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    氯菊酯微生物手性降解的研究

    2017-11-30 19:25:02李森田晶李朝陽(yáng)李巧玲羅湘南張春曉李劭彤
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年20期
    關(guān)鍵詞:降解手性

    李森+田晶+李朝陽(yáng)+李巧玲+羅湘南+張春曉+李劭彤

    摘要:通過(guò)對(duì)河北省石家莊市的黃土進(jìn)行取樣、篩選、分離,得到1株以氯菊酯為唯一碳源的細(xì)菌,命名為 PM-A,經(jīng)鑒定為萎蔫短小桿菌(Curtobacterium flaccumfaciens)。此菌對(duì)氯菊酯有良好的降解能力,采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模擬,半衰期為1.41 d。進(jìn)一步考察對(duì)各異構(gòu)體的降解情況,順式體和反式體降解差異不明顯,對(duì)順式體的1對(duì)對(duì)映體(1R-cis 和1S-cis)降解不存在對(duì)映體選擇性,對(duì)反式體的1對(duì)對(duì)映體(1R-trans和1S-trans)降解存在明顯的對(duì)映體選擇性。

    關(guān)鍵詞:氯菊酯;萎蔫短小桿菌;手性;降解;對(duì)映體;對(duì)映體選擇性

    中圖分類(lèi)號(hào): X172;X592 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)20-0282-03

    手性農(nóng)藥的不同對(duì)映體往往具有不同的生物活性和生理毒性,其在環(huán)境中的消解和歸趨也有較大的差別,對(duì)環(huán)境樣品中手性農(nóng)藥的分析和檢測(cè)往往顯示不同的對(duì)映體比值[1-2]。土壤是農(nóng)藥殘留的主要場(chǎng)所,土壤微生物代謝也是手性農(nóng)藥降解和產(chǎn)生對(duì)映體差異的主要原因,目前關(guān)于環(huán)境樣品中手性農(nóng)藥的分析檢測(cè)及降解特征有較多的研究[3-6],但在微生物水平考察手性農(nóng)藥對(duì)映體差異的報(bào)道較少[7-8]。

    擬除蟲(chóng)菊酯是一類(lèi)重要的農(nóng)用殺蟲(chóng)劑,在衛(wèi)生殺蟲(chóng)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。菊酯的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,一般含2~3個(gè)手性中心,因此有4~8個(gè)對(duì)映異構(gòu)體,氯菊酯(permethrin)是擬除蟲(chóng)菊酯的重要品種,化學(xué)式為C21H20Cl2O3,化學(xué)名為3-苯氧基芐基-2,2-二甲基-3-(2,2-二氯二烯基)-1-環(huán)丙烷羧酸酯,結(jié)構(gòu)式如圖1所示。氯菊酯含有2個(gè)手性中心,有1個(gè)順式體和1個(gè)反式體,順式體和反式體又各含有2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體,因此共有4個(gè)對(duì)映體,分別為1R-cis、1S-cis、1R-trans、1S-trans,氯菊酯各異構(gòu)體的生物活性和降解行為均有較大差異[7]。本研究通過(guò)對(duì)河北省石家莊市的黃土進(jìn)行篩選和純化,得到1株氯菊酯的優(yōu)勢(shì)降解菌,該菌株以氯菊酯為唯一碳源,且對(duì)氯菊酯具有良好的降解能力。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究氯菊酯各異構(gòu)體的手性測(cè)定方法,考察該菌株對(duì)各異構(gòu)體的降解差異,結(jié)果有助于闡釋菊酯農(nóng)藥在環(huán)境中的對(duì)映體選擇性行為,也能為菊酯農(nóng)藥的生物修復(fù)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    安捷倫1200型高效液相色譜儀(帶G1314B紫外檢測(cè)器),購(gòu)自安捷倫科技有限公司;可見(jiàn)分光光度計(jì)(spectrunm 722型),購(gòu)自上海美析儀器有限公司;ZWY-240型恒溫?fù)u床,購(gòu)自上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;SPX-250B生化培養(yǎng)箱,購(gòu)自上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。石家莊黃土,采自河北科技大學(xué)新校區(qū),pH值7.68,有機(jī)質(zhì)含量2.26%;99%氯菊酯,購(gòu)自上海市農(nóng)藥研究所有限公司;正己烷、乙酸乙酯、異丙醇等均為分析純,均購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠,重蒸后過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜備用;其他化學(xué)試劑和生物試劑均購(gòu)自河北石家莊天時(shí)生物技術(shù)有限公司。富集培養(yǎng)基:10 g蛋白胨、1 g NaCl、1 g KH2PO4、1 000 mL水 (pH值7.0~72);普通培養(yǎng)基:3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水(pH值 7.0~72);基礎(chǔ)培養(yǎng)基:1.00 g NH4NO3、0.50 g MgSO4·7H2O、0.50 g (NH4)2SO4、0.50 g KH2PO4、0.50 g NaCl、1.50 g K2HPO4、0.05 g酵母浸粉、1 000 mL水(pH值7.0~7.2),固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入2 %瓊脂粉。

