迎春花高效再生體系的建立

， ， (.桂林醫(yī)學(xué)院， 廣西 桂林 54004； .桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系， 廣西 桂林 5400)

迎春花高效再生體系的建立

楊冬業(yè)1，張麗珍2，羅美億2
(1.桂林醫(yī)學(xué)院， 廣西 桂林 541004； 2.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與藥學(xué)系， 廣西 桂林 541001)

以迎春花作為材料,MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、IBA、NAA進(jìn)行組合，研究不同處理對迎春花再生的影響。結(jié)果表明：迎春花最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.75～1.00 mg/L+IBA 0.02～0.10 mg/L，誘導(dǎo)率為100%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L，增殖系數(shù)為3.73；最佳不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L，在此培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的不定根粗且長，多根毛，多側(cè)根，容易移栽。

迎春花； 組織培養(yǎng)； 再生

迎春花(JasminumnudiflorumLindl)，屬木犀科素馨屬植物[1]，別名小黃花、金腰帶、黃梅、清明花。因其在百花之中開花最早，花后即迎來百花齊放的春天而得名。《中藥大辭典》記載迎春花的枝、葉含丁香甙、迎春花苷和迎春花苦味質(zhì)，主治發(fā)熱頭痛、小便熱痛等病癥[2]。目前對迎春花的研究主要集中在活性成分提取[3-6]和藥理學(xué)活性研究，其結(jié)果表明，迎春花具有抗菌[7]、消炎[8]、提高免疫力[9]、抗心律失常[10]、鎮(zhèn)靜[11]和抗氧化作用[12]。對迎春花栽培育種研究較少，特別是建立無性再生繁殖體系鮮有報道。本研究應(yīng)用組織培養(yǎng)手段，建立迎春花的無菌再生體系，對迎春花的繁殖育種和工廠化育苗具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

城市綠化栽培的迎春花(JasminumnudiflorumLindl)枝條。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的清洗消毒

取生長健壯的無病迎春花枝條作為外植體，設(shè)計8種清洗方式(詳見表1)。

表1 外植體的清洗方式

外植體清洗方式消毒程序帶腋芽莖段1洗潔精水擦洗，清水擦洗1遍，放到燒杯中用清水沖15min2洗潔精水擦洗，清水擦洗2遍，放到燒杯中用清水沖15min3洗潔精水擦洗，清水擦洗1遍，放到燒杯中用清水沖30min4洗潔精水擦洗，清水擦洗2遍，放到燒杯中用清水沖30min5洗潔精水擦洗，清水擦洗1遍，放到燒杯中用清水沖1h6洗潔精水擦洗，清水擦洗2遍，放到燒杯中用清水沖1h7洗潔精水擦洗，清水擦洗1遍，放到燒杯中用清水沖1．5h8洗潔精水擦洗，清水擦洗2遍，放到燒杯中用清水沖1．5h

對清洗干凈的外植體設(shè)計4種消毒方式(詳見表2)。

表2 外植體的消毒方式

外植體消毒方式消毒程序帶腋芽莖段10．1%升汞溶液浸泡5min，并不斷攪動，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分進(jìn)行接種。20．1%升汞溶液浸泡8min，并不斷攪動，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分進(jìn)行接種。30．1%升汞溶液浸泡11min，并不斷攪動，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分進(jìn)行接種。40．1%升汞溶液浸泡15min，并不斷攪動，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分進(jìn)行接種。

表5 不同激素配比對迎春花不定芽誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基序號激素(mg/L)6?BAIBA接種個數(shù)(個)污染個數(shù)(個)污染率(%)分化不定芽數(shù)(個)分化率(%)不定芽生長情況A10．500．025459．34183．71～2個不定芽，細(xì)小，生長緩慢A20．500．105447．44488．01～2個不定芽，細(xì)小，生長緩慢A30．750．025447．44896．02～3個不定芽，較粗，葉子伸展，生長良好A40．750．105435．65098．02～3個不定芽，較粗，葉子伸展，生長良好A51．000．025447．44896．02～4個不定芽，粗壯，葉子伸展，生長良好A61．000．105435．6511003～6個不定芽，粗壯，葉子伸展，生長良好A72．000．025435．63976．51～2個不定芽，生長緩慢A82．000．105447．43774．01～2個不定芽，生長緩慢，有愈傷組織

1.2.2 叢生芽的誘導(dǎo)

在超凈工作臺中，將已消毒好的帶腋芽莖段外植體用解剖刀把枝條切成1～2 cm長的莖段，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。整個接種過程均在酒精燈外焰上這一無菌環(huán)境中嚴(yán)格按照接種要求進(jìn)行操作。定期進(jìn)行觀察統(tǒng)計。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)

當(dāng)叢生芽長至1～2 cm后，從外植體上切割下來接入繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種后觀察激素的種類、濃度及不同組合變化對叢生芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.4 生根培養(yǎng)

