無核葡萄雜交育種胚挽救技術程序

宋銀花，章 鵬，賀亮亮，劉三軍

(中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009)

無核葡萄雜交育種胚挽救技術程序

宋銀花，章 鵬，賀亮亮，劉三軍

(中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009)

無核葡萄是鮮食葡萄育種的一個重要方向。隨著人們生活水平的不斷提高,無核葡萄在鮮食和制干上顯示出愈來愈重要的作用。在國際和國內市場中,銷售量最大、最受人們歡迎的鮮食和制干品種主要是無核葡萄品種。我國無核葡萄干銷量遠大于有核葡萄干銷量。

但目前無核葡萄品種少，現(xiàn)有的品種大多粒小、結實率低、無香味或香味不濃，有的成熟晚，抗病差，著色不良。因此需要培育出優(yōu)質無核葡萄品種。

中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所葡萄育種課題組從20世紀60年代開始葡萄育種工作，已經培育出系列的無核品種和優(yōu)系中葡萄4號、中葡萄18號等。

通過幾年的實踐工作，筆者初步總結出了無核葡萄品種雜交育種技術要點，以期為廣大的葡萄雜交育種者提供參考。

1 葡萄父母本的選擇

根據(jù)鮮食無核品種育種目標抗病、大粒、成熟期不同、顏色豐富、優(yōu)質、耐貯、香味濃郁，來選擇具有這些特征的父母本。

常規(guī)獲得無核品種采用有核母本與無核父本雜交，獲得后代，篩選無核優(yōu)良單株。通過這種手段獲得的無核優(yōu)良單株比率很低(0～15.9%)。歷來認為作為母本的有核品種應選用具有單性結實特點即有無核傾向的品種，這種品種最好是在家系中有無核品種介入者，而且這些品種的綜合經濟特性如果粒質量、糖酸含量、生長結果習性等都表現(xiàn)優(yōu)良。

經驗告訴我們用有核品種與無核品種雜交獲得的優(yōu)良雜種做有核親本(母本)獲得無核后代的可能性增大。父本應選擇綜合性狀好的無核品種，以起源于無核黑和無核白的無核品種或品系做父本時后代分離出了較高比率的無核個體。

用無核母本與無核父本雜交，通過應用胚珠培養(yǎng)技術挽救無核葡萄的胚獲得雜種。需要在母本胚停止發(fā)育前進行胚挽救，獲得雜種實生苗。不宜選用那些胚過早發(fā)生敗育的品種作母本，如無核白。

用于做父母本的樹體一定要生長強壯。

2 花粉采集

采集父本開花前一天的花朵，把生長健壯、飽滿的花穗采回室內，剝離花冠，取出花藥，去除花絲，在自然條件下陰干，收集到干凈的玻璃小瓶里，密閉置于陰涼干燥處，授粉時備用。

3 雜交授粉及套袋

開花前1～2天的早晨對母本去雄，去雄后，及時套袋，以防其他品種的花粉落入；花柱開始分泌黏液時，即“吐水”時，開始授粉，連續(xù)三天每天早晨9∶00以前授一次父本的花粉，每次授粉后及時套紙袋，最后一次授粉后再套尼龍袋以便標識。

4 果實采集

雜交果實如果具有完整的種子，去除果皮，洗干凈種子，放入沙子中準備低溫層積；

雜交果實中如果種子發(fā)育不完全，需要每周注意胚發(fā)育情況，在胚停止發(fā)育前，及時取回實驗室，無菌處理，取出種胚，置于培養(yǎng)皿中，準備低溫處理。

5 低溫層積和低溫處理

5.1 雜交種子的低溫層積

將洗干凈的葡萄種子與干凈的河沙混合攪拌均勻，河沙的濕度以手握緊時成團，松開時散開為好，放于4℃的冷藏條件下層積，一直放到來年催芽時結束，中途需要查看沙藏的濕度，確保沙藏過程中適宜的溫濕度，防止?jié)穸却蠓N子發(fā)霉。

5.2 種胚的低溫處理

種胚放入培養(yǎng)皿中，馬上進行低溫處理，在4℃的冷藏條件下，低溫冷藏60天左右，觀察到有少數(shù)種胚開始發(fā)芽，接種到壯苗培養(yǎng)基中。

