高通量測序分析miRNAs在胃癌新鮮組織與石蠟包埋組織中的表達(dá)

曾文泓，王麗華，唐 丹

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院老干科，江西南昌 330006)

·技術(shù)與方法·

高通量測序分析miRNAs在胃癌新鮮組織與石蠟包埋組織中的表達(dá)

曾文泓1，王麗華2△，唐 丹3

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨四科,江西南昌 330006；3.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院老干科，江西南昌 330006)

目的利用二代測序技術(shù)對(duì)FFPE標(biāo)本進(jìn)行高通量測序及相關(guān)的生物信息學(xué)分析，探討miRNAs在來源于石蠟包埋胃癌組織(FFPE)中的標(biāo)本檢測的可靠性，探討其臨床意義。方法選取2015年和2016年2例胃癌患者手術(shù)切除同一組織的FFPE和新鮮冰凍標(biāo)本，從標(biāo)本中提取RNA并分離構(gòu)建small RNA文庫，采用Illumina測序平臺(tái)測序的方法對(duì)其進(jìn)行高通量測序，統(tǒng)計(jì)各已知miRNAs家族序列的表達(dá)量，構(gòu)建已知miRNAs表達(dá)譜，對(duì)標(biāo)本miRNAs進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，評(píng)估m(xù)iRNAs表達(dá)量的差異變化情況。結(jié)果新鮮冰凍標(biāo)本中提取的總RNA質(zhì)量較高，RNA保存度完整，顯示28S是18S的1.3～1.4倍，從石蠟組中提取的RNA，結(jié)果顯示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明顯，miRNAs表達(dá)譜在冰凍和FFPE標(biāo)本中，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.90和0.86，兩者miRNAs表達(dá)量較一致，具有相關(guān)性。結(jié)論FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性，且可通過二代測序進(jìn)行腫瘤標(biāo)本檢測。

胃腫瘤；miRNA；甲醛固定石蠟包埋；二代測序

胃癌是消化系統(tǒng)疾病中常見的惡性腫瘤之一[1]，最近大量的研究表明miRNAs在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，參與著胃癌形成的多條信號(hào)通路，同時(shí)miRNAs被發(fā)現(xiàn)在腫瘤分期、分級(jí)、預(yù)后及藥物的靶向治療分析等方面具有巨大的潛力[2]。目前，新一代高通量測序已成為基因表達(dá)定量檢測強(qiáng)有力的工具，特別是在定量低豐度的miRNAs研究及揭示微小的基因表達(dá)變化等領(lǐng)域有很大的優(yōu)越性。為了研究miRNAs在來源于石蠟包埋胃癌組織標(biāo)品檢測的可靠性，本研究從FFPE標(biāo)本中分離并構(gòu)建small RNA文庫，采用Illumina測序平臺(tái)的邊合成邊測序的方法對(duì)其進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)，驗(yàn)證該方法的可行性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取了江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2015年和2016年2例胃癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢測分別由兩位臨床醫(yī)師進(jìn)行確診，并采集相關(guān)病理資料。腫瘤位置以病理組織報(bào)告為準(zhǔn)，腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分別參照國際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)(UICC)分類、WHO標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判[3]。首先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗取下的胃癌組織標(biāo)本，把標(biāo)本用組織剪剪切至0.5 mm左右大小，迅速放入液氮罐中進(jìn)行冷凍待用(-80 ℃)，隨后將余下部分用10%甲醛固定后石蠟包埋，歸檔存放于溫室。取病理科石蠟包埋標(biāo)本，無菌操作常規(guī)切片，切片厚度約10 μm，每2～3片放入1個(gè)1.5 mL的滅菌EP管中。

1.2方法

1.2.1RNA提取 于-80 ℃保存的新鮮標(biāo)本在液氮中研磨至粉末狀，加入Trizol試劑(Ambion，#AM12183555)混勻，按照Trizol試劑說明書提取總RNA。使用RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit(Ambion,#AM1975)處理甲醛固定石蠟包埋的標(biāo)本，按照說明書進(jìn)行核酸提取，在純化柱上消化DNA后洗脫得到RNA。

