狼瘡腎炎中NGAL/NGALR的表達(dá)及臨床意義

曾星若 方珣 劉昌璇 婁美玉 陳文莉

·論著·

狼瘡腎炎中NGAL/NGALR的表達(dá)及臨床意義

曾星若 方珣 劉昌璇 婁美玉 陳文莉

目的探討中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性載脂蛋白(neutrophi gelatinase-associated lipocalin，NGAL)及其膜受體(neutrophi gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)在狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)中的表達(dá)及其臨床意義。方法選擇84例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者分為LN組和非LN組，另外組織標(biāo)本對照選取同期武漢市中心醫(yī)院泌尿外科腎癌切除術(shù)中癌旁正常組織。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測LN患者及非LN患者血清及尿液中NGAL/NGALR的表達(dá)水平，免疫組化法檢測LN患者與正常對照腎組織中NGAL/NGALR的表達(dá)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)評分采用1985年建立的SLEDAI-2000評分系統(tǒng)。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗、多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析法。結(jié)果LN患者血液及尿液中NGAL/NGALR的表達(dá)顯著高于非LN患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)；尿液中NGAL/NGALR的表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)評分呈正相關(guān)(Plt;0.01)；LN患者腎組織中NGAL/NGALR的表達(dá)較正常腎組織增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)。結(jié)論NGAL/NGALR在LN患者血液、尿液及腎組織中的異常表達(dá)及其與疾病活動程度的相關(guān)，提示NGAL/NGALR可能參與LN的發(fā)生發(fā)展，可輔助LN的臨床診斷，同時為進(jìn)一步研究NGAL/NGALR在LN的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為LN的研究提供新視點(diǎn)。

狼瘡腎炎； NGAL； NGALR

狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的腎臟損害，是SLE最常見和最重要的內(nèi)臟并發(fā)癥[1]，由此導(dǎo)致的腎衰竭已成為SLE患者主要的死亡原因之一[1]。LN的早期診斷與治療對改善預(yù)后、延長患者生存期有重要意義，因此尋找新的無創(chuàng)、早期、與腎損傷關(guān)聯(lián)性好的生物學(xué)指標(biāo)非常重要。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性載脂蛋白(neutrophi gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是缺血性腎損傷及腎毒性損傷時最早被誘導(dǎo)出的基因所表達(dá)的蛋白；中性粒細(xì)胞明膠酶載脂蛋白受體(neutrophi gelatinase-associated lipocalin receptor，NGALR)作為NGAL特異性受體在腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。本文通過研究LN患者血液、尿液及腎組織中NGAL/NGALR的表達(dá)情況及表達(dá)相關(guān)性分析，為LN的早期診斷及風(fēng)險預(yù)測提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選擇2015年5月至2017年4月期間在武漢中心醫(yī)院住院的SLE患者84例，其中男16例，女68例，年齡16～65歲，平均年齡(27.2±7.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者應(yīng)符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會關(guān)于SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。所有患者簽署知情同意書，且本研究通過武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的倫理審查并批準(zhǔn)。

二、方法

1.分組 LN診斷標(biāo)準(zhǔn)：已確診SLE患者合并出現(xiàn)尿常規(guī)提示血尿、蛋白尿，排除了其他自身免疫性疾病、原發(fā)性腎小球疾病、原發(fā)性高血壓、糖尿病、藥物性腎損害及泌尿系感染等伴隨疾病。根據(jù)LN診斷標(biāo)準(zhǔn)將入選患者分為LN組和非LN組。LN組42例，其中男10例，女32例，年齡16～63歲，平均年齡(28.1±6.8)歲；非LN組42例，其中男6例，女36例，年齡18～65歲，年齡(30.6±7.2)歲。2組患者在發(fā)病時間、誘因、病程、基礎(chǔ)治療等方面無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.血清、尿液指標(biāo)檢測 采集2組患者的空腹靜脈外周血3 ml，靜置凝血后離心，取上清得到血清標(biāo)本；同時留取2組患者24 h尿液。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清及尿液中NGAL/NGALR的含量，試劑盒分別為聯(lián)科生物公司(貨號：70-EK0011)及Abnova公司(貨號：HZ-0444R)產(chǎn)品。

