左甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及機制探討

馮 佳,馬昌義,張艷珍

(1.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院乳腺甲狀腺科 644000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，四川瀘州 646000)

·論著·基礎(chǔ)研究

左甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及機制探討

馮 佳1,馬昌義1,張艷珍2

(1.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院乳腺甲狀腺科 644000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，四川瀘州 646000)

目的探討左甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的影響及可能機制。方法SD 雄性大鼠60只，按隨機數(shù)字表分為A、B、C、D組，每組15只。其中B、C、D組大鼠均采取PLT制備甲狀腺功能減退模型，A組作為正常對照。造模成功后C組和D組大鼠每日分別腹腔注射左甲狀腺素(6 μg/100 g)，D組在C組的基礎(chǔ)上給予在飲用水中加入0.005%多奈哌齊。2周后，采用Morris水迷宮觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶行為；用放射免疫法測定血清甲T3、T4 水平；采用免疫組織化學(xué)法和Western blot 法檢測各組大鼠海馬syntaxin-1 的表達(dá)情況。結(jié)果B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長，游泳速度明顯變慢；C 組和D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快；B組的T3、T4水平明顯降低。C組和D組的T3、T4水平明顯升高，其以D組升高最明顯。免疫組織化學(xué)法和Western blot法結(jié)果顯示B組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1 表達(dá)水平低于對照組，C 組和D組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1 表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論左甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊可改善成年期甲狀腺功能減退癥大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，其機制與升高海馬組織syntaxin-1的表達(dá)有關(guān)。

左旋甲狀腺素；多奈哌齊；甲狀腺功能減退；突觸融合蛋白1；大鼠,Sprague-Dawley

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)，是指由多種因素引起甲狀腺激素合成、分泌或生物效應(yīng)不足，表現(xiàn)為以甲狀腺功能減退為特點的臨床綜合征[1]。甲狀腺激素是三碘甲狀腺原氨酸(triidothyronine,T3)和四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)的總稱，是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺甲狀腺所分泌的激素，在體內(nèi)以游離或者與血清蛋白的形式存在。在人或動物生長發(fā)育的各個階段，都不能缺少甲狀腺激素。該激素在維持新陳代謝及腦神經(jīng)系統(tǒng)的的正常發(fā)育方面扮演著重要的角色，且與認(rèn)知功能密切相關(guān)。既往研究證實，甲狀腺激素缺乏能損害神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育明顯滯后，臨床以認(rèn)知、行為、運動等腦的機能障礙為主要特征表現(xiàn)，顯微鏡下可見大腦及小腦的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少[2]。突觸融合蛋白1(syntaxin-1)是分布于神經(jīng)細(xì)胞突觸前膜上的蛋白，有文獻(xiàn)指出甲減導(dǎo)致的的認(rèn)知功能障礙可能與海馬內(nèi)的syntaxin-1水平失衡有一定相關(guān)性[3]。左甲狀腺素替代治療是對甲減患者的常規(guī)干預(yù)措施，然而對腦認(rèn)知功能改善的程度的報道并不一致。大部分研究認(rèn)為，常規(guī)劑量的左甲狀腺素替代治療并不能全恢復(fù)syntaxin-1水平[4]。一般大劑量的T4才能最大程度地恢復(fù)腦功能。值得注意的是，近年來，一種可治療阿爾茨海默病的藥物——多奈哌齊，受到眾多學(xué)者的關(guān)注。有研究認(rèn)為，甲減與阿爾茨海默病發(fā)病機制相似：均為腦內(nèi)乙酰膽堿(Ach)水平下降，多奈哌齊通過增加突觸間隙Ach水平，減輕甲減患者的認(rèn)知損傷，或許可以用來作為甲減治療的輔助藥物。基于此，本研究以成年期甲減大鼠模型為研究對象，給予左甲狀腺素和多奈哌齊聯(lián)合治療進(jìn)行干預(yù)，同時以常規(guī)劑量作為對照，通過檢測血清T3、T4水平及syntaxin-1在各組大鼠前額葉內(nèi)的蛋白表達(dá)情況，探討左甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊治療是否可以恢復(fù)成年期甲減腦損傷及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(245±30)g，購自上海市動物疫病預(yù)防控制中心。動物證號：SYXK(滬)2015-0013。

