秸稈發(fā)酵飼料高產(chǎn)蛋白酵母菌株分離和篩選

陸敏 蘭宗寶 何立貴 趙武 姜源明 劉偉 孫建華 俸祥仁,4* 李顯 何莫斌

（1，廣西百朋種畜場(chǎng) 541502；2，廣西農(nóng)科院農(nóng)業(yè)科技信息研究所 530001；3，廣西獸醫(yī)研究所 530001；4，廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司 530001）

秸稈發(fā)酵飼料高產(chǎn)蛋白酵母菌株分離和篩選

陸敏1蘭宗寶2何立貴1趙武3姜源明3劉偉3孫建華3俸祥仁1,4*李顯1何莫斌1

（1，廣西百朋種畜場(chǎng) 541502；2，廣西農(nóng)科院農(nóng)業(yè)科技信息研究所 530001；3，廣西獸醫(yī)研究所 530001；4，廣西南寧強(qiáng)微農(nóng)牧科技有限公司 530001）

為篩選出高產(chǎn)蛋白酵母菌株，推進(jìn)秸稈發(fā)酵飼料在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。利用培養(yǎng)基平板劃線法從牛瘤胃食糜樣本中分離篩選出高產(chǎn)蛋白酵母菌株，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并依據(jù)生長(zhǎng)曲線篩選出可作為秸稈發(fā)酵飼料用高產(chǎn)蛋白酵母菌。從牛瘤胃食糜樣本中共分離獲得10株菌落形態(tài)和細(xì)胞特征較明顯的疑似酵母菌株，分別編號(hào)為x1～x10。經(jīng)正交試驗(yàn)L16(44)優(yōu)化其培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產(chǎn)量最高。在10株分離酵母菌株中，生物產(chǎn)量最高的4株分別是x9號(hào)、x1號(hào)、x10號(hào)和x5號(hào)。其中，x9號(hào)和x1號(hào)菌株適的應(yīng)期較短，在2h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8h后達(dá)穩(wěn)定期；x10號(hào)和x5號(hào)菌株的適應(yīng)期較長(zhǎng)，4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，1 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。綜合酵母菌株的培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果，確定假絲酵母屬菌株最適宜作為秸稈發(fā)酵飼料高產(chǎn)蛋白酵母菌。

青貯飼料；酵母菌；生物產(chǎn)量；分離；篩選；正交試驗(yàn)

隨著畜牧業(yè)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，酵母類產(chǎn)品開發(fā)利用已成為飼料工業(yè)的新領(lǐng)域[1]。利用酵母菌發(fā)酵飼草飼料，具有成本低、原料廣、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，可提高飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率和吸收率，減少飼料原料浪費(fèi)，同時(shí)緩解蛋白質(zhì)飼料資源日益短缺的矛盾，促進(jìn)我國(guó)畜牧業(yè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型，推動(dòng)畜牧業(yè)進(jìn)一步發(fā)展[2,3]。青貯飼料中的微生物雖以乳酸菌為主，但酵母菌的種類和數(shù)量也不容忽視[4]。酵母菌利用青貯飼料中的糖分繁殖可增加青貯飼料的蛋白含量，同時(shí)生成乙醇等，使青貯飼料具有酒香味[5]。張秋華等[6]研究表明，采用酵母菌發(fā)酵雜粕（由豆粕、玉米臍子粕、菜籽粕和棉籽粕組成)生產(chǎn)菌體蛋白飼料的最佳培養(yǎng)基配方為接種量6%，料水比1.0∶1.4，氮源添加量3.5%(1.5%尿素+2.0%硫酸銨)，溫度30℃，發(fā)酵周期24h，此條件下發(fā)酵終產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量57.76%，較發(fā)酵前提高48.33%。周廣麟等[7]研究確定了以纖維素酶和木聚糖酶與酵母菌協(xié)同發(fā)酵葡萄皮渣生產(chǎn)豬飼料的最佳配比為葡萄皮渣∶豆粕∶麩皮∶玉米面=2∶2∶1∶2；酶最適條件：纖維素酶3U/g，木聚糖酶5U/g，作用溫度50℃，時(shí)間72h。王雅波等[8]研究表明，采用畢赤酵母菌2.3250發(fā)酵的方法降解玉米皮中的纖維素類物質(zhì)，能使其充分轉(zhuǎn)化為高附加值的飼料蛋白。因此，篩選出高產(chǎn)蛋白酵母菌株對(duì)大力發(fā)展秸稈發(fā)酵飼料具有重要意義。本研究利用培養(yǎng)基平板劃線法從富含酵母菌的牛瘤胃內(nèi)容物中分離出酵母菌，并通過正交試驗(yàn)對(duì)分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，為推進(jìn)秸稈發(fā)酵飼料在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛瘤胃食糜樣本采自南寧市某屠宰場(chǎng)，采樣后裝入封口袋中密封，及時(shí)送回試驗(yàn)室并置于4℃冰箱中保存。麥芽汁粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、瓊脂和純凈水等從市場(chǎng)購(gòu)置，玉米秸稈粉從農(nóng)戶處收購(gòu)，烘干粉碎。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛瘤胃食糜中酵母菌增菌培養(yǎng)及分離純化

