Toll樣受體4基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)肺結核患者發(fā)生糖尿病性下肢血管病變的關系研究

李雨澤 侯紹英 陳向麗 張潔 褚光炎 劉玉琴 姜輝 李殿忠

·論著

Toll樣受體4基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)肺結核
患者發(fā)生糖尿病性下肢血管病變的關系研究

李雨澤 侯紹英 陳向麗 張潔 褚光炎 劉玉琴 姜輝 李殿忠

目的探索Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)基因多態(tài)性與2型糖尿病并發(fā)肺結核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DM-PTB)患者發(fā)生糖尿病性下肢血管病變(lower extremity arterial disease，LEAD)的關系。方法選取2013年9月至2015年6月期間，在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DM-PTB發(fā)生LEAD的患者87例(觀察組)及T2DM-PTB未發(fā)生LEAD患者68例(對照組)，所有患者于納入研究時采集基本信息及血液樣本?；蚪MDNA提取試劑盒提取血液DNA，采用實時熒光定量PCR技術(Taqman探針法)對TLR4基因的3個基因位點(rs7873784、rs1927911及rs1927914)進行基因多態(tài)性檢測。結果觀察組和對照組的TLR4基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點等位基因分布：rs7873784位點G等位基因兩組分別為91.38%(159/174)、91.18%(124/136)，C等位基因兩組分別為8.62%(15/174)、8.82%(12/136)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.00，P=0.950)；rs1927911位點T等位基因兩組分別為59.20%(103/174)、61.76%(84/136)，C等位基因兩組分別為40.80%(71/174)、38.24%(52/136)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.21，P=0.646)；rs1927914位點T等位基因兩組分別為59.77%(104/174)、64.71%(88/136)，C等位基因兩組分別為40.23%(70/174)、35.29%(48/136)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.79，P=0.374)。觀察組和對照組的TLR4基因SNP位點基因型分布：rs7873784位點GG基因型兩組分別為82.76%(72/87)、82.35 %(56/68)，GC基因型兩組分別為17.24%(15/87)、17.65%(12/68)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.00，P=0.947)；rs1927911位點TT基因型兩組分別為32.18%(28/87)、35.30%(24/68)，CT基因型兩組分別為54.02%(47/87)、52.94%(36/68)，CC基因型兩組分別為13.80%(12/87)、11.76%(8/68)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.24，P=0.887)；rs1927914位點TT基因型兩組分別為33.33%(29/87)、42.65%(29/68)，CT基因型兩組分別為52.87%(46/87)、44.12%(30/68)，CC基因型兩組分別為13.80%(12/87)、13.23%(9/68)，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.49，P=0.475)。TLR4基因rs7873784位點：與野生純合基因型GG相比，GC基因型的調(diào)整OR值為0.90(95%CI：0.39～2.06，P=0.80)。rs1927911位點：與野生純合基因型TT相比，CT基因型及CC基因型的調(diào)整OR值分別為1.00(95%CI：0.51～1.97，P=1.00)和1.29(95%CI：0.46～3.66，P=0.63)；rs1927914位點：與野生純合基因型TT相比，CT基因型及CC基因型的調(diào)整OR值分別為1.27(95%CI：0.64～2.51，P=0.49)和1.24(95%CI：0.47～3.27，P=0.67)。3個基因位點各基因型間的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。結論TLR4基因rs7873784、rs1927911和rs1927914位點多態(tài)性與T2DMTB患者發(fā)生LEAD無關。

結核，肺； 糖尿病，2型； 共病現(xiàn)象； Toll樣受體4； 糖尿病血管病變； 因果律

2型糖尿病并發(fā)肺結核(type 2 diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis，T2DM-PTB)患者多表現(xiàn)為肺部病變重、病情進展快、原發(fā)耐藥多和預后差。一旦T2DM-PTB患者發(fā)生糖尿病性下肢血管病變(lower extremity arterial disease，LEAD)會導致治療更加困難。2型糖尿病并發(fā)肺結核患者在體檢時發(fā)現(xiàn)并不是全部患者都會發(fā)生LEAD，其原因尚不明確。

自身免疫介導的炎癥反應在2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)及大血管病變的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，T2DM及大血管病變是自身免疫介導的炎癥性疾病。大血管病變主要是指動脈粥樣硬化，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)作為炎癥標志物與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有著密切聯(lián)系。TLR4是機體天然免疫屏障中作用機制最明確的Toll樣家族相關受體，可在包括巨噬細胞、樹突狀細胞及胰島細胞等在內(nèi)的免疫和非免疫細胞中表達，并在天然免疫防御中發(fā)揮關鍵作用[1-2]。TLR4水平的改變與健康人群T2DM或肺結核患病均相關[3-6]。因此，筆者進行了T2DM-PTB血清中炎癥細胞因子TLR4的基因多態(tài)性與并發(fā)癥的關聯(lián)的研究。