1.2主要儀器與試劑 病理切片機購自湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡(蔡司LSM 510z)購自上海信裕生物科技有限公司；電子天平購自德國賽多利斯公司；放射免疫 γ 計數(shù)器(GC-300 型) 購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；形態(tài)學(xué)圖像分析軟件(JD-801)購自江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。丙基硫氧嘧啶(PTU)購自上海博研生物科技有限公司；左旋甲狀腺素(LT4)購自天津赫索制藥有限公司；多奈哌齊片購自重慶植恩藥業(yè)有限公司；4%多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛購自北京索萊寶科技有限公司；T3、T4 放射免疫試劑盒購自北京原子高科核技術(shù)應(yīng)用股份有限公司；兔抗syntaxin-1蛋白多克隆抗體購自Sigma 公司；生物素標(biāo)記兔抗小鼠lgG S-P 超敏試劑盒購自上海樊克生物科技有限公司；DAB 染色試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司。EPS-300 電泳儀、VE-186 轉(zhuǎn)膜電槽購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司。Morris 水迷宮系統(tǒng)購自上海欣軟信息科技有限公司。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組和干預(yù)方式 所有實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后。把符合實驗條件的SD大鼠按隨機數(shù)字表分為4組，給予不同干預(yù)方式。正常對照組(A組)：常規(guī)喂養(yǎng)，灌服等體積的生理鹽水。甲減組(B組)：每日腹腔注射丙硫氧嘧啶(PTU)1 mg/100 g，持續(xù)6周，建立成年期甲減大鼠模型。LT4替代組(C組)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)2周；LT4聯(lián)合多奈哌齊(D組)：4周后每日腹腔注射LT4(6 μg/100 g)，再繼續(xù)喂養(yǎng)2周，同時在大黃每日飲用水中加入 0.005%多奈哌齊。

1.3.2行為學(xué)檢測 藥物干預(yù) 2周后對所有實驗對象大鼠行 Morris 水迷宮行為學(xué)測試，考查大鼠認(rèn)知及記憶能力。盡量保持室內(nèi)光線一致，并保證迷宮附近物品及空間線索不改變。重點觀察大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度的變化。

1.3.3標(biāo)本制備

1.3.3.1血清制備 在進(jìn)行行為學(xué)檢測后，于次日晨9：00-11：00完成大鼠的采血工作。給予 7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射，待麻醉顯效后暴露胸腔，采集腹主動脈血 (每只1.5 mL)，高速離心后，取上清液存放于-20℃冰箱保存?zhèn)錅y。

1.3.3.2腦標(biāo)本制備 取血結(jié)束后將所有實驗動物斷頭處死，迅速于冰上剝離腦組織，右腦置于 4%的多聚甲醛溶液中固定1周，行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚6 μm，每只大鼠取5個包含前額葉的切片，置于4 ℃ 冰箱保存待做免疫組織化學(xué)檢測。左腦分離出海馬組織后存放于-80 ℃冰箱保存用于免疫印跡試驗(Western blot)。

1.3.3.3放射免疫法測定血清甲T3、T4水平 T3、T4 水平的檢測采用放射免疫法，測儀器為GC-300型放射免疫γ計數(shù)器，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。質(zhì)控范圍見表1。

1.3.4采用超敏SP 法行免疫組化檢測 組織切片行SP法行免疫組化染色，以棕黃色為判定為陽性染色。在 200 倍視野下拍攝前額葉的各層(分子層、外顆粒層、外椎體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)椎體細(xì)胞層)。再采用雙盲法用生物圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，計算平均吸光度值(A)。

表1 T3和T4質(zhì)控范圍(mmol/L)