從把繼代增殖培養(yǎng)好的組培苗中選出健壯植株截取2～4 cm，轉(zhuǎn)接到1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，附加不同種類、不同濃度的生長素。20 d后觀察統(tǒng)計誘導(dǎo)生根情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、IBA和NAA等生長調(diào)節(jié)劑配成固體培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，瓊脂用量為0.7%，pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，每天光照14 h，光照強度2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳清洗方式的選擇

本試驗從室外采集外植體后,在超凈工作臺外用洗潔精水進(jìn)行預(yù)消毒,其外植體的污染率見表3。

從表3可以看出，在超凈工作臺外用洗潔精水進(jìn)行預(yù)消毒的最佳方式是6和8，其污染率小至10%，方式6與8對比，方式8用清水沖的時間較長，浪費時間又浪費水資源，所以在初代階段，為了節(jié)省時間、節(jié)省水資源，降低外植體的污染率，在迎春花的初代培養(yǎng)階段超凈工作臺外首選的消毒方式為6：先用洗潔精水侵泡擦洗外植體，再用清水擦洗2遍，放到燒杯中用清水沖1 h。

2.2 外植體最佳消毒方式的選擇

外植體經(jīng)超凈工作臺外清洗后,再轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)用不同組合的消毒劑進(jìn)行消毒,其外植體的污染率見表4。

從表4可以看出，超凈工作臺外消毒后,在超凈工作臺內(nèi)的最佳消毒方式是3和4，其污染率小至10%，方式3與4對比，方式4用升汞溶液浸泡的時間較長，所以在迎春花的初代階段超凈工作臺內(nèi)消毒應(yīng)選擇方式3。

表3 不同清洗方式外植體的污染情況

消毒方式接種個數(shù)(個)污染個數(shù)(個)污染率(%)1502448250214235015304501326550918650510750918850510

表4 不同消毒方式對外植體的影響

消毒方式接種個數(shù)(個)污染個數(shù)(個)污染率(%)15022442501122350510450510

2.3 迎春花不定芽的誘導(dǎo)

以迎春花莖段為外植體建立體外繁殖再生系統(tǒng)，實驗結(jié)果表明，以莖段為外植體消毒容易，污染率低，容易再生，低濃度的6-BA和IBA組合均能誘導(dǎo)出不定芽，而且生長良好(見表5)。

從表5可看出，不同濃度激素配比對存活率影響不大，但對分化率卻有很大的影響。不同濃度的激素配比對迎春花外植體的啟動、分化反應(yīng)不同，叢生芽形成數(shù)量及生長狀況差異較大。從8組實驗數(shù)據(jù)可看出，微量的外源激素可誘導(dǎo)迎春花叢生芽的發(fā)生及生長，當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA為0.50 mg/L時，誘導(dǎo)率達(dá)到83.7%以上；當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA為0.75 mg/L時，誘導(dǎo)率達(dá)到96%以上；當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA為1.00 mg/L時，誘導(dǎo)率高達(dá)100%。但當(dāng)細(xì)胞分裂素6-BA為2.00 mg/L時，誘導(dǎo)率反而下降，說明細(xì)胞分裂素6-BA對迎春花叢生芽的誘導(dǎo)影響很大，低濃度的細(xì)胞分裂素IBA可啟動迎春花叢生芽的發(fā)生，但高濃度的細(xì)胞分裂素6-BA卻抑制了迎春花叢生芽的分化。因此，迎春花最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.75～1.00 mg/L+IBA0.02～0.10 mg/L。

表6 不同激素配比對迎春花繼代增殖的影響

培養(yǎng)基序號激素(mg/L)6?BAIBA接種個數(shù)(個)不定芽數(shù)(個)增殖系數(shù)不定芽生長情況B10．20．0530953．17不定芽較細(xì)，節(jié)間距適中，生長旺盛，葉片伸展B20．20．1030481．6不定芽粗壯，葉片較大伸展，呈嫩綠色，適合用于生根培養(yǎng)B30．50．05301123．73不定芽細(xì)小，葉片較小，呈嫩綠色，適合用于增殖培養(yǎng)B40．50．1030792．63不定芽粗細(xì)適中，節(jié)間距適中，葉片呈嫩綠色，可用于生根培養(yǎng)

注：增殖系數(shù)=不定芽數(shù)/接種個數(shù)。

表7 不同濃度激素對迎春花不定根誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基序號激素(mg/L)IBANAA接種數(shù)(個)生根的無菌苗數(shù)(株)生根率(%)不定芽生長情況C1——2400無不定根，基部發(fā)黃枯死C20．50—241979．2不定根細(xì)而長，側(cè)根多，2～5條，長約1～5cmC3—0．5241875不定根粗而短，無側(cè)根，2～4條，長約1～2cmC40．20．1242187．5不定根粗且長，側(cè)根少，3～6條，長約3～7cmC50．50．1242291．7不定根粗且長，側(cè)根多，多根毛，5～10條，長約3～10cmC60．50．22424100不定根粗且長，側(cè)根多，多根毛，5～10條，長約3～10cmC71．00．52424100不定根粗且長，側(cè)根多，5～10條，長約2～8cm，有少量愈傷組織C81．01．02424100不定根粗而短，側(cè)根少，2～4條，長約2～4cm，愈傷組織較多

