ND-FISH技術(shù)在兩棲類(lèi)中的應(yīng)用

常曉嬡，夏 云，曾曉茂,*

1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041

2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

遺傳多態(tài)性一直是進(jìn)化生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。而細(xì)胞遺傳水平的多態(tài)性研究一般都使用C帶、Ag帶等帶型技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）。相對(duì)于條帶技術(shù)，F(xiàn)ISH可同時(shí)提供分子和細(xì)胞水平的信息，并提供了更高的精度和分辨率。根據(jù)探針及靶部位長(zhǎng)度不同，F(xiàn)ISH的探針可分為3種類(lèi)型：（1）多拷貝基因探針，如核糖體 RNA基因、組蛋白基因探針等，這些探針屬于功能基因，但在基因組上有較多的拷貝，所以仍然很容易得到雜交信號(hào)，如 18S rDNA，組蛋白基因等。（2）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針，如著絲粒、端粒序列探針，哺乳動(dòng)物的Alu序列探針等，這類(lèi)探針盡管其本身序列較短（如端粒序列探針只是5堿基或 6堿基重復(fù)），然而由于在基因組中有極多拷貝，靶序列很長(zhǎng)，所以雜交信號(hào)非常明亮，定位難度相對(duì)較低。（3）獨(dú)特序列探針，指由大片段克?。‵osmid、BAC等）、染色體特異性文庫(kù)、基因組DNA等制備的探針（Huan, 2009）。

ND-FISH（non-denaturing FISH）是近幾年興起的一種技術(shù)，使用的探針與過(guò)去常規(guī)的幾種探針不同，主要是微衛(wèi)星序列，又稱(chēng)為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSRs）。探針是合成的15～20 bp的單堿基、二堿基、三堿基或四堿基的微衛(wèi)星序列。微衛(wèi)星位點(diǎn)廣泛分布于真核生物的基因組中（Hamada et al, 1982）。因重復(fù)數(shù)目的不同而呈現(xiàn)高度多態(tài)性（Amos et al,1993）。目前幾十到幾百個(gè)堿基的微衛(wèi)星序列由于其在個(gè)體間的多態(tài)性，作為分子標(biāo)記廣泛的應(yīng)用于連鎖圖譜、基因標(biāo)記、系統(tǒng)發(fā)育等多領(lǐng)域的研究。微衛(wèi)星探針有著出乎意料的在非變性染色體上識(shí)別SSRs的能力，它們可以快速結(jié)合到SSR富集的染色體區(qū)域（Cuadrado & Jouve, 2010）。ND-FISH屬于直接雜交法，15～20 bp的DNA探針上帶有熒光基團(tuán)，并且是合成的單鏈DNA，因而在熒光原位雜交中不需要對(duì)染色體和探針進(jìn)行變性，也不需要添加抗體，這使得檢測(cè)變得省時(shí)省力，簡(jiǎn)便高效。ND-FISH由于不需要對(duì)染色體進(jìn)行變性，染色體的形態(tài)得到了很好的保持，這對(duì)于同一分裂相上的重復(fù)雜交有很大優(yōu)勢(shì)。另外ND-FISH合成的探針保證了熒光標(biāo)記的質(zhì)量。

在前人的研究中，SSRs探針在大麥、玉米、蝗蟲(chóng)、果蠅和人類(lèi)中得到了明顯的雜交信號(hào)，而且特異性很強(qiáng)（Cuadrado & Jouve, 2010）。在大麥Hodeum vulgare和H.bulbosum的研究中，SSRs探針為染色體的識(shí)別提供了標(biāo)記，其中（ACT）5的信號(hào)在H.vulgare 的7對(duì)同源染色體之間最具多態(tài)性，可以清晰的辨別所有染色體。（AAG）5和（ACT）5兩個(gè)探針還為H. vulgare ssp. spontaneum中一個(gè)株系5號(hào)染色體與7號(hào)染色體相互易位提供了標(biāo)記。前人在觀察染色體形態(tài)和C帶等經(jīng)典細(xì)胞學(xué)研究后認(rèn)為H.bulbosum是H. vulgare的近緣種，共享一套“H基因組”，而Hordeum 屬其他物種則具備另三套“H基因組”（Carmona et al, 2012; Linde-Laursen et al, 1997）。但是（AG）10、（AAG）5、（ACT）5和（ATC）5的ND-FISH結(jié)果卻顯示H. vulgare 和H. bulbosum 染色體上SSRs的分布有著很大不同。這支持了另一種相反的假說(shuō)，使得H.vulgare 和H.bulbosum的近緣關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議，也暗示著使用SSRs的ND-FISH可以為系統(tǒng)發(fā)育假說(shuō)提供佐證（Carmona et al, 2012）。