材料和方法

一、研究設計

采用病例對照研究方法，將T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD組設為觀察組，將T2DM-PTB患者未發(fā)生LEAD組設為對照組，分析TLR4基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與T2DM-PTB并發(fā)LEAD之間的關系。

二、研究對象來源、納入和排除標準

選取2013年9月1日至2015年6月1日期間，在黑龍江省傳染病防治院就診的T2DM-PTB發(fā)生LEAD患者87例(觀察組)及T2DM-PTB未發(fā)生LEAD患者68例(對照組)，所有患者進行基因多態(tài)性分析。

觀察組的納入標準：入院的中國漢族患者在符合2型糖尿病的診斷基礎上同時符合肺結核和LEAD的診斷標準。2型糖尿病以WHO 1999年的診斷標準進行診斷，即有明顯的糖尿病典型癥狀(包括多飲、多食、多尿及體質(zhì)量下降)，并滿足以下任意一項條件：任意時間血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或空腹血糖≥7.0 mmol/L囑患者口服75 g糖后2 h血糖≥11.1 mmol/L(葡萄糖耐量實驗OGTT)。根據(jù)《肺結核診斷標準(WS 288-2008)》[7]進行診斷，有咳嗽、咳痰、發(fā)熱等臨床癥狀，結合患者痰涂片及經(jīng)胸部X線攝影檢查陽性發(fā)現(xiàn)即可確診為肺結核，具體標準參照肺結核診斷標準。雙下肢動脈超聲診斷LEAD的標準：根據(jù)患者的雙下肢動脈超聲檢查結果對患者進行診斷， 若患者雙下肢動脈管腔狹窄程度在 30% 以上，存在彌漫性、多發(fā)或單發(fā)斑塊或內(nèi)膜增厚程度在1 mm 以上任一種情況，均可將其視為LEAD[8]。

排除標準：為防止研究對象存在可能與2型糖尿病及肺結核產(chǎn)生關聯(lián)的其他患病因素對研究結果產(chǎn)生影響，需要排除有HIV感染及乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病的患者。同時排除并發(fā)腫瘤、結締組織病、除2型糖尿病以外的其他內(nèi)分泌疾病的患者。

三、研究內(nèi)容

患者納入研究時采集外周血2 ml [乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝]，立即離心(1780×g離心15 min)，將血清與血細胞分離，分別保存于-80 ℃冰箱。同時收集患者基本信息(信息來源于患者主訴及病歷記載)，主要包括姓名、病歷號、性別、年齡、身高、體質(zhì)量等。黑龍江省第四醫(yī)院倫理委員會批準本研究?；颊弑救送獠⒑炇鹆酥橥鈺?。

四、實驗方法

主要試劑和設備有定性PCR擴增儀(7500 Fast型)，美國Life公司；血液或細胞或組織基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液(細胞或組織)基因組DNA提取試劑盒提取血液DNA，按照說明書步驟進行操作。采用實時熒光定量PCR技術(Taqman探針法)原理進行基因多態(tài)性檢測。

五、統(tǒng)計學分析

基因多態(tài)性實驗統(tǒng)計學方法：觀察組與對照組臨床資料及基因型頻率分布差異等采用χ2檢驗。采用logistic回歸分析基因TLR4與T2DM-PTB的關系。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側，以α=0.05為檢驗水準。應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

結 果

1.TLR4基因SNP位點等位基因在觀察組和對照組的分布：TLR4基因的3個基因位點rs7873784、 rs 1927911和 rs 1927914的等位基因在觀察組和對照組的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.TLR4基因SNP位點各基因型的分布及Hardy-Weinberg平衡分析：TLR4基因的3個基因位點rs7873784、rs1927911和rs1927914的基因型在觀察組和對照組的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。Hardy-Weinberg平衡分析結果表明，對照組中TLR4各基因多態(tài)性位點各基因型頻率分布均滿足Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，可以認為數(shù)據(jù)來自同一群體(表2)。

表1 TLR4基因SNP位點等位基因在觀察組和對照組的分布

注T：胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鳥嘌呤

表2 TLR4基因SNP位點在兩組患者中的分布及基因型和Hardy-Weinberg平衡分析

注a：觀察組和對照組進行3個基因位點基因型的χ2檢驗；b:觀察組和對照組進行3個基因位點的Hardy-Weinberg平衡分析

表3 TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD的關系a

注a：TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD的關系采用非條件logistic回歸進行法分析；b：為OR和95%CI在調(diào)整了年齡、BMI后得到的值；c：rs7873784位點CC基因型數(shù)目較少無法進行計算，所以未列出該組數(shù)據(jù)

3.TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB并發(fā)LEAD的關系：經(jīng)過統(tǒng)計學分析，TLR4各基因位點多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD關系，觀察優(yōu)勢比(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)，TLR4各基因位點多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD無相關性(P>0.05)(表3)。

