分布在炎癥中其重要作用的先天免疫細(xì)胞[8]。LPS通過(guò)其脂質(zhì)成分可以作用于包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，在LPS的誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞被激活而導(dǎo)致炎癥介質(zhì)（TNF-α，IL-6）的釋放[9]。因此，LPS-誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的模型被廣泛用于抗炎藥物的篩選[10]。IL-6是一個(gè)潛在的炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)許多重要的生理功能，特別是急性和慢性炎癥[11]。TNF參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，包括細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡和壞死。在本研究中，LPS能促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平顯著增加，而阿江欖仁酸可逆轉(zhuǎn)由LPS引起的TNF-α和IL-6的高表達(dá)。這些結(jié)果表明，阿江欖仁酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用。

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