    1.2 色譜柱和色譜條件

    非手性高效液相色譜(HPLC)的色譜柱為正相硅膠柱(購(gòu)自遼寧大連依利特分析儀器有限公司,250 mm × 4.6 mm),流動(dòng)相為正己烷 ∶ 異丙醇(體積比為100 ∶ 0.08)。手性HPLC色譜柱為Chiralcel OJ-H(購(gòu)自日本大賽璐工業(yè)株式會(huì)社,250 mm × 4.6 mm),流動(dòng)相為正己烷 ∶ 異丙醇(體積比為100 ∶ 2)。非手性和手性HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)均為 230 nm,流速為 1.0 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。

    1.3 氯菊酯降解菌的篩選

    向250 mL三角瓶中加入100 mL富集培養(yǎng)基,在高壓蒸汽鍋中滅菌15 min,自然冷卻后加入10 mL氯菊酯(100 mg/L)和10 g石家莊黃土,在搖床(溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min)中培養(yǎng)7 d。此后按10 %的接種量轉(zhuǎn)接到下一批含氯菊酯(質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500 mg/L)的富集培養(yǎng)基中,相同條件下各培養(yǎng)7 d,然后按10 %的接種量轉(zhuǎn)接到含有500 mg/L氯菊酯的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,并培養(yǎng)14 d,此后以10倍梯度稀釋獲得7個(gè)梯度,并分別進(jìn)行涂布劃線,直至出現(xiàn)單菌落并保存,得到1株優(yōu)勢(shì)菌株,命名為PM-A。

    1.4 菌種鑒定

    在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種少量預(yù)先稀釋的菌液,并均勻涂布,待菌落長(zhǎng)出后,采用革蘭氏染色以及芽孢染色后鏡檢。另外進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)等生理生化鑒定[9]。提取菌株的DNA,進(jìn)行擴(kuò)增后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,將16S rDNA的序列結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸的數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性對(duì)比[10]。

    1.5 菌株降解試驗(yàn)

    以PM-A菌株作為菌種進(jìn)行菌液配制,將配制好的菌液(D600 nm ≈ 0.5)接種到含有100 mL無(wú)菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中(接種量為1%),加入氯菊酯使培養(yǎng)基中氯菊酯的濃度達(dá)到10 mg/L。對(duì)照組除不加菌種外,其余條件均相同。將三角瓶置于搖床(溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min)中,分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8 d取樣,并用液相色譜進(jìn)行總量和手性測(cè)定。endprint

    1.6 樣品提取和前處理

    吸取5 mL培養(yǎng)液,加入等體積的正己烷和乙酸乙酯的混合液(體積比為5 ∶ 1),利用超聲波輔助振蕩10 min后萃取,吸取上清液,以上操作重復(fù)3次后,使用無(wú)水硫酸鈉脫水,用高純氮?dú)獯蹈?,正己烷定容? mL,過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜,用液相色譜進(jìn)行測(cè)試分析。

    1.7 氯菊酯異構(gòu)體和對(duì)映體的測(cè)定方法

    氯菊酯含1個(gè)順式異構(gòu)體(cis-PM)和1個(gè)反式異構(gòu)體(trans-PM),在非手性硅膠柱上即可得到基線分離。cis-PM、trans-PM各含有2個(gè)對(duì)映體,分別為1R-cis和1S-cis、1R-trans和1S-trans,在手性Chiralcel-OJ-H柱上,4個(gè)對(duì)映體可以得到基線分離,筆者所在課題組前期的研究結(jié)果表明,順?lè)大w對(duì)映體的具體流出順序?yàn)?S-cis先于1R-cis出峰,1S-trans 先于1R-trans出峰[11]。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,同時(shí)測(cè)定4個(gè)對(duì)映體出峰時(shí)間較長(zhǎng),且容易受雜質(zhì)干擾,尤其分析濃度較低的痕量樣品時(shí)更為明顯。因此,本研究采用分步測(cè)定方法,先用非手性硅膠柱分離測(cè)定氯菊酯的順式體和反式體,剩余樣品濃縮后用硅膠柱分離,待cis-PM、trans-PM出峰時(shí),在色譜儀流動(dòng)相出口端收集相應(yīng)的流動(dòng)相,吹干定容后,用手性色譜分別進(jìn)行拆分,測(cè)定對(duì)映體的濃度比值ER(enantiomer ratio),根據(jù)順式體、反式體的濃度及相應(yīng)的ER值,即可得出各對(duì)映體的濃度。分步測(cè)定相對(duì)繁瑣,但手性拆分前增加了順式體和反式體凈化步驟,可有效去除雜質(zhì)干擾,提高測(cè)定準(zhǔn)確度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株鑒定結(jié)果