在兩棲動(dòng)物中，獨(dú)特序列探針的缺乏是很?chē)?yán)重的問(wèn)題。rDNA等常用的探針提供的多態(tài)性信息很少，只能辨識(shí)個(gè)別染色體，這使得分析兩棲動(dòng)物細(xì)胞水平遺傳多態(tài)性的研究十分困難。在對(duì)雨蛙科Aplastodiscus屬染色體進(jìn)化的研究中，研究者使用了端粒作為分子標(biāo)記，在 A. perviridis和 A.callipygius中，端粒探針雜交了所有染色體的端部，而在A. leucopygius的3號(hào)染色體的著絲粒區(qū)域發(fā)現(xiàn)了內(nèi)端粒序列（ITS）。在A. arildae和A. eugenioi的雜交結(jié)果中，所有染色體的端粒和著絲粒都有信號(hào)（Gruber et al, 2012）。在棘腹蛙的熒光原位雜交的研究中，5S rDNA探針的信號(hào)只出現(xiàn)在1號(hào)染色體上，端粒序列探針出現(xiàn)在了所有染色體端部，在極個(gè)別個(gè)體中檢測(cè)到ITS（Qing et al, 2013）?？傊?，這些常用探針在屬下、種下呈現(xiàn)很低的多態(tài)性。

本研究嘗試了 ND-FISH在兩棲類(lèi)中的應(yīng)用：（1）我們將常用的SSRs在兩棲類(lèi)中進(jìn)行篩選，得到一系列在染色體間有多態(tài)性的標(biāo)記，可用于兩棲類(lèi)染色體識(shí)別和遺傳多態(tài)性等研究。（2）較之其他類(lèi)群，ND-FISH技術(shù)在兩棲類(lèi)中，染色體必須變性之后才可以得到雜交信號(hào)。（3）此外，本研究對(duì)雙色雜交流程進(jìn)行了較大的改進(jìn)，嘗試同時(shí)使用直接標(biāo)記和間接標(biāo)記的探針，避免了兩次雜交所增加的洗脫及相關(guān)程序，直接獲得雙色信號(hào)，使雜交流程簡(jiǎn)化、提高效率。

1 材料和方法

1.1 有絲分裂染色體制備

選取來(lái)自于四川地區(qū)的棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）個(gè)體制備染色體。棘腹蛙具有易位多態(tài)現(xiàn)象，分布區(qū)靠西的部分種群中檢測(cè)到多種核型。Qing et al（2012）在研究中共發(fā)現(xiàn)了5種核型，因1號(hào)和6號(hào)兩對(duì)染色體相互易位而成。Ⅰ型是常規(guī)核型，兩對(duì)染色體均未發(fā)生重排，1號(hào)和6號(hào)染色體分別為一對(duì)大的和一對(duì)小的中著絲粒染色體，可表示為 MM/mm。Ⅱ-V 型（MM/mSt、MT/mm、MT/mSt、MT/StSt）中，或1號(hào)、或6號(hào)，或1和6號(hào)染色體均有涉及到易位后形成的異形染色體。由于易位發(fā)生僅局限于該種分布區(qū)西端部分種群，該物種大多數(shù)個(gè)體仍為沒(méi)有發(fā)生易位的I型核型。而本研究旨在技術(shù)的運(yùn)用，故實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均采用沒(méi)有發(fā)生易位的I型核型個(gè)體。

有絲分裂相采用骨髓細(xì)胞制備（Schmid et al,2010）。制備好的染色體標(biāo)本于室溫干燥2～4天后，經(jīng) 70%、90%、100%的酒精梯度脫水后, 于 100%的酒精中–20 ℃保存。

1.2 SSRs和5S探針的合成

SSRs探針由上海英?。╥nvitrogen）合成，序列及修飾見(jiàn)表1。

5S探針帶有DIG標(biāo)記，由PCR法合成。5S正向引物 5 ′-GCCTACGGCCACACCAC-3′，反向引物5′-AAGCCTACGACACCTGGTATTC-3′（Qing et al,2012）。5S PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 1 min，50 ℃ 3 0 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。得到的 P CR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)GenElute?PCR Clean-Up Kit（SIGMA）純化，–20℃保存。