稱取新鮮牛瘤胃食糜樣品1.0g，均化后加入0.85%生理鹽水100ml，在180r/min、30℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)30min。然后用平板稀釋法在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上接種增菌培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)3d，挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)2～3次，將純化后得到的酵母菌單菌落編號(hào)接種于麥芽汁瓊脂斜面上，30℃恒溫培養(yǎng) 2～3d。

1.2.2 酵母菌生理生化鑒定

在麥芽汁粉培養(yǎng)基上接種純化酵母菌菌株，30℃恒溫培養(yǎng)48h后觀察菌落特征、細(xì)胞形態(tài)及子囊孢子、菌絲、擲孢子的形成情況，并進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、乙醇同化試驗(yàn)、KNO3同化試驗(yàn)和類淀粉化合物測(cè)定。

1.2.3 優(yōu)化酵母菌培養(yǎng)條件

采用正交試驗(yàn)L16(44)對(duì)酵母菌培養(yǎng)條件（溫度、初始pH、接菌量和裝液量)進(jìn)行4個(gè)水平檢測(cè)（表1)，優(yōu)化培養(yǎng)條件，并篩選出生長(zhǎng)性能較好的酵母菌菌株。然后采用玉米秸稈粉培養(yǎng)基，在不同條件下培養(yǎng)48h，測(cè)定其生物量。生物量測(cè)定：取1.0ml試驗(yàn)生長(zhǎng)菌液，用蒸餾水進(jìn)行40倍稀釋，以接種前培養(yǎng)基同樣稀釋40倍為空白，分光光度計(jì)測(cè)定660nm處的OD。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 分離酵母菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果

共分離出10株菌落形態(tài)和細(xì)胞特征較明顯的疑似酵母菌株，分別編號(hào)為x1～x10。在高倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)和細(xì)胞特征，然后根據(jù) 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步判定細(xì)菌屬。

由表2和表3可看出，x1號(hào)菌株呈乳白色，無醭膜，細(xì)胞形態(tài)為卵圓形，為多端芽殖，有菌絲生成，芽殖繁殖，無擲孢子，可發(fā)酵葡萄糖，KNO3同化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，類淀粉物質(zhì)生成和乙醇同化試驗(yàn)均為陰性，故初步判定為酒香酵母屬。

x2號(hào)菌株呈乳白色，細(xì)胞形態(tài)為卵圓形，僅一端芽殖，有菌絲形成，芽殖繁殖，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、類淀粉物質(zhì)生成試驗(yàn)和KNO3同化試驗(yàn)均呈陰性，乙醇同化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，故初步判定為瓶形酵母屬。

x3號(hào)和x5號(hào)菌株的顏色均為白色，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，多端芽殖，無菌絲生成，芽殖繁殖，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、類淀粉物質(zhì)生成試驗(yàn)和乙醇同化試驗(yàn)均呈陰性，根據(jù) 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》可初步判定這兩株菌株為卵孢酵母屬。

x4號(hào)菌株呈乳白色，細(xì)胞形態(tài)圓形，兩端芽殖，有菌絲生成，芽殖繁殖，有子囊內(nèi)含有1～2個(gè)帽形孢子，類淀粉物質(zhì)生成試驗(yàn)、KNO3同化試驗(yàn)和乙醇同化試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)呈陰性，故初步判定為裂芽酵母屬。

x6號(hào)菌株呈乳白色，細(xì)胞形態(tài)卵圓形，多端芽殖，無菌絲生成，芽殖繁殖，有擲孢子生成并伴有鎖狀聯(lián)合，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)和KNO3同化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，類淀粉物質(zhì)生成試驗(yàn)和乙醇同化試驗(yàn)呈陰性，故初步判定為鎖合擲孢酵母屬。

x7～x10號(hào)菌株顏色呈白色或乳白色，細(xì)胞形態(tài)圓形，有假菌絲，且可形成真菌絲，芽殖繁殖，無有性繁殖，類淀粉物質(zhì)生成試驗(yàn)呈陰性，根據(jù) 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步判定x7～x10號(hào)菌株為假絲酵母屬。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化篩選結(jié)果