    PM-A是以氯菊酯為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌,該菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌,菌落較小,深黃色,邊緣光滑,表面光滑,黏稠狀,中間隆起;老細(xì)胞易退色,專(zhuān)性好氧。測(cè)序長(zhǎng)度為1 485 bp,與萎蔫短小桿菌(Curtobacterium flaccumfaciens)rDNA序列的一致性達(dá)99%,初步鑒定為萎蔫短小桿菌。

    2.2 氯菊酯總量、順式體和反式體的降解特征

    用對(duì)映異構(gòu)體比例SR(stereoisomer ratio)表示順式體和反式體濃度的比值,k表示降解速率常數(shù),r2表示數(shù)據(jù)的回歸平方和與總平方和之間的比值。由表1可知,PM-A對(duì)氯菊酯的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程,半衰期為1.41 d。在8 d的培養(yǎng)過(guò)程中,氯菊酯濃度逐漸下降,在降解8 d時(shí),降解率達(dá)到97.64%,前4 d的降解尤為顯著,4 d降解率已達(dá)到9178%。分析其原因,可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中氯菊酯為唯一碳源,PM-A為了生存,只能利用氯菊酯作為碳源生長(zhǎng)。在培養(yǎng)的前4 d,氯菊酯的量比較充足,PM-A可利用氯菊酯大量增殖和生長(zhǎng),故氯菊酯降解速率較快。隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng),氯菊酯濃度持續(xù)降低,不足以提供PM-A所需的碳源,此時(shí)培養(yǎng)基條件惡化,PM-A進(jìn)入衰亡期,氯菊酯降解速率降低。8 d的降解過(guò)程中,SR值基本為0.70左右,與標(biāo)準(zhǔn)品SR值(0.71)相差不大,說(shuō)明PM-A對(duì)氯菊酯的順式體、反式體的降解沒(méi)有選擇性。筆者所在課題組前期已對(duì)氯菊酯在所選石家莊黃土中的降解情況進(jìn)行過(guò)詳細(xì)研究,在黃土中的降解半衰期為7.48 d,氯菊酯的反式體降解速度快于順式體,半衰期分別為5.86、8.99 d[12]。其他研究報(bào)道也表明,氯菊酯在土壤和污泥中的降解速度一般均表現(xiàn)為反式體快于順式體[5,13-14],而本研究中PM-A菌株則對(duì)cis-PM、trans-PM有著相近的降解速率,這可能是由于降解氯菊酯的微生物有很多種,而篩選得到的僅為其中1種,不同的微生物菌群有不同的降解特征,土壤中的降解應(yīng)為各種微生物的綜合代謝作用。

    2.3 氯菊酯對(duì)映異構(gòu)體的降解特征

    為了更好地考察PM-A菌株對(duì)各對(duì)映體的降解差異,本試驗(yàn)測(cè)定了各對(duì)映體在不同時(shí)間的降解濃度,定義ER為先流出對(duì)映體與后流出對(duì)映體的濃度比值,由表2可知,cis-PM的1對(duì)對(duì)映體ER值始終在1.00左右,說(shuō)明降解速率相同,沒(méi)有選擇性;而trans-PM的ER值則從降解0 d的1.00逐漸增大,到降解8 d時(shí)為1.34,說(shuō)明1R-trans的降解速度明顯快于 1S-trans ,2種異構(gòu)體的半衰期分別為1.33、1.46 d。由圖2可以看出,cis-PM的1對(duì)對(duì)映體1S-cis和1R-cis在降解0、8 d的ER值均接近1,而trans-PM的1對(duì)對(duì)映體1S-trans和1R-trans的ER值在降解8 d時(shí)明顯高于1。前期的土壤試驗(yàn)結(jié)果表明,在土壤中cis-PM的1對(duì)對(duì)映體1S-cis和1R-cis的降解速率基本相近[12],本研究結(jié)果與之相一致;土壤中 trans-PM 的1對(duì)對(duì)映體存在降解差異,1S-trans的降解速度略快于1R-trans,半衰期分別為5.09、6.45 d[12],而本研究中PM-A對(duì)反式氯菊酯的降解特征與之相反。這可能因?yàn)橥寥乐械慕到馐歉鞣N微生物菌群協(xié)同作用的結(jié)果,同時(shí)手性農(nóng)藥的對(duì)映體選擇性行為還受到具體環(huán)境條件的影響,因此出現(xiàn)單一菌株和土壤手性降解特征不一致的現(xiàn)象。

    3 結(jié)論

    本研究中優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)M-A對(duì)氯菊酯作用的對(duì)映體差異僅體現(xiàn)在反式異構(gòu)體中, 這與環(huán)境樣品中反式體往往比順式體具有更高的對(duì)映體選擇性相一致,這可能與微生物體內(nèi)降解酶的特定手性結(jié)構(gòu)有關(guān),具體的作用機(jī)制仍有待深入研究。同時(shí),微生物的手性降解可以更有針對(duì)性地降解某一對(duì)映體。因此,采用適宜的微生物菌株可以大大提高環(huán)境污染中手性農(nóng)藥的生物修復(fù)效率和效果。

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