表1 ND-FISH使用的SSRs探針Table 1 SSRs used as probes in ND-FISH experiments

1.3 SSRs的ND-FISH

染色體標(biāo)本從–20 ℃取出后鏡檢，55 ℃放2 h。0.01 mol/L HCl中配制0.01% pepsin，每張片子500 μL，蓋蓋玻片37 ℃處理15 min。洗去pepsin后于70%甲酰胺，10% 20×SSC中72 ℃變性2 min。將片子迅速放在預(yù)冷的70%、90%、100%梯度酒精中，各處理10 min。完成后扇動(dòng)晾干。

2×SSC中配制雜交液40 μL：30% 去離子甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，0.3% SDS，SSR探針100 ng。雜交液滴在片子上，蓋蓋玻片。于37℃潮濕暗盒中雜交3 h。

將片子浸入室溫的洗脫液（4×SSC, 0.2% Tween 20）中，待蓋玻片自動(dòng)脫落后涮洗10 min。再用洗脫液涮洗5 min。最后用ddH2O涮洗幾遍。甩干片子，加DAPI 30 μL，用配備對(duì)應(yīng)濾鏡組合的 Leica DMRA2 熒光顯微鏡對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)Leica DFC490 CCD與 Qwin V3和 Qgo軟件進(jìn)行圖像拍攝和采集。

1.4 SSRs與5S的雙色熒光原位雜交

染色體標(biāo)本的處理與SSRs的FISH相同。2×SSC中配制雜交液40 μL：40% 去離子甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，0.3% SDS，SSRs探針100 ng，5S探針50 ng。雜交液于83℃變性8 min后立即置于冰上，放置10 min。雜交液滴在片子上，蓋蓋玻片。于37 ℃潮濕暗盒中雜交6 h后,載玻片在2×SSC中浸泡2～3 min，搖落蓋玻片后輕輕涮洗幾下。每張片子上加200 μL抗體溶液（2 μL Dig-FITC, 198 μL 1% BSA），37 ℃孵育1 h后在洗脫液中涮洗3次，每次5 min。甩干片子，最后加DAPI 30 μL，鏡檢。

1.5 SSRs探針的重復(fù)實(shí)驗(yàn)與分析

（AC）10、（AG）10、（AAC）5分別在5個(gè)個(gè)體中重復(fù)實(shí)驗(yàn)，（CAT）5在14個(gè)個(gè)體中重復(fù)，（GACA）5在3個(gè)個(gè)體中進(jìn)行重復(fù)，選擇好的分裂相拍攝并進(jìn)行分析，得到每個(gè)探針在染色體上穩(wěn)定出現(xiàn)的位置。

2 結(jié) 果

2.1 SSR探針篩選結(jié)果

采用單一探針雜交方法，將合成的21對(duì)探針?lè)謩e對(duì)不同染色體標(biāo)本進(jìn)行雜交，檢測(cè)得（AC）10、（AG）10、（AAC）5、（CAT）5、（GACA）5等5個(gè)較為穩(wěn)定的標(biāo)記。

（AC）10的雜交結(jié)果顯示，信號(hào)穩(wěn)定出現(xiàn)于 2號(hào)、6號(hào)、13號(hào)染色體著絲粒附近，以及11號(hào)染色體的短臂上（圖 1A）；（AG）10的信號(hào)主要位于 1號(hào)染色體著絲粒，2號(hào)、6號(hào)染色體的著絲粒與端部，3號(hào)、5號(hào)染色體的端部，以及12號(hào)染色體短臂上（圖1B）；（AAC）5雜交信號(hào)主要位于1號(hào)染色體著絲粒與長(zhǎng)臂上，3號(hào)染色體的端部，5號(hào)染色體短臂端部，以及6號(hào)染色體著絲粒處（圖1C）；（GACA）5的信號(hào)主要位于2號(hào)染色體的著絲粒附近（圖1D）。（CAT）5的信號(hào)位于 1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂和短臂的近著絲粒處、2號(hào)染色體的著絲粒處，在部分個(gè)體中還出現(xiàn)在3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上（圖2）。