3. 腎穿活檢術(shù) 嚴(yán)格掌握腎穿刺適應(yīng)癥及禁忌癥，在征得患者同意情況下，應(yīng)用半自動腎穿刺活檢針，在彩超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)。術(shù)前行凝血三項、血常規(guī)、血型、血生化及尿常規(guī)等常規(guī)檢查。對照的組織標(biāo)本選取同期我院泌尿外科腎癌切除術(shù)中癌旁正常組織。

4. 免疫組化檢測 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，3～5 μm厚連續(xù)切片，使用特異性的抗NGAL及抗NGALR抗體進(jìn)行免疫組化染色。蛋白的表達(dá)水平通過使用Image-Pro+6.0版(媒體控制論)分析計算每個染色腎組織區(qū)域的光密度值進(jìn)而分析每張圖像的MOD值。

5.相關(guān)評價標(biāo)準(zhǔn) 系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性指數(shù)(systemic lupus erythomatosus disease activity index，SLEDAI)采用1985年建立的SLEDAI-2000評分系統(tǒng)[2]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，2組間血液、尿液及腎組織NGAL/NGALR表達(dá)采用t檢驗，尿液NGAL/NGAL值與SLEDAI評分的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血清和尿液中NGAL/NGALR含量

ELISA方法測定發(fā)現(xiàn)LN組患者外周血及尿液中NGAL/NGALR的表達(dá)均顯著高于非LN組(Plt;0.01)。(圖1)

二、NGAL/NGALR與SLEDAI評分的關(guān)系

根據(jù)SLEDAI評分標(biāo)準(zhǔn)將LN組患者進(jìn)行評分分級，采用Spearman相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示LN患者尿液中NGAL/NGALR表達(dá)與SLEDAI評分呈正相關(guān)(Plt;0.01)。(圖2)

三、LN腎組織中NGAL/NGALR的表達(dá)

在LN腎組織中NGAL陽性表達(dá)呈棕褐色，呈彌漫分布，在正常腎組織中弱表達(dá)。在LN腎組織中NGALR陽性表達(dá)呈棕褐色，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈彌漫分布，在正常腎組織中弱表達(dá)(圖3～4)。

圖1 患者血清及尿液中NGAL/NGALR含量

圖2 LN患者尿液中NGAL/NGALR表達(dá)與SLEDAI評分的相關(guān)性

討 論

SLE既是我國最常見的自身免疫性疾病，也是最常見的繼發(fā)性腎臟病[1]。該疾病多見于育齡婦女，其特點(diǎn)表現(xiàn)為體內(nèi)產(chǎn)生大量自身抗體和多器官臟器受累。LN是SLE常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，60%～80%的SLE患者出現(xiàn)腎臟受累臨床表現(xiàn)，表現(xiàn)為蛋白尿、血尿及腎衰竭[2]。根據(jù)腎臟病理檢查，結(jié)合免疫病理和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)幾乎所有的患者均可出現(xiàn)腎臟受累[2-3]。腎衰竭是SLE死亡的主要原因之一。因此，LN是影響SLE預(yù)后的重要因素，LN的診治亦成為風(fēng)濕科和腎病科醫(yī)生研究的重點(diǎn)。

多年來對LN研究工作不斷的深入進(jìn)行，腎活檢術(shù)檢查對LN診斷及病情活動的判定有著重要意義，被認(rèn)為是指導(dǎo)臨床診治的標(biāo)準(zhǔn)[4]。然而隨著SLE者腎活檢開展，亦發(fā)現(xiàn)腎活檢實施的可行性及對疾病診斷的有效性存在一定的局限。首先，因腎活檢術(shù)為有創(chuàng)性操作，臨床實施有所受限，且可重復(fù)性差，二次穿刺率低，對疾病的診斷及疾病追蹤觀察有局限性。另一方面，由于LN的病理改變復(fù)雜多變，臨床上很難找尋準(zhǔn)確可靠的病理分類系統(tǒng)。因此，根據(jù)LN首次腎活檢的病理類型判斷LN病情在臨床應(yīng)用中存在不足。雖然腎活檢在LN診治中有著重要意義，但又因其局限性使得腎活檢在LN診斷、療效觀察及預(yù)后分析中的應(yīng)用受到影響。