1.3.5Western blot 采集大鼠海馬背側(cè)組織置于勻漿器中，加裂解液冰上勻漿，離心，提取突觸小體后，以BCA 法行蛋白定量分析。蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜(電流為300 mA，轉(zhuǎn)膜時間為60 min)，封閉。接下來用抗syntaxin-1 多克隆抗體，1∶2 500室溫孵育2 h。立即加入濃度為1∶160 000的兔抗山羊IgG室溫孵育1.5 h，棄二抗，PBS洗膜，在 X 線片暗盒內(nèi)曝光，再用顯影液顯影。通過syntaxin-1 與內(nèi)參GAPDH的條帶A值的比值來代表目標(biāo)蛋白的水平。

2 結(jié) 果

2.1觀察大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度的變化 與A組相比，B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長(Plt;0.05)，游泳速度明顯變慢(Plt;0.05)；與B組相比，C、D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快(Plt;0.05)，C、D兩組間比較無明顯差異，與A組相比差異也無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度變化

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較

2.2觀察大鼠血清T3、T4 水平的變化 與A組相比，B組的T3、T4水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。與B組相比，C、D組的T3、T4水平明顯升高(Plt;0.05)，D組比C組升高更加明顯(Plt;0.05)，見表3。

表3 大鼠血清T3、T4 水平濃度的變化

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較；c：Plt;0.05，與C組比較

2.3免疫組化檢測 syntaxin-1廣泛分布于前額葉皮質(zhì)各層的神經(jīng)細(xì)胞膜，見圖1。A組：Ⅰ層可見棕褐色顆粒密集和Ⅱ?qū)泳梢娮攸S色顆粒狀致密排列；Ⅲ層分為深、淺兩層，呈疏松排列的棕褐色錐體細(xì)胞及少量星形細(xì)胞；Ⅳ層可見大量排列緊密的棕褐色色星形細(xì)胞和微量錐體細(xì)胞；Ⅴ層大量棕黃色大錐體細(xì)胞和少量小星形細(xì)胞組成。B組：細(xì)胞的排列和分布于A組相似相似，但密度比A組小。對A組和B組大鼠額葉syntaxin-1的表達(dá)情況進(jìn)行量化分析后發(fā)現(xiàn)：與A組比較，B組大鼠前額葉皮質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物A值顯著降低(Plt;0.05)，見表4。syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物在各組大鼠前額葉皮質(zhì)Ⅲ層的表達(dá)見圖2，syntsxin-1在各自大鼠前額葉各層的A值比較見表5。

2.4Western blot 法檢測各組大鼠海馬syntaxin-1表達(dá)變化 A、B、C、D組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1表達(dá)水平分別為0.527±0.098、0.267±0.085、0.578±0.092、0.628±0.087。B組syntaxin-1水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05);C、D組syntaxin-1水平比B組明顯升高(Plt;0.05)，與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。D組syntaxin-1水平比C組高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。見圖3。

表4 A、B組大鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)syntaxin-1的A值比較

a：Plt;0.05，與A組比較

圖1 syntsxin-1在A組和B組大鼠前額葉Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ層的表達(dá)情況的典型圖片(SP×200)

圖2 syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物在各組大鼠前額葉皮質(zhì)Ⅲ層的表達(dá)(SP×200)

組別Ⅰ層Ⅱ?qū)英髮英魧英鯇覣組13.35±1.1711.23±0.8710.24±0.7810.89±0.7811.76±0.86B組8.68±0.57a7.57±0.39a7.57±0.67a6.87±0.36a7.24±0.54aC組10.95±0.89b10.71±0.87b9.34±1.18b9.37±0.59b9.89±1.22bD組11.87±1.76b11.12±0.83b9.89±1.09b10.37±0.64b10.89±0.79b

a：Plt;0.05，與A組比較；b：Plt;0.05，與B組比較

圖3 各組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1 表達(dá)水平

3 討 論

甲減是血清T3、T4水平下降的一種常見的內(nèi)分泌疾病，各個年齡段均可發(fā)病[5]。既往研究證實，甲狀腺激素缺乏可導(dǎo)致新生大腦發(fā)生不可逆的損傷。即使及時補充了甲狀腺激素，兒童期語言能力、智商得分也低于正常孩子，上述現(xiàn)象表明甲狀腺激素與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相關(guān)[6]。