1.2.2Small RNA文庫的構(gòu)建及測序 總RNA用15%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，回收純化18～30 nt的部分，在T4 RNA連接酶的作用下連接RNA Adapter，所得的產(chǎn)物經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增之后采用Illumina高通量測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.2.3測序數(shù)據(jù)基本分析 Illumina測序平臺(tái)的測序數(shù)據(jù)經(jīng)過如下流程進(jìn)行分析：(1)去除測序質(zhì)量較低的序列，去除RNA Adapter污染的序列，去除沒有目的片段的序列，去除包含polyA的序列和去除小于18 nt的小片段序列，得到高質(zhì)量序列，對(duì)其進(jìn)行長度分布統(tǒng)計(jì)。(2)將小RNA序列與基因組進(jìn)行比對(duì)，將其定位到基因組，分析小RNA在基因組上的表達(dá)和分布情況。(3)將小RNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫及Sanger中心的Rfam數(shù)據(jù)庫中的ncRNA(非編碼RNA)分別進(jìn)行分析比對(duì)，去除rRNAs，scRNAs，snoRNAs，snRNAs和tRNAs。(4)將小RNA比對(duì)到mRNA的外顯子和內(nèi)含子，找出來自mRNA降解的片段。(5)將過濾后的序列進(jìn)行互相比對(duì)，找出可以互補(bǔ)、符合siRNA結(jié)構(gòu)特征的小RNA，作為可能的siRNA候選者。(6)通過與miRBase數(shù)據(jù)庫中的所有人miRNAs進(jìn)行比對(duì)分析，識(shí)別miRNAs序列。(7)統(tǒng)計(jì)各已知miRNAs家族序列的表達(dá)量，構(gòu)建已知的miRNAs表達(dá)譜。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將石蠟包埋的標(biāo)本獲得miRNAs表達(dá)量與新鮮組織獲得的miRNAs進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，評(píng)估m(xù)iRNAs表達(dá)量的差異變化情況，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1RNA提取結(jié)果 臨床手術(shù)切除組織標(biāo)本的一般信息：2例胃癌患者的年齡分別為56和61歲，男1例，女1例。從兩份標(biāo)本經(jīng)過檢測提取的總RNA結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)，保存在液氮組中提取的總RNA質(zhì)量較高，RNA保存度完整，顯示28S是18S的1.3～1.4倍，符合完整度要求28S是18S的1～2倍范圍。從石蠟組中提取的RNA結(jié)果顯示有不同程度的降解，28S和18S的波峰不明顯，見圖1。

2.2胃癌小RNA 分析胃癌FFPE標(biāo)本和新鮮標(biāo)本的miRNAs，用Illumina高通量測序平臺(tái)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測序，并構(gòu)建小RNA文庫，去除接頭并過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)。結(jié)果小RNA序列長度分布在10～35 nt，其中22 nt的序列小RNA居多(圖2)隨后排除掉小于18 nt的序列后，得到了最終目標(biāo)序列(表1)。將這些小RNA與Rfam、miRBase、GenBank,進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)將小RNA序列兩兩比對(duì)以尋找siRNA，最后進(jìn)行了注釋(表2)。

圖1 Agilent 2100檢測RNA質(zhì)量

A：Frozen-1；B：FFPE-1；C：Frozen-2；D:FFPE-2

圖2 小RNA長度分布圖

表2 比較分別在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA檢測結(jié)果[n(%)]

續(xù)表2 比較分別在-20 ℃保存和FFPE保存的小RNA檢測結(jié)果[n(%)]

2.3高通量測序miRNAs表達(dá)譜 通過檢測兩對(duì)不同年份的同一胃癌組織冰凍標(biāo)本和FFPE標(biāo)本進(jìn)行高通量測序，miRNAs表達(dá)譜在冰凍和FFPE標(biāo)本中，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.90和0.86(圖3)。