正交試驗(yàn)L16(44)結(jié)果表明，x1～x10號(hào)菌株的最佳培養(yǎng)組合均為A2B1C4D3(表4)，即在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產(chǎn)量最高。在10株分離酵母菌株中，生物產(chǎn)量最高的4株分別是x9號(hào)（OD660nm=1.6220)、 x1號(hào)（OD660nm=1.5765)、 x10號(hào)(OD660nm=1.5738)和x5號(hào)（OD660nm=1.5709)。

2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

將優(yōu)化培養(yǎng)篩選出的4株分離酵母菌菌株按照其最佳培養(yǎng)條件搖床（180r/min)培養(yǎng)48h，測(cè)定各菌株的生長(zhǎng)曲線。由附圖可知，x9號(hào)和x1號(hào)菌株適的應(yīng)期較短，在2h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速度較快，8h后達(dá)穩(wěn)定期；x10號(hào)和x5號(hào)菌株的適應(yīng)期較長(zhǎng)，4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

3 討論

酵母菌是單細(xì)胞真菌，具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在自然界廣泛存在。酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)占細(xì)胞干重的32～75%，糖類物質(zhì)占細(xì)胞干重的27～63%。酵母細(xì)胞中還富含維生素、多種消化酶和未知的生長(zhǎng)因子，因此在食品、醫(yī)療保健、飼料、釀酒、生物工程等行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[5]。經(jīng)發(fā)酵菌發(fā)酵過的飼料，含有更多的活性益生菌菌體、各種酶、各級(jí)代謝產(chǎn)物、多種維生素、活性小肽、氨基酸、抑菌物質(zhì)等，既改善動(dòng)物飼料的品質(zhì)和適口性，消化吸收率明顯提高，還具有維持動(dòng)物腸道菌群平衡、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物免疫力等作用[3,9,10]。但目前市場(chǎng)上可用于飼料發(fā)酵的酵母菌產(chǎn)品較少，且不同酵母菌的培養(yǎng)條件也不同。

表2 分離酵母菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征

表3 分離酵母菌的生理生化鑒定結(jié)果

表4 分離酵母菌的正交試驗(yàn)結(jié)果

附圖4 株酵母菌分離株的生長(zhǎng)曲線

本研究利用培養(yǎng)基平板劃線法從牛瘤胃食糜樣本中分離獲得10株菌落形態(tài)和細(xì)胞特征較明顯的疑似酵母菌株，經(jīng)正交試驗(yàn)L16(44)優(yōu)化其培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)在溫度32℃、初始pH5.5、接種量12.0%、裝液量100ml的條件下，各分離酵母菌的生物產(chǎn)量最高，與鄧露芳等[1]的研究結(jié)果基本一致。在10株分離酵母菌株中，生物產(chǎn)量最高的4株分別是x9號(hào)、x1號(hào)、x10號(hào)和x5號(hào)。其中，x9號(hào)和x1號(hào)菌株適的應(yīng)期較短，在2h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8h后達(dá)穩(wěn)定期；x10號(hào)和x5號(hào)菌株的適應(yīng)期較長(zhǎng)，4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12h后進(jìn)入穩(wěn)定期。綜合酵母菌株的培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果，確定假絲酵母屬菌株最適宜作為青貯用高產(chǎn)蛋白酵母菌。

4 結(jié)論

綜合酵母菌株的培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果，確定x9號(hào)菌株最適宜作為秸稈發(fā)酵飼料高產(chǎn)蛋白酵母菌。

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廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科轉(zhuǎn)14125006-16)；廣西創(chuàng)新計(jì)劃專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2015CXJHB019)；廣西水產(chǎn)畜牧科技推廣應(yīng)用項(xiàng)目（桂漁牧科201528001，桂漁牧科201633033)；柳江縣科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201606)。

陸敏（1977-），男，壯族，廣西柳江縣人，大專，助理畜牧師，主要從事畜牧獸醫(yī)新技術(shù)的研究與推廣。

*通訊作者，俸祥仁（1978-)，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)研究工作。