研究表明，甲狀腺激素調(diào)節(jié)大腦末端分化過程。甲減狀態(tài)下大腦發(fā)生明顯的變化，如大腦皮質(zhì)和小腦浦肯野細(xì)胞的神經(jīng)纖維的發(fā)育遲緩，數(shù)量減少[7]。成年甲減能導(dǎo)致不同程度認(rèn)知功能及相關(guān)腦區(qū)的損害，此種損害通過給予左旋甲狀腺素(LT4)進(jìn)行替代治療能得到一定程度的修復(fù)。至于甲減患者的認(rèn)知功能是否能夠完全恢復(fù)存在爭議，甚至有觀點質(zhì)疑左旋甲狀腺素常規(guī)劑量替代治療甲減的效果，因此亟待挖掘治療甲減的新藥，為甲減的治療提供新的思路。

在制備甲減模型的實驗動物中，大鼠應(yīng)用最多[8-11]。因為大鼠的甲狀腺機能與腦部發(fā)育過程與人類的相似度最高，可模擬和重現(xiàn)人類甲減的自然病程，只不過造模所需時間更長，一般需要4～6周。本研究選擇SD雄性大為造模對象，是為排除雌激素對甲狀腺激素合成和分泌的影響，而且造模周期符合傳統(tǒng)造模周期。另外，在誘導(dǎo)甲減模型的化學(xué)藥物中，丙硫氧嘧啶(PTU)化學(xué)誘導(dǎo)法應(yīng)用頻率最高其通過抑制甲狀腺激素的合成的關(guān)鍵酶過氧化物酶來發(fā)揮作用的[9]。PTU的給藥途徑可以是口服或注射，本研究對SD雄性大鼠采取持續(xù)腹腔注射PTU(1 mg/100 g)6周的方法進(jìn)行造模，從表3可以看出，B組大鼠的T3、T4水平明顯低于A組，該結(jié)果提示大鼠甲減模型制備成功。

目前，在行為神經(jīng)科學(xué)研究中，嚙齒類動物的學(xué)習(xí)與記憶能力的評估常選用是國際通用的水迷宮實驗[12]。本研究采用水迷宮實驗對各組大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組大鼠的逃避潛伏期和游泳路程明顯延長、游泳速度明顯變慢。結(jié)果表明B組的學(xué)習(xí)和記憶能力呈下降趨勢。經(jīng)過藥物干預(yù)后C、D組的逃避潛伏期和游泳路程明顯縮短，游泳速度明顯增快，可見，如大部分報道所示，LT4具有改善腦功能，提高記憶能力的作用。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合組治療組效果更明顯，分析原因而且可能與單純使用LT4 比較，多奈哌齊的加入能夠更有效地恢復(fù)樹突棘數(shù)量增加TRs的結(jié)合率，從而發(fā)揮更大的生理效應(yīng)。