討 論

LEAD是一種常見的糖尿病慢性大血管病變類型，是造成糖尿病患者出現(xiàn)肢端壞疽的常見原因，致殘率和致死率較高[9]。由于機體持續(xù)處于高血糖與蛋白質(zhì)的非糖化狀態(tài)，脂代謝紊亂等，使糖尿病患者的下肢動脈容易發(fā)生血管病變，管壁增厚，管腔狹窄；糖尿病患者下肢血管病變早期不易被確診，一旦出現(xiàn)下肢缺血癥狀，往往血管病變已較明顯，最終可導致患肢壞死，甚至截肢[10-12]。

在T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD初期，患者往往無法分辨是由于LEAD還是抗結核藥物引起的下肢疼痛。經(jīng)過彩色多普勒超聲協(xié)助確定診斷后是否使用改善血液循環(huán)治療方案也成為棘手的問題，一方面LEAD需要進行血液循環(huán)改善治療；另一方面在控制肺部結核病灶初期給予改善血液循環(huán)治療方案又擔心會加劇病灶的擴散。所以，在早期排查T2DM-PTB患者易發(fā)生LEAD后，應給予積極的抗結核藥物治療，在結核病情得到控制后盡早使用改善血液循環(huán)的治療方案。

在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，生活在相似飲食環(huán)境中的T2DM-PTB患者并未全部發(fā)生LEAD。但是飲食因素為重要的環(huán)境因素，使得我們不得不從基因水平方面考慮發(fā)病機制。

rs 7873784位點：與野生純合基因型GG相比，突變雜合子GC基因型的粗OR值為0.96(95%CI：0.43～2.14，P=0.91)，突變純合子CC基因型數(shù)量太少，無法進行計算。通過調(diào)整OR值，得出該SNP位點各基因型與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD的發(fā)病風險無關系。

rs1927911位點：與野生純合基因型TT相比，突變雜合子CT及突變純合子CC的粗OR值分別為1.15(95%CI：0.60～2.22，P=0.68)和1.32(95%CI：0.47～3.65，P=0.60)，通過調(diào)整OR值，未發(fā)現(xiàn)該SNP位點各基因型與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD的發(fā)病風險有關系。

rs 1927914位點：與野生純合基因型TT相比，突變雜合子CT及突變純合子CC的粗OR值分別為1.57 (95%CI：0.82～3.02，P=0.17)和1.35(95%CI：0.52～3.51，P=0.53)。通過調(diào)整OR值，未發(fā)現(xiàn)該SNP位點各基因型與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD的發(fā)病風險有關系。

本研究結果表明各基因位點與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD無關。其原因之一可能是樣本量不夠大。其次，基因多態(tài)性與人種有關，筆者檢測的是中國漢族人群，本研究中發(fā)現(xiàn)TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD無關聯(lián)，并不代表在其他人種與其他地區(qū)TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD無關。其次，本研究目的是為了尋找TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD有無相關性，不是為了尋找TLR4基因多態(tài)性與健康人群患LEAD之間的關系；因此，本實驗納入未發(fā)生LEAD的T2DM-PTB患者作為對照組人群，并沒有把健康人群作為對照組，更沒有進一步比較TLR4基因多態(tài)性在T2DM-PTB患者、T2DM患者和健康人群之間的關系。由于T2DM-PTB也是T2DM并發(fā)癥的一種，T2DM患者可能已經(jīng)存在TLR4基因多態(tài)性，所以結果發(fā)現(xiàn)TLR4基因多態(tài)性與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD無相關性。這也符合一些對糖尿病的有關研究報道。有研究指出rs1927914基因多態(tài)性與糖尿病易并發(fā)糖尿病足潰瘍有關系[13]，Singh等[14]的研究小組還發(fā)現(xiàn)，TLR4基因SNPs位點rs10759931單核苷酸多態(tài)性(OR=1.50,P=0.05) 和TLR4基因SNPs位點rs1927914單核苷酸多態(tài)性 (OR=1.48,P=0.05) 均與糖尿病患者發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變有關。

經(jīng)過本研究對TLR4部分基因位點研究后，并未發(fā)現(xiàn)rs7873784位點、rs1927911位點和rs1927914位點與T2DM-PTB患者發(fā)生LEAD之間存在相關性。由于現(xiàn)階段并沒有關于T2DM-PTB患者并發(fā)其他疾病相關基因水平的研究，所以這是本研究的創(chuàng)新點。由于本次納入的患者樣本量比較少，可能會出現(xiàn)假陰性結果；筆者也并未對TLR4基因全部位點進行檢測。所以，筆者在后期的相關研究中，將逐漸開展其余的TLR4基因位點來完善相關研究。從而為T2DM-PTB并發(fā)LEAD的遠期預防，尤其是針對攜帶不同SNP患者的個體化預防提供依據(jù)。

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2017-09-18)

(本文編輯：范永德)

AssociationofToII-likereceptor4genepolymorphismwithdiabeticlowerextremityvasculardiseaseinpatientswithtype2diabetesmellituscomplicatedwithpulmonarytuberculosis

LIYu-ze*,HOUShao-ying,CHENXiang-li,ZHANGJie,CHUGuang-yan,LIUYu-qin,LIDian-zhong.