A:2015年；B:2016年

圖3同一胃癌組織不同時(shí)間冰凍標(biāo)本與FFPE標(biāo)本中小RNA的Spearman相關(guān)分析

3 討 論

miRNAs是臨床醫(yī)學(xué)研究中新興的熱點(diǎn)分子，參與疾病的信號(hào)通路，從而對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療有重要作用[4]。從現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可作為抑癌基因或者癌基因參與胃癌發(fā)展的某個(gè)階段，它可與其他抑癌基因、癌基因及凋亡相關(guān)基因產(chǎn)生相互作用影響胃癌的進(jìn)程。由于其多功能性特點(diǎn)使它在胃癌的標(biāo)志物診斷和治療方面有巨大的應(yīng)用潛力，有利于提高胃癌的早期診斷率[5-6]。目前鑒定和確證腫瘤分子標(biāo)志物需要大量的臨床標(biāo)本，而低溫冰凍組織和FFPE組織標(biāo)本是生物醫(yī)學(xué)研究中重要和廣泛的標(biāo)本來源，很多醫(yī)院病理科及醫(yī)療研究所都有大量的存檔。從相關(guān)組織中提取RNA或者DNA來獲得疾病相關(guān)的基因表達(dá)信息，進(jìn)行疾病前瞻性、回顧性研究，鑒別不同疾病臨床特征和預(yù)后轉(zhuǎn)歸有關(guān)的差異表達(dá)基因，篩選出作用的靶基因，分析疾病的調(diào)控機(jī)制路徑等，這是目前研究相關(guān)疾病在分子水平的普遍做法，但經(jīng)過甲醛固定處理過的石蠟包埋塊標(biāo)本經(jīng)歷了長時(shí)間的保存，其內(nèi)部發(fā)生了核酸與蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，單甲基化基團(tuán)的修飾等，RNA不可避免地發(fā)生降解，對(duì)標(biāo)本總RNA提取及下游逆轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)定量分析產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)提取冰凍組織和FFPE組織標(biāo)本獲得一定質(zhì)量的RNA，可以達(dá)到進(jìn)一步分子生物學(xué)檢測的要求[7-9]。通過高通量測序2對(duì)不同年份的同一胃癌組織冰凍標(biāo)本和FFPE標(biāo)本，miRNAs表達(dá)譜在冰凍和FFPE標(biāo)本中，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.90和0.86，兩者miRNAs表達(dá)量較一致，具有相關(guān)性，研究還顯示組織標(biāo)本的RNA降解、片段化程度基于標(biāo)本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲(chǔ)存的條件而發(fā)生變化，同一胃癌組織不同保存年份中的冰凍組織標(biāo)本和FFPE組織標(biāo)本的RNA，冰凍組織中提取的總RNA質(zhì)量比FFPE組織的要高，F(xiàn)FPE保存方法其RNA的降解程度比冰凍的要多，不同保存時(shí)間的冰凍標(biāo)本RNA的降解會(huì)逐漸增加。FFPE標(biāo)本中分離到的核酸比新鮮標(biāo)本或冰凍標(biāo)本的相對(duì)分子質(zhì)量更低，石蠟組織標(biāo)本提取的RNA通常會(huì)有一定的降解或甲醛修飾，而miRNAs分子的大小通常只有20～22 bt，自身片段短優(yōu)勢可以避免被修飾和酶的破壞降解[10]。由于活體細(xì)胞中miRNAs只有極少數(shù)處于游離狀態(tài)，且可能miRNAs通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)靶向結(jié)合mRNA，發(fā)揮阻遏轉(zhuǎn)錄后翻譯功能或降解RNA的作用，miRNAs受到RISC復(fù)合體的保護(hù)，所以石蠟組織中的大部分miRNAs未被修飾[11]，而在研究檢測不同的臨床標(biāo)本中，具有高度的穩(wěn)定性和重復(fù)性是作為有價(jià)值的腫瘤候選標(biāo)志物的一個(gè)重要特點(diǎn)，因此選擇miRNAs作為腫瘤候選標(biāo)志物具有一定的臨床意義[12]。本研究顯示通過二代測序技術(shù)可以利用石蠟組織標(biāo)本研究miRNAs在疾病中的作用，這為后期大樣本腫瘤標(biāo)志物研究篩選提供了很好的基礎(chǔ)，可能為解決樣本量不足及檢測方案的選擇提供幫助。

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HighthroughputsequencinganalysisofmiRNAsexpressioninfreshgastriccancertissuesandparaffinembeddedtissues*

ZengWenhong1,WangLihua2△,TangDan3

(1.SchoolofBasicMedicine,JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330004,China;2.DepartmentofOrthopedics,AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang,Jiangxi330006,China; 3.DepartmentforGeriatricDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330004,China)

ObjectiveTo analyze formalin-fixed and paraffin-embedded(FFPE) sample by next generation sequencing(NGS) technology for high throughput DNA sequencing and related bioinformatics analysis,and to explore the reliability and clinic significance of miRNAs in the detection of sample from FFPE gastric cancer tissue.MethodsFFPE and fresh frozen samples of the same tissue were excised from 2 cases of gastric cancer in 2015 and 2016.RNA was extracted from the samples and the small RNA library was isolated and constructed,and high throughput DNA sequencing was conducted with Illumina sequencing platform.The DNA sequencing results were analyzed by quantifying the expression of known miRNAs families sequence,and the expression profiling of known miRNAs was constructed.Spearman correlation analysis was performed on the miRNAs of the samples to assess the difference in the expression of miRNAs.ResultsThe total RNA extracted from the fresh frozen sample had higher quality and complete RNA coverage,and the results showed that the 28S was 1.3-1.4 times of 18S.The RNA extracted from the FFPE sample showed different degrees of degradation,and the peaks of 28S and 18S were not significant.The spearman correlation of miRNAs expression profiling in frozen and FFPE samples was 0.90 and 0.86 respectively,and the expression levels of miRNAs in two samples were consistent and had significant correlation.ConclusionmiRNAs in FFPE sample can retain certain level of integrity and can be used in tumor test by NGS.

gastric neoplasms; miRNAs; formalin-fixed and paraffin-embedded; next generation sequencing

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.025

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目(20175539、20155389)。

曾文泓(1984-)，講師，碩士，主要從事臨床基礎(chǔ)研究。△

，E-mail：89463632@qq.com。

R35

A

1671-8348(2017)32-4550-03

2017-04-20

2017-09-21)