為了能早期、準(zhǔn)確、快捷診斷LN，研究者們試圖從檢測血、尿液中各項標(biāo)志物以找到一種診斷途徑，尿液是一種易獲得、易保存的無創(chuàng)性檢測物，因此，檢測尿液中標(biāo)記物以反映LN的活動性、腎臟病變程度成為研究熱點(diǎn)。目前，研究發(fā)現(xiàn)尿液標(biāo)記物如轉(zhuǎn)化生長因子-β1、白細(xì)胞介素17，巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α、單核細(xì)胞趨化蛋白1等對LN的診斷、分級有重要意義[5-8]。

NGAL又稱Lcn-2，屬于lipocalin超家族的小分子分泌蛋白[9]。人類NGAL基因定位于第9號染色體長臂(9q34)，全長5 869 bp，包括1 695 bp的5'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)、178 bp的3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)及由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成的3 696 bp的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)，其相對分子質(zhì)量為25 000[9]。

隨著對NGAL深入研究發(fā)現(xiàn)，其具有以下幾種生物學(xué)作用：①參與炎癥趨化和免疫應(yīng)答。NGAL可以結(jié)合細(xì)菌的含鐵細(xì)胞，通過隔斷鐵發(fā)揮抗菌效應(yīng)，故NGAL為一種新的抗微生物劑。NGAL還是細(xì)菌來源的趨化劑N-甲基蛋異亮苯丙肽的受體之一，可誘導(dǎo)白細(xì)胞內(nèi)顆粒如趨化因子、白介素等的釋放，以消滅病原微生物，據(jù)此推測NGAL與趨化現(xiàn)象和免疫應(yīng)答有關(guān)[10]。NGAL蛋白大量存在于一些與防御微生物有關(guān)的細(xì)胞，如小腸的潘氏細(xì)胞中，這種細(xì)胞能分泌多種抗微生物的多肽，表明NGAL與先天性宿主防御功能有關(guān)。②參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。乳腺癌患者體內(nèi)NGAL通過與MMP-9形成MMP-9/NGAL復(fù)合物而保護(hù)MMP-9不被降解，增加細(xì)胞外基質(zhì)再塑酶的活性，促進(jìn)血管發(fā)生和腫瘤生長[10]；同時在86．36% 的乳腺癌患者尿液中檢測到MMP-9/NGAL細(xì)胞的復(fù)合物，而在健康人和同性別人中檢測不到，推測NGAL可能在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。③參與腎小管上皮的形成與修復(fù)。NGAL還可以運(yùn)輸疏水性的小分子，參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。NGAL結(jié)合鐵，形成NGAL-含鐵細(xì)胞-Fe復(fù)合物促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞，參與哺乳動物近端腎單位發(fā)育過程中的間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換過程。同時NGAL-含鐵細(xì)胞-Fe復(fù)合物還可促進(jìn)原始細(xì)胞分化為腎小管上皮細(xì)胞，保護(hù)成人腎小管上皮細(xì)胞或在損傷后促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)[9，11]。

圖3 NGAL在腎組織中的表達(dá)

圖4 NGALR在腎組織中的表達(dá)

NGALR是一種已經(jīng)得到證實的細(xì)胞受體，它首次分離成功是從小鼠FL5.12細(xì)胞上，它可能參與NGAL的內(nèi)化和細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[12]。今年來逐漸發(fā)現(xiàn)NGALR可能是一種原癌基因，參與到癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中[13-14]。NGALR在腎炎中的研究發(fā)現(xiàn)：NGALR主要分布在狼瘡腎炎的血管系膜細(xì)胞上，少量分布于毛細(xì)血管叢，而在正常腎組織和微小病變時幾乎沒有表達(dá)。另外，在鮑曼氏囊的壁層上皮細(xì)胞及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞上也有部分陽性表達(dá)[12,15]。