*InfectiousHospitalofHeilongjiangProvinceHarbin150500,China

s:LIUYu-qin,Email：liuyuqin_ssy@163.com;LIDian-zhong,Email：lidianzhong2010@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship betweenTLR4gene polymorphism and LEAD in patients with T2DM-PTB.MethodsWe recruited 87 cases with T2DM-PTB patients complicated with LEAD and 68 cases with T2DM-PTB from Infectious Hospital of Heilongjiang Province between September 2013 and June 2015. The basic information of both T2DM-PTB patients complicated with LEAD and T2DM-PTB patients were collected. Meanwhile, peripheral blood was collected in order to undergo gene polymorphism analysis. DNA was extracted by genomic DNA extraction kits and genotyping was accomplished by using Real-time PCR (Taqman probe method). ThreeTLR4gene loci (rs 7873784, rs1927911, rs1927914) were tested.ResultsAllele distribution ofTLR4gene SNPs locus in the observation group and the control group: The G allele of rs7873784 were 91.38% (159/174) and 91.18% (124/136) in the two groups, and the C allele were 8.62% (15/174) and 8.82% (12/136) in the two groups, respectively. There was no significant difference between the two groups (χ2=0.00，P=0.950); The T allele of rs1927911 in two groups were 59.20% (103/174) and 61.76% (84/136), respectively, and the C allele were 40.80% (71/174) and 38.24% (52/136), respectively. There was no significant difference between the two groups (χ2=0.21，P=0.646); The T allele of rs1927914 in two groups were 59.77% (104/174) and 64.71% (88/136), respectively, and the C allele were 40.23% (70/174) and 35.29% (48/136), respectively. There was no significant difference between the two groups (χ2=0.79，P=0.374). Genotype distribution ofTLR4gene SNP locus in the observation group and the control group: The GG genotypes of rs7873784 were 82.76% (72/87) and 82.35% (56/68) in two group, and the GC genotype of the two groups were 17.24% (15/87) and 17.65% (12/68), respectively. The difference between the two groups was not statistically significant (χ2=0.00，P=0.947). The TT genotypes of rs1927911 were 32.18% (28/87) and 35.30% (24/68) in two groups, the CT genotype of the two groups were 54.02% (47/87) and 52.94% (36/68), and the CC genotype of the two groups were 13.80% (12/87), 11.76% (8/68), respectively. The difference between the two groups was not statistically significant (χ2=0.24，P=0.887). The TT genotypes of rs1927914 were 33.33% (29/87) and 42.65% (29/68) in two groups, the CT genotypes of two groups were 52.87% (46/87) and 44.12% (30/68), and the CC genotypes of two groups were 13.80% (12/87), 13.23% (9/68), respectively. The difference between the two groups was not statistically significant (χ2=1.49，P=0.475). Rs7873784 gene locus ofTLR4: compared with wild homozygous genotype GG, the adjustedORvalue of GC genotype was 0.90 (95%CI:0.39-2.06,P=0.80). Rs1927911 gene locus ofTLR4: compared with wild homozygous genotype TT, the adjustedORvalues of CT genotype and CC genotype were 1.00 (95%CI:0.51-1.97,P=1.00) and 1.29 (95%CI:0.46-3.66,P=0.63), respectively. Rs1927914 gene locus ofTLR4: compared with wild homozygous genotype TT, the adjustedORvalues of CT genotype and CC genotype were 1.27 (95%CI:0.64-2.51,P=0.49) and 1.24 (95%CI:0.47-3.27,P=0.67), respectively. There was no significant difference between the 3 genotypes at different loci (P>0.05).ConclusionThe polymorphisms of rs7873784, rs1927911 and rs1927914 inTLR4gene are not associated with LEAD in T2DM-PTB patients.

Tuberculosis, pulmonary； Diabetes mellitus, type 2； Comorbidity； Toll-like receptor 4； Diabetic angiopathies； Causality

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.12.008

黑龍江省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目(2017-524)

150500 哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院 (李雨澤、張潔、褚光炎、劉玉琴、李殿忠)；哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院(侯紹英)；哈爾濱醫(yī)科大學地方病控制中心(陳向麗)

劉玉琴，Email：liuyuqin_ssy@163.com；李殿忠,Email:lidianzhong2010@163.com