圖1 （AC）10、（AG）10、（AAC）5、（GACA）5雜交信號(hào)在棘腹蛙染色體上的分布Figure 1 Chromosomal distribution of signals of（AC）10,（AG）10,（AAC）5 and（GACA）5 in metaphases of Quasipaa boulengeriA：（AC）10 雜交信號(hào)呈紅色，主要分布于于2號(hào)、6號(hào)、13號(hào)染色體著絲粒附近，以及11號(hào)染色體的短臂上；B：（AG）10雜交信號(hào)呈紅色，主要分布于1號(hào)染色體著絲粒，2號(hào)、6號(hào)染色體的著絲粒與端部，3號(hào)、5號(hào)染色體的端部，以及12號(hào)染色體短臂上；C：（AAC）5雜交信號(hào)呈紅色，主要分布于1號(hào)染色體著絲粒與長(zhǎng)臂上，3號(hào)染色體的端部，5號(hào)染色體短臂端部，以及6號(hào)染色體著絲粒處；D：（GACA）5的信號(hào)呈綠色，位于2號(hào)染色體的著絲粒附近。A The (AC) 10 signals appear red and locate near the centromeric region of chromosome no.2, no. 6, no.13, and on the short arm of chromosome no. 11; B: The(AG) 10 signals appear red and locate near the centromeric region of chromosome no.1, no. 2 and no. 6, and on the telomeric position of chromosome no. 2, no.3, no. 5, no. 6, and on the short arm of chromosome no. 12; C: The (AAC) 5 signals appear red and locate near the centromeric region of chromosome no.1, no.6, and on the long arm of chromosome no. 1, and on the telomeric position of chromosome no. 3, and the telomeric position of short arm of chromosome no. 5;D: The (GACA) 5 signals appear green and locate near the centromeric region of chromosome no.2.

圖2（CAT）5探針（紅色）與5S rDNA探針（綠色）的雙色FISHFigure 2 Double-color FISH with (CAT)5 probe (red) and 5S rDNA probe (green)（CAT）5雜交信號(hào)位于1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂和短臂的近著絲粒處，2號(hào)染色體的著絲粒處，在部分個(gè)體中還出現(xiàn)在3號(hào)染色體長(zhǎng)臂上；5S rDNA的信號(hào)位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂近著絲粒處。A：3號(hào)染色體上沒(méi)有（CAT）5信號(hào)的代表個(gè)體。B：（CAT）5信號(hào)出現(xiàn)在一條3號(hào)染色體上，而同源染色體上沒(méi)有的代表個(gè)體。C：兩條3號(hào)染色體上都有（CAT）5信號(hào)的代表個(gè)體。The signals of locate on both short arm and long arm near the centromeric region of chromosome no. 1 and on the centromeric region of chromosome no. 2; The signals of 5S rDNA locate on the long arm of near the centromeric region of chromosome no. 1. A: The representative sample that has no signals on the chromosome no. 3. B: The representative sample that has signals on one chromosome no. 3 while the homologous chromosome has no signals. C: The representative sample that has signals on the chromosome no. 3.

2.2 雙色雜交結(jié)果

同時(shí)使用直接標(biāo)記與間接標(biāo)記的探針，用（CAT）5探針（紅色）與5S rDNA探針（綠色）的雙色FISH，得到理想的雙色雜交效果。（CAT）5的雜交結(jié)果顯示，信號(hào)穩(wěn)定出現(xiàn)于1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂和短臂的近著絲粒處、2號(hào)染色體的著絲粒處。在某些個(gè)體中，（CAT）5的信號(hào)還出現(xiàn)在3號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上。有的個(gè)體一對(duì)3號(hào)染色體上都沒(méi)有信號(hào)（圖2A），有的個(gè)體一條3號(hào)染色體上有信號(hào)而同源染色體上沒(méi)有（圖2B），還有的個(gè)體一對(duì)3號(hào)染色體上都有信號(hào)（圖2C）。5S的信號(hào)穩(wěn)定出現(xiàn)于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂的近著絲粒處。