2.4 迎春花繼代培養(yǎng)階段

當(dāng)初代培養(yǎng)的迎春花誘導(dǎo)的不定芽長至1～2 cm 時，可轉(zhuǎn)接至繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行擴大繁殖培養(yǎng)。7 d后均見其有明顯生長，培養(yǎng)2周后觀察生長情況(見表6)。

實驗結(jié)果表明，將迎春花初代培養(yǎng)階段誘導(dǎo)培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到不同的繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不同濃度的細(xì)胞分裂素與生長素配比對繼代增殖影響效果不同。從整體來看，細(xì)胞分裂素與生長素比值越大，增殖系數(shù)越高，比值越小，增殖系數(shù)越低。從整體上看，不定芽增加的倍數(shù)都不大，經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)以后，增殖系數(shù)有所提高。從表6的4組實驗數(shù)據(jù)可知，當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L時，不定芽粗壯，葉片較大伸展，呈嫩綠色，適合用于生根培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L時，增殖系數(shù)較高，適合用于增殖培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L時，不定芽粗細(xì)適中，節(jié)間距適中，葉片呈嫩綠色，可用于生根培養(yǎng)，亦可用于增殖培養(yǎng)。

2.5 生長素對迎春花不定根誘導(dǎo)的影響

當(dāng)不定芽長至2～4 cm時，轉(zhuǎn)接到1/2 MS基本培養(yǎng)基上，附加不同種類、不同濃度的生長素。7 d后觀察到少數(shù)植株露白，15 d后不定根長至1～2 cm。

從表7可看出，生長素對不定根的誘導(dǎo)影響較大，缺乏生長素，迎春花不定根不生長，微量的吲哚丁酸(IBA)和奈乙酸(NAA)均能誘導(dǎo)迎春花不定根生長，但其效果明顯不同。IBA誘導(dǎo)的不定根又細(xì)又長，而NAA誘導(dǎo)的不定根比較粗短；IBA和NAA配合使用，在較低濃度下可以使不定根誘導(dǎo)率達(dá)到100%，而且側(cè)根多，根毛多，適合移栽；當(dāng)生長素濃度為1 mg/L時，在植株基部產(chǎn)生大量愈傷組織，不利于移栽。因此最適合迎春花不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

3 小 結(jié)

1) 在超凈工作臺外最佳清潔方式的選擇階段是先用洗潔精水浸泡擦洗外植體1遍，再用清水擦洗2遍，然后放到燒杯中用清水沖1 h。這樣不僅可以適當(dāng)?shù)墓?jié)省時間、節(jié)約水資源，又可以把外植體的污染率降到最低。

注：A為外植體誘導(dǎo)；B為繼代增殖培養(yǎng)；C為壯苗培養(yǎng)；D為生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。迎春花再生體系的建立圖

2) 最佳消毒方式是用0.1%升汞溶液浸泡11 min，并不斷攪動，無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分后進(jìn)行初代培養(yǎng)。

3) 迎春花初代培養(yǎng)階段，以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.75～1.00 mg/L的6-BA和0.02～0.10 mg/L的IBA可以有效的促進(jìn)迎春花不定芽的啟動與分化。

4) 在迎春花繼代培養(yǎng)階段，當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L時，不定芽粗壯，葉片較大伸展，呈嫩綠色，適合用于生根培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L時，增殖系數(shù)較高，適合用于增殖培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L時，不定芽粗細(xì)適中，節(jié)間距適中，葉片呈嫩綠色，可用于生根培養(yǎng)，亦可用于增殖培養(yǎng)。

5) 最適合迎春花不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。在此培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的不定根粗且長，多根毛，側(cè)根多，容易移栽。

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Study on Effective Regeneration System ofJasminumnudiflorumLindl

YANGDongye1,ZHANGLizhen2,LUOMeiyi2

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金“青葙屬植物錳富集性狀差異及其與SRAP標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析”(41471270)；廣西高校科研項目“金銀花快速繁殖與工廠化育苗綜合技術(shù)研究”(2013 LX 078)；桂林師范高等專科學(xué)?？蒲许椖?XJKY 201409)。

楊冬業(yè)(1976—)，男，廣西昭平市人；碩士，講師，主要從事細(xì)胞工程研究。

張麗珍(1979—)，女，廣西貴港人；博士研究生，副教授，主要從事植物細(xì)胞工程研究；E-mail:xiaozhang446@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.10.076

S 567

A

1001-4705(2017)10-0076-04