值得注意的是，為從分子水平對LT4的治療甲減的可能機制進(jìn)行探討，本研究以大鼠海馬突觸小體內(nèi)syntaxin-1蛋白為切入點。 syntaxin-1 蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[13]。研究顯示甲減大鼠不同的組織部位syntaxin-1 表達(dá)水平不太統(tǒng)一，究其原因可能與不同組織對甲狀腺激素缺乏的反應(yīng)性有差異有關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組組比較，甲減組大鼠前額葉皮質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ層syntaxin-1的表達(dá)是明顯降低的，與該組T3、T4 水平下降是一致的。經(jīng)過LT4和LT4聯(lián)合多奈哌齊治療后syntaxin-1 表達(dá)恢復(fù)至對照組水平，與此對應(yīng)的血清LT4和LT3也恢復(fù)至對照組水平。且記憶和學(xué)習(xí)能力等行為學(xué)指標(biāo)也有改善。該結(jié)果提示：甲狀腺激素和多奈哌齊對 syntaxin-1 蛋白表達(dá)呈正性調(diào)節(jié)，甲狀腺激素替代治療使其恢復(fù)行為學(xué)的異常。然而，與單純甲狀腺激素替代治療相比，LT4聯(lián)合多奈哌齊治療后syntaxin-1蛋白表達(dá)有恢復(fù)得更理想的趨勢，其光密度絕對值更接近正常對照組。分析原因可能與多奈哌齊的加入有關(guān)。多奈哌齊是第二代膽堿酯酶(AChE)抑制劑，通過抑制膽堿酯酶的活性減少ACh的水解，從而升高Ach水平。臨床上常用來治療阿爾茨海默病，該病的特點就是記憶的進(jìn)行性衰退，是一種中樞退行性疾病，研究顯示，多奈哌齊可延緩阿爾茨海默病中海馬的萎縮進(jìn)程，起保護(hù)神經(jīng)的作用。有學(xué)者也嘗試單獨用多奈哌齊治療甲減動物獲得成功，然而，具體機制尚不明確。有學(xué)者指出與抑制AChE有關(guān)，但有些學(xué)者提出相反意見，因為其他一些具有抑制中樞AChE的藥物如新斯的明并不能起到保護(hù)神經(jīng)的作用。 有的學(xué)者認(rèn)為多奈哌齊可能通過激活海馬內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)素受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15]。

綜上所述，成年期甲減大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力是下降的，與海馬內(nèi)syntaxin-1 表達(dá)水平減少有關(guān)，而甲狀腺素可以在一定程度上改善甲減大鼠的行為學(xué)指標(biāo)，與上調(diào)syntaxin-1表達(dá)水平有關(guān)，尤以甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊為甚。然而，由于檢測指標(biāo)的局限，尤以甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊是怎么保護(hù)神經(jīng)的？究竟多大的聯(lián)合劑量才是保護(hù)神經(jīng)的最佳劑量？本研究尚未探明，需設(shè)計更加周密而詳盡的方案繼續(xù)深入研究。

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Effectoflevothyroxinecombinedwithdonepezilhydrochlorideinadultratswithhypothyroidismanditsmechanism

FengJia1,MaChangyi1,ZhangYanzhen2

(1.DepartmentofBreastandThyroidSurgery,theSecondPeople′sHospitalofYibin,Yibin,Sichuan644000,China;2.DepartmentofBreastSurgery,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the effect and potential mechanism of levothyroxine combined with donepezil hydrochloride in adulthood hypothyroidism rats.MethodsA total of 60 male SD rats was divided by random number table into group A,group B,group C and group D,15 rats in each group.The rats in group B,group,C and group D were treated with PLT to prepare hypothyroidism model,and group A was used as the control group.After successful preparation of the model,rats in group C and group D were injected intraperitoneally with levothyroxine(6 g/100 g) every day,and then group D was given another 0.005% donepezil in drinking water.After 2 weeks,the learning and memory behavior of rats was observed by Morris water maze;the levels of serum T3 and T4 were measured by radioimmunoassay;the expression of syntaxin-1 in hippocampus was detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe escape latency and swimming distance of rats were prolonged significantly in group B but shorted significantly in group C and group D,and swimming speed was significantly slowed in group B but significantly strengthened in group C and group D;the levels of T3 and T4 were obviously decreased in group B but increased significantly in group C and group D,especially in group D.The results of immunohistochemistry and Western blot showed that the expression level of syntaxin-1 in hippocampus of rats was lower in group B compared to control group but increased significantly in both group C and group D.ConclusionLevothyroxine combined with donepezil hydrochloride can improve the learning and memory ability in adult rats with hypothyroidism,and its mechanism is related to the increase of expression of synaptotagmin-1 in hippocampus.

levothyroxine;donepezil hydrochloride;hypothyroidism;syntaxin-1;rats,Sprague-Dawley

馮佳(1980-)，主治醫(yī)生，本科，主要從事乳腺外科方面的研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.32.006

R581.2

A

1671-8348(2017)32-4484-04

2017-04-12

2017-06-13)