3 討 論

3.1 篩選兩棲類(lèi)SSRs探針

以往在熒光原位雜交中使用的探針，無(wú)論是重復(fù)序列、多拷貝基因還是單拷貝序列提供的帶型都很單一，一般都定位在一對(duì)同源染色體上，只能對(duì)一對(duì)同源染色體起辨識(shí)作用，例如5S rDNA；或者是無(wú)差別的分布于所有染色體上，例如端粒序列。而SSRs由于在染色體上分布廣泛，可提供多帶型，一個(gè)標(biāo)記或幾個(gè)標(biāo)記組合就可以辨別出很多對(duì)同源染色體，在Carmona et al（2012）的研究中，（ACT）5一個(gè)標(biāo)記就可以辨別所有7對(duì)同源染色體。在魚(yú)類(lèi)性染色體的研究中，SSRs探針也成功的標(biāo)記了 W染色體（de Bello Cioffi et al, 2012）。此外，不同的SSRs序列在不同的物種和類(lèi)群中的富集性和多態(tài)性有所不同，在一個(gè)類(lèi)群中得到清晰的多態(tài)性信號(hào)的標(biāo)記在另一個(gè)類(lèi)群中可能根本觀測(cè)不到信號(hào)。例如在蟾魚(yú)類(lèi)（Batrachoididae family）的研究中，（GATA）n探針在蟾魚(yú)類(lèi)的 4個(gè)物種中都得到了大量強(qiáng)烈的信號(hào)（úbeda-Manzanaro et al, 2010），而在本研究中（GATA）n探針與棘腹蛙染色體雜交卻沒(méi)有信號(hào)。

為了檢測(cè)SSRs探針是否能在兩棲類(lèi)中運(yùn)用，我們選擇了棘腹蛙作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。參照已有研究類(lèi)群的工作（Cuadrado & Jouve, 2010），設(shè)計(jì)了21條SSRs探針進(jìn)行嘗試（表1）。結(jié)果表明，SSRs探針可以在兩棲類(lèi)中有良好的運(yùn)用效果。在棘腹蛙中，（AC）10、（AG）10、（AAC）5、（CAT）5、（GACA）5等5個(gè)標(biāo)記得到了染色體間明顯差異的信號(hào)，這些標(biāo)記在不同個(gè)體中較穩(wěn)定出現(xiàn)，都能起到一定的辨識(shí)染色體的作用（圖1, 2），如果將不同的標(biāo)記偶聯(lián)上不同顏色的熒光，多個(gè)標(biāo)記組合可以在一次實(shí)驗(yàn)中更準(zhǔn)確的辨別更多的染色體。其他標(biāo)記則沒(méi)有信號(hào)或在每條染色體上分布相同，在棘腹蛙中不能起到染色體識(shí)別作用。

其中，（CAT）5在一些個(gè)體3號(hào)染色體長(zhǎng)臂長(zhǎng)上出現(xiàn)信號(hào)，表現(xiàn)出多態(tài)性。有的個(gè)體的兩條3號(hào)染色體上都沒(méi)有出現(xiàn)（CAT）5的雜交信號(hào)，有的個(gè)體一條3號(hào)染色體上有信號(hào)而同源染色體上沒(méi)有，有的個(gè)體兩條同源3號(hào)染色體上都有信號(hào)。根據(jù)長(zhǎng)臂上是否有信號(hào)，可認(rèn)為3號(hào)染色體有兩種，一種或許是由另一種變化而來(lái)。發(fā)生變化新產(chǎn)生的3號(hào)染色體在種群中通過(guò)雜交擴(kuò)散，產(chǎn)生了現(xiàn)在看到的情況，即不同個(gè)體中的3號(hào)染色體對(duì)表現(xiàn)出3種類(lèi)型：一對(duì)3號(hào)染色體都沒(méi)有信號(hào)的純合子，一對(duì)3號(hào)染色體都有信號(hào)的純合子，以及一條3號(hào)染色體有信號(hào)而另一條卻沒(méi)有的雜合子。3號(hào)染色體所具備的多態(tài)性可應(yīng)用于棘腹蛙種群關(guān)系的分析。

3.2 兩棲類(lèi)的ND-FISH染色體變性是必須條件

兩棲動(dòng)物染色體的高度螺旋化在很多帶型研究中都有反映（Schmid, 1978a）。兩棲動(dòng)物每微米的染色體含有的DNA量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他脊椎動(dòng)物（如哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)）（Schmid, 1978b）。因此兩棲類(lèi)的染色體的明帶和暗帶間距很小，常常難以辨別（Schmid, 1978a, b）。例如前人對(duì)兩棲類(lèi)染色體的 R帶研究中就發(fā)現(xiàn)帶型缺乏多樣性（Schempp & Schmid, 1981）。染色體的高度螺旋化或許是 ND-FISH在兩棲動(dòng)物中難以直接應(yīng)用的原因。 經(jīng)驗(yàn)證ND-FISH中，SSRs探針是與染色體上的DNA相雜交，而不是RNA，也就是說(shuō)ND-FISH的原理是依賴于 SSRs探針對(duì)雙鏈 DNA的插入性（Carmona et al, 2012）。在染色體螺旋化程度很高的情況下，SSRs探針很難接觸到靶序列，入侵雙鏈DNA并與之結(jié)合就更困難了。ND-FISH中使用的探針為人工合成的單鏈DNA，不需變性，但在兩棲動(dòng)物的應(yīng)用中，需要添加對(duì)兩棲類(lèi)染色體標(biāo)本變性的步驟，否則雜交難以成功。

