實驗條件對宣城水體中藻藍(lán)蛋白提取結(jié)果的影響

羅 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工業(yè)大學(xué) 安徽宣城 242000）

實驗條件對宣城水體中藻藍(lán)蛋白提取結(jié)果的影響

羅 赟 王子琬 席慕凡

（合肥工業(yè)大學(xué) 安徽宣城 242000）

通過改變不同的實驗條件，研究從藍(lán)藻中提取藻藍(lán)蛋白的最佳條件，以實現(xiàn)藍(lán)藻的資源化利用。以宣城水體的新鮮秋季藍(lán)藻水華為研究對象，利用液氮和50℃恒溫水浴，通過反復(fù)凍融法提取藻藍(lán)蛋白。以光譜吸收特征和濃度值為評價指標(biāo)，研究和比較了不同凍融介質(zhì)（磷酸鹽緩沖液和乙醇溶液）和不同稀釋比例（0.4，0.5,0.67，1）對藻藍(lán)蛋白的提取效果的影響。結(jié)果表明：以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液作提取劑的藻藍(lán)蛋白提取效果比100%乙醇好；稀釋比例對藻藍(lán)蛋白的提取效果的影響與提取介質(zhì)有關(guān)。

藍(lán)藻，藻藍(lán)蛋白，反復(fù)凍融法

引言

由于污染物的排放，河流或湖泊中總氮和總磷的含量過高，水體富營養(yǎng)化狀況日益嚴(yán)重，在高溫的季節(jié)，易爆發(fā)藍(lán)藻，導(dǎo)致水生動植物的死亡。目前，常見處理水華藍(lán)藻的方法有：盡量控制外源性（點源、面源）營養(yǎng)物質(zhì)輸入；削減內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)的負(fù)荷；水華爆發(fā)前后應(yīng)急除藻抑藻。機(jī)械和人工打撈是治理藍(lán)藻的重要應(yīng)急措施，但打撈上岸的藍(lán)藻處置不當(dāng)會造成二次污染。雖然在特定的條件下發(fā)揮了一定的作用，但是總的說來大多數(shù)措施往往曠日持久、耗資巨大、收效甚微，因此探究快速、高效、經(jīng)濟(jì)的新型治理方法顯得尤為重要。

國內(nèi)外關(guān)于藍(lán)藻資源化利用主要有如下研究和開發(fā)：(1)厭氧發(fā)酵，采用藍(lán)藻厭氧發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)沼氣和肥料；(2)好氧堆肥，主要包括藍(lán)藻堆肥和藍(lán)藻直接做肥料；(3)提取藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin，C-PC)等生物活性物質(zhì)；(4)藍(lán)藻飼料化，主要包括藍(lán)藻處理后加工成飼料或提取氨基酸作為飼料添加劑等[1]。目前，藍(lán)藻資源化的主要途徑有兩種，一是制沼氣，二是制肥料。這兩種途徑適合處理大規(guī)模暴發(fā)的藍(lán)藻，但其產(chǎn)品(沼氣和肥料)附加值較低，經(jīng)濟(jì)效益僅與處理成本持平，這也是目前難以進(jìn)行市場化推廣的根本原因。本研究以打撈藍(lán)藻資源化利用為目標(biāo)，開展藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白提取的技術(shù)研究。

目前細(xì)胞破碎的主要方法有超聲波破碎法、反復(fù)凍融法、溶脹法、研磨法、化學(xué)試劑處理法及高壓均質(zhì)法等，Bennett[2]等用反復(fù)凍融法來破碎藻細(xì)胞，張靜等對比反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法的提取效果，得到反復(fù)凍融法提取的提取效果優(yōu)于其他3種方法。細(xì)胞破碎方法眾多，且各有優(yōu)缺點，超聲波破碎法易產(chǎn)生高溫引起PC變性，溶脹法提取周期較長，化學(xué)試劑法易產(chǎn)生污染等。由于液氮溫度較低，可達(dá)-196℃，冷凍效果好、時間短，且反復(fù)凍融法過程中，可以做到避免光解、不易污染，人為干擾最小，能保證測定的準(zhǔn)確性。因此本文選用液氮反復(fù)凍融法作為細(xì)胞破碎方法[3]，以光譜吸收特征和藻藍(lán)蛋白濃度為評價指標(biāo)，研究了不同凍融介質(zhì)對藻藍(lán)蛋白的提取效果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

水樣采自于宛陵湖湖區(qū)表層30 cm水體，采集日期為2016年11月23號。采樣期間天氣晴朗，水體pH值為7.3。風(fēng)力為微風(fēng)。水樣采集后放入采樣瓶內(nèi)運回實驗室立刻進(jìn)行分析。

1.2 樣品準(zhǔn)備

將采集來的藍(lán)藻放入若干支50ml離心管內(nèi)配平，放置在冰柜冷藏（2℃）保存?zhèn)溆?。用抽濾機(jī)和布氏漏斗對藍(lán)藻進(jìn)行預(yù)處理。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品配置

分別使用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇為提取劑，配置濃度為25、20、15和10g/l的藍(lán)藻溶液，每組設(shè)兩支試管，共16支試管，用P1至P8，Y1至Y8表示。

1.4 藻藍(lán)蛋白的提取

反復(fù)凍融法：將裝有配置好的藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品的離心管先放入液氮中冷凍20min，然后置于50℃水浴中加熱20min，反復(fù)凍融3次后，經(jīng)離心機(jī)以8000r/min離心20min。

1.5 藻藍(lán)蛋白濃度的測定根據(jù)Bennet公式計算藻藍(lán)蛋白濃度。

式中，藻藍(lán)蛋白濃度Cpc的單位為mg/L；OD615、OD652分別是藻藍(lán)蛋白提取液在615、652 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取的藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果