大量的臨床樣本研究揭示患者發(fā)生急性腎損傷后幾小時內(nèi)血液和尿液中NGAL水平就會大幅升高[16]。目前NGAL以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物學(xué)特點(diǎn)作為新一代的生物學(xué)標(biāo)記物開始應(yīng)用于臨床，以便臨床醫(yī)生及時準(zhǔn)確的觀測腎臟功能損傷的情況[17]。還有報道顯示狼瘡小鼠和LN患者尿NGAL高于正常[6,8]。本研究中通過檢測狼瘡患者血液、尿液及腎組織中NGAL的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LN患者血液、尿液及腎組織中NGAL的表達(dá)高于非LN患者，相關(guān)性分析得到狼瘡患者尿液中NGAL的表達(dá)與SLEDAI成正相關(guān)。這些結(jié)果再次證明，NGAL是LN的有價值的生物標(biāo)記物。在肯定NGAL在SLE腎損傷中的價值同時，NGALR是否也協(xié)同參與了LN的病理改變引起了我們的關(guān)注。

本研究中通過檢測SLE患者血液、尿液及腎組織中NGAL/NGALR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LN患者血液、尿液及腎組織中NGALR的表達(dá)顯著高于非LN患者，相關(guān)性分析表明尿液中NGALR的表達(dá)與SLEDAI呈正相關(guān)，本研究提示NGAL/NGALR有可能成為一種新的反映LN活動性的可靠標(biāo)志物，有望成為準(zhǔn)確、快捷診斷LN生物標(biāo)記物。同時研究結(jié)果表明NGAL/NGALR在LN與非LN的差異表達(dá)，提示NGAL/NGALR可能參與LN的發(fā)病機(jī)制。LN中NGALR是否通過結(jié)合NGAL而啟動了細(xì)胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而參與細(xì)胞的異常增殖或表型轉(zhuǎn)化，目前尚無研究報道。本研究為進(jìn)一步深入研究NGAL/NGALR在LN中表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制以探尋其作為LN基因治療的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

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ExpressionandclinicalsignificanceofNGAL/NGALRinlupusnephritis

ZENGXing-ruo,FANGXun,LIUChang-xuan,LOUMei-yu,CHENWen-li.

DepartmentofRheumatologyandNephrology,theCentralHospitalofWuhan,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China

CHENWen-li,E-mail:whwenli@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of NGAL/NGALR in lupus nephritis (LN).MethodsEighty-four patients with systemic lupus erythematosus (SLE) were selected in this study, and divided into LN group and non-LN group. The normal tissues adjacent to carcinoma of kidney were chosen as controls, resected during the operation in Department of Urology, the Central Hospital of Wuhan. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the NGAL/NGALR expression level in serum and urine of the patients with or without lupus nephritis. Immunohistochemical method was used to detect the expression differences of NGAL/NGALR in lupus nephritis tissue and normal renal tissue. SLEDAI score was recorded by the SLEDAI-2000 scoring system (version 1985). SPSS 19.0 software was applied for data analysis, t test for two-group comparison, variance analysis for multi-group comparison, and spearman rank correlation analysis for correlation analysis.ResultsThe expression levels of NGAL/NGALR in lupus nephritis patients were significantly higher than in those without lupus nephritis in both serum and urine. The expression levels of NGAL/NGALR increased significantly in lupus nephritis tissues.ConclusionsNGAL and NGALR may be closely related to the occurrence/development and the activity of lupus nephritis, which can assist the clinical diagnosis, and may be expected to become the new targets for therapy of lupus nephritis.

Lupus nephritis; NGAL; NGALR

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.11.003

武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學(xué)科研項目(No.WX13C08)

430014 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腎病與風(fēng)濕免疫科

陳文莉，E-mail:whwenli@163.com

2017-09-11

2017-10-27)