ND-FISH由于不需要對(duì)探針和染色體變性，使得實(shí)驗(yàn)操作方便快捷，雖然在兩棲類(lèi)的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)染色體標(biāo)本必須進(jìn)行變性，然而由于SSRs探針的特性，雜交時(shí)間相比于常規(guī)FISH還是有了很大縮短，由9～15 h縮短到3～4 h，工作效率可顯著提高。

3.3 雙色熒光原位雜交的改進(jìn)

本研究嘗試在一次雜交中同時(shí)使用直接標(biāo)記探針與間接標(biāo)記探針，通過(guò)這種方式，可更為快捷地獲得雙色信號(hào)的雜交結(jié)果。

熒光原位雜交技術(shù)使用的探針有兩種。第一種是與熒光物直接偶聯(lián)標(biāo)記探針，即堿基與熒光素直接偶聯(lián)的探針；第二種是和半抗原（如生物素、地高辛等）偶聯(lián)的間接標(biāo)記探針，探針的制備通常使用缺口平移、PCR、隨機(jī)引物法等方法。使用的探針不同使得雜交實(shí)驗(yàn)中的步驟有很大區(qū)別。其中最重要的就是間接標(biāo)記的探針在與染色體雜交之后還要與連有熒光素的抗體反應(yīng)，之后還需要進(jìn)行洗脫，而直接標(biāo)記的探針則不需要。而且由于間接法中的抗原抗體反應(yīng)有級(jí)聯(lián)放大的作用，容易出現(xiàn)大量雜信號(hào)，洗脫條件一般較嚴(yán)格，而直接法的洗脫較溫和。

之前也有學(xué)者同時(shí)使用SSRs和rDNA標(biāo)記染色體，進(jìn)行雙色熒光原位雜交，其中SSRs序列的獲得是使用（GATA）7和（TATC）7作為引物在無(wú)模板的情況下進(jìn)行PCR，然后再用缺口平移法標(biāo)記探針（úbeda-Manzanaro et al, 2010）。這種方法相比于直接合成單鏈探針要繁瑣的多。

當(dāng)我們?cè)噲D使用帶有熒光素標(biāo)記的SSRs探針和DIG標(biāo)記的5S rDNA探針一起標(biāo)記染色體時(shí)，就遇到了直接標(biāo)記和間接標(biāo)記探針雜交后洗脫條件不同的問(wèn)題。按照常規(guī)步驟，要想在同一個(gè)分裂相上看到兩個(gè)標(biāo)記的信號(hào)需要將片子上第一個(gè)標(biāo)記洗脫，再將第二個(gè)標(biāo)記重新雜交。而重新雜交會(huì)影響第二次雜交的效果，而且很費(fèi)時(shí)費(fèi)力。于是我們嘗試一次完成兩種探針的雜交。雙色FISH中，在配制雜交液時(shí)我們將兩種探針一起加入，按照雙鏈DNA探針的要求提高去離子甲酰胺的濃度并進(jìn)行變性，在探針與染色體雜交結(jié)束后不對(duì)多余探針進(jìn)行洗脫，而是直接加抗體?？贵w反應(yīng)結(jié)束后則是按照前人SSRs探針雜交的經(jīng)驗(yàn)（Cuadrado & Jouve,2010），洗脫得較溫和。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)探針的變性、雜交液配比的改變和地高辛的抗體反應(yīng)對(duì)于SSRs的雜交結(jié)果幾乎沒(méi)有影響，而直接標(biāo)記探針?biāo)褂玫臏睾偷南疵撾m然會(huì)增加一些5S rDNA的雜信號(hào)，但主信號(hào)也更明顯了，拍攝調(diào)整曝光就可以得到很好的結(jié)果。

致謝：感謝電子科技大學(xué)楊足君教授、四川大學(xué)王亞軍教授、武漢大學(xué)劉江東教授、湖北中醫(yī)藥大學(xué)趙剛教授提供的文獻(xiàn)和指導(dǎo)，感謝四川大學(xué)彭銳、中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所卿立燕的建議和幫助。