表1 以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍(lán)藻溶液的吸光值

表2 以100%乙醇為提取 劑的藍(lán)藻溶液的吸光值

表3 以0.1mol/l磷酸鹽緩沖液為提取劑的藻藍(lán)蛋白濃度

表4 以100%乙醇為提取劑的藻藍(lán)蛋白濃度

圖1 不同凍融介質(zhì)條件下藻藍(lán)蛋白濃度

凍融完成后，用分光光度儀分別測出不同凍融介質(zhì)條件下藻藍(lán)蛋白溶液的在615、652 nm處的吸光度（表1和表2），之后通過Bennet公式計算得到藻藍(lán)蛋白濃度（表3和表4）并將兩組數(shù)據(jù)繪與一張圖上（圖1）。由圖可得，除了第三組（P-3和Y-3）外，其余組中，用磷酸鹽緩沖液作提取劑的藻藍(lán)蛋白濃度均大于用乙醇作提取液的藻藍(lán)蛋白濃度，且提取到的藻藍(lán)蛋白濃度差距較大，說明磷酸鹽緩沖液的提取藻藍(lán)蛋白效果明顯好于乙醇。

2.2 稀釋比例的影響

圖2 磷酸鹽緩沖液稀釋比例與藻藍(lán)蛋白濃度關(guān)系

圖3 100%乙醇稀釋比例與藻藍(lán)蛋白濃度關(guān)系

以10g/l的藍(lán)藻溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，分別用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇配制出稀釋比例為0.4，0.5，0.67，1的藍(lán)藻溶液。經(jīng)過反復(fù)凍融法，得到藻藍(lán)蛋白溶液，通過分光光度儀測出藻藍(lán)蛋白濃度，繪出下圖（圖 2,和圖 3）。

通過圖2可以發(fā)現(xiàn)，以磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍(lán)藻溶液，在稀釋比例為1時，所得到的藻藍(lán)蛋白濃度最高，在稀釋比例為0.67時，得到藻藍(lán)蛋白濃度最低。在稀釋比例由0.4增加到0.67時，得到藻藍(lán)蛋白濃度不斷降低，在稀釋比例為1倍時升高，可以推斷，在0.67到1之間存在藻藍(lán)蛋白濃度的最低點。

通過圖3可以發(fā)現(xiàn)，以乙醇為提取劑的藍(lán)藻溶液，在稀釋比例為0.5時，所得到的藻藍(lán)蛋白濃度最高。在稀釋比例為0.4和0.67之間存在藻藍(lán)蛋白濃度的最高點。當(dāng)稀釋比例由0.67增加到1時，得到藻藍(lán)蛋白濃度降低。

3 討論

在水體水華日益加劇的情況下，提取藻藍(lán)蛋白溶液，實現(xiàn)藻藍(lán)蛋白高附加值資源化的研究顯得尤為重要，它本身就符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)的理念。該試驗選取宣城水體水華時新鮮藍(lán)藻作為試驗對象，利用藻藍(lán)蛋白粗提液得率為評價指標(biāo)，研究不同凍融介質(zhì)、不同稀釋比例對藻藍(lán)蛋白提取效果的影響。

每種物質(zhì)都有自身的特征吸收光譜，吸收峰波長可以對已知物質(zhì)定性[4]。已有研究結(jié)果[5]表明，藻藍(lán)蛋白吸收峰位于620 nm附近。反復(fù)凍融法、超聲波法、溶脹法、丙酮法等方法的藻藍(lán)蛋白提取液在620 nm附近具有吸收峰，而其中反復(fù)凍融法620 nm的峰高最強(qiáng)。由此可得反復(fù)凍融法的提取效果優(yōu)于其他方法，因此本次實驗采用凍融法提取藍(lán)藻中的藻藍(lán)蛋白。

已有研究結(jié)果表明[6]，隨凍融次數(shù)的增加，得到藻藍(lán)蛋白的純度，得率均有所下降。本次實驗通過反復(fù)凍融三次，用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液和100%乙醇為提取劑，獲得藍(lán)藻中的藻藍(lán)蛋白。實驗結(jié)果表明，用0.1mol/l的磷酸鹽緩沖液為提取劑所得到的藻藍(lán)蛋白濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于用100%乙醇為提取劑得到的藻藍(lán)蛋白。

可能是由于一定濃度的磷酸鹽緩沖液最接近生物體的環(huán)境溶液，藻藍(lán)蛋白在該環(huán)境中易于保存，而其他凍融介質(zhì)不具備該特性。

本實驗同時研究了磷酸鹽緩沖液和乙醇的最適稀釋比例。實驗結(jié)果表明，以磷酸鹽緩沖液為提取劑的藍(lán)藻溶液，在稀釋比例為0.67到1之間存在藻藍(lán)蛋白得率的最低點。在稀釋比例為1時，為藻藍(lán)蛋白得率的最高點。以乙醇為提取劑的藍(lán)藻溶液，最適稀釋比例位于0.4和0.67之間。

[1]李輝東.太湖藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白提取純化工藝研究,南京理工大學(xué),2012

[2]Bennett A，Bogorad L．Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga．Journal of Cell Biology，1973，58(2):419-435．

[3]龐曉宇.富營養(yǎng)化湖泊水體中藻藍(lán)蛋白提取方法的對比:中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京210008

[4]劉志廣.分析化學(xué).北京:高等教育出版社，2008:227-228．

[5]張允允，陳敏.藍(lán)隱藻藻藍(lán)蛋白的分離、純化及性質(zhì)研究．煙臺大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)與工程版，2011，24(4):281-286．

[6]趙冰冰.不同凍融條件對破壁提取巢湖水華新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的影響．安徽合肥:安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(17):5345-5347，5392