6 幼苗培育

6.1 雜交種子的培育

6.1.1 雜交種子催芽 第一年低溫沙藏好的種子，第二年3月份天氣回暖把沙子篩去，種子用自來水清洗干凈，用低濃度的高錳酸鉀溶液消毒殺菌，清洗干凈，把喙切去。不同的父母本雜交后代喙的長短不同，以不損害到種子為原則。干凈的毛巾用開水消毒，晾涼，平鋪于干凈的搪瓷盤上，把種子均勻鋪于毛巾上面，種子上面覆蓋一層干凈的毛巾，然后撒上適量的水，水量以毛巾濕潤，但不形成水流為宜。放入25℃生化培養(yǎng)箱進行催芽。

6.1.2 清洗、播種雜交種子 每天清洗一次種子，清洗前把發(fā)芽的種子撿出來播種到溫室里，溫室地溫10℃以上，氣溫15～25℃，每天密切注意溫度變化，及時進行保溫或降溫?；|以干凈疏松的有機質為好，種子出芽快生長旺盛。種子播種到營養(yǎng)缽中。直到生化培養(yǎng)箱中催芽的種子少量發(fā)芽時，把沒有發(fā)芽的種子播種在花盆中。

6.1.3 溫室培養(yǎng)及鍛煉 種子播種到營養(yǎng)缽中，注意保持適宜的溫度和濕度。種子出土后，密切注意溫濕度變化以及病害。種子出土2周后，開始煉苗，通風透光，讓幼苗快速生長。幼苗在溫室里生長一個月后，即可移入大田。

6.2 種胚成苗的培育

6.2.1 組培間接種、生根培養(yǎng) 將種胚接種到壯苗生根培養(yǎng)基中。放入組培間。當幼苗長到5～8厘米左右，具有5片以上葉片、根長達到2厘米以上、有三條以上主根，即可移入溫室進行鍛煉（圖1）。

圖1 組培間苗木培養(yǎng)

6.2.2 溫室鍛煉組培苗移栽 要求溫室溫度在15℃以上，最高25℃。組培瓶苗移入溫室三天后去除綁繩，苗木初步適應外界環(huán)境；煉苗3天后，移栽組培苗。

組培苗的移栽成活率主要受栽培基質、環(huán)境濕度和溫度影響。由于天氣變化原因，尤其在組培苗適應溫室環(huán)境這一階段，需要精心管理。栽培基質要求干凈無污染，質地疏松的有機質，能夠保持適宜的濕度，利于組培苗快速生根（圖2）。組培苗移栽后及時罩上塑料杯，以保持濕度，一周后逐漸去除塑料杯。溫室內溫度保持在15～25℃，移栽后一周內注意中午陽光照射不能強烈。

圖2 組培苗移栽到有機質中保濕煉苗

6.2.3 適宜的溫度、濕度、光照及適應環(huán)境 保持適宜的溫度和濕度，合理澆水，適宜的光照，使胚挽救苗完全適應溫室環(huán)境，然后正常的肥水管理即可（圖3）。繼續(xù)在溫室生長一個月，即可移入大田。

圖3 適應溫室環(huán)境的組培苗

7 移入大田煉苗

大田煉苗通常株行距0.2米×0.5米，剛栽入大田時，需要精心管理，前期注意遮陰，保持適宜的溫濕度。一周后即可進入正常的田間栽培管理，待到幼苗落葉后，挖苗保存，預防凍害、鼠害。

8 大田栽培前的準備與定植

準備定植雜交苗木的大田，挖寬60厘米，深80厘米的定植溝，表土與心土分開兩邊放置，定植溝底部放入秸稈，或腐熟的有機肥（雞糞、豬牛羊糞及廄肥等），回填表土和心土，澆水下沉。

翌年定植于大田，通常株行距0.5米×2米，田間土肥水正常管理。準確記載父母本不同的雜交苗的定植順序，制定準確的定植圖。

9 結果與觀察評價

對葡萄雜交苗的長期觀察篩選是必不可少的。

葡萄雜交苗通常2～3年即可結果，結果后即可根據(jù)無核葡萄育種目標進行觀察、記載、正確評價（圖4）。

對表現(xiàn)優(yōu)良的單株，需要3～5年重復觀察。經過多年觀察對表現(xiàn)穩(wěn)定的優(yōu)良單株即可進行區(qū)域試驗。

對優(yōu)良單株進行采集種條，繁育苗木，進行多點多年區(qū)域試驗，對于表現(xiàn)優(yōu)良的單株即可進行品種審定等工作。

圖4 大田中栽培的雜交苗

河南省科技攻關項目“無核、耐儲運、優(yōu)質抗性葡萄新品種及配套關鍵技術研究”(162102110079);中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程“葡萄資源與育種”(C AAS-ASTI P-2017-ZFR I);中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費專項“葡萄綠色增產增效技術集成與示范”(1614572017207)