基于分子動(dòng)力學(xué)模擬研究定點(diǎn)突變對(duì)葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響

韋陽(yáng)道+易弋+石征宇+李家杰+蘇家敏+伍時(shí)華+黎婭

摘要：為提高葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)葡聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析，獲得2個(gè)突變體R226A、G224A，用分子動(dòng)力學(xué)的方法從原子水平上研究突變體與野生型的耐熱性。結(jié)果顯示，突變體R226A、G224A的均方根偏差，回旋半徑和靜電勢(shì)能等參數(shù)值要低于野生型蛋白，表明突變體的熱穩(wěn)定性較野生型明顯上升，更有利于在高溫環(huán)境下發(fā)揮其生物活性。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分析的方法研究定點(diǎn)突變對(duì)野生型酶的熱穩(wěn)定性的影響，可大大節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)可為闡明葡聚糖酶耐熱性機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：分子動(dòng)力學(xué)；定點(diǎn)突變；葡聚糖酶；熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： S188 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0054-05

β-葡聚糖酶是專一作用于β-葡聚糖的1，3-及1，4-糖苷鍵，可產(chǎn)生3～5個(gè)葡聚糖單位的低聚糖及葡萄糖[1]。由于β-葡聚糖廣泛存在于植物性飼料中而不能被動(dòng)物所利用，進(jìn)而造成飼料的飼用價(jià)值降低。此外，含有較多β-葡聚糖的飼料被動(dòng)物食用后，會(huì)影響動(dòng)物內(nèi)源性消化酶與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的接觸，導(dǎo)致動(dòng)物的消化率下降[2]。因此，在飼料的加工過(guò)程中添加β-葡聚糖酶將有效降低β-葡聚糖的不良影響，提高動(dòng)物的消化率、飼料的利用率[3]。近年來(lái)，由于飼料加工過(guò)程中須經(jīng)歷高溫高壓的劇烈條件等原因，人們對(duì)嗜熱 β-葡聚糖酶的研究越來(lái)越關(guān)注。

計(jì)算機(jī)分子模擬是以計(jì)算機(jī)及計(jì)算技術(shù)為工具和手段，運(yùn)用計(jì)算數(shù)學(xué)的方法，解決復(fù)雜物理、化學(xué)、生物等問(wèn)題的應(yīng)用科學(xué)[4]，特別是隨著近年來(lái)計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，該手段發(fā)展越來(lái)越完善，其模擬試驗(yàn)所得結(jié)果與真實(shí)試驗(yàn)結(jié)果極為相似，因此可以輔助真實(shí)試驗(yàn)[5]，這樣可以大大節(jié)省試驗(yàn)成本和人力。由于這些優(yōu)點(diǎn)，計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)被廣泛應(yīng)用，在生物學(xué)體系的研究中，該手段被用于解釋核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用[6]、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用[7]、藥物與抗原的作用機(jī)制[8]等，已經(jīng)成為世界研究前沿的領(lǐng)域。

本研究在已篩選出產(chǎn)嗜熱葡聚糖酶的嗜熱脫氮芽孢桿菌并獲得該酶基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法從原子水平上研究定點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)耐熱性的影響，以期獲得耐熱性更高的突變體。但目前由于尚未有對(duì)該酶結(jié)構(gòu)分子的研究，本研究中的部分氨基酸殘基在該酶耐熱性中的作用機(jī)制，可以為以后對(duì)該酶進(jìn)行技術(shù)改造奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

使用引自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）SR01的葡聚糖酶基因序列（登錄號(hào)：YP_006712752.1），在前期研究中，該基因表達(dá)的葡聚糖酶具有較高的熱穩(wěn)定性，其最適溫度為55 ℃，并在90 ℃下2 h仍保持80%左右的生物活性[9]；通過(guò)I-TASSER（http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）網(wǎng)站同源建模預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)，建模所得模型C端結(jié)構(gòu)缺少22個(gè)氨基酸殘基，但是由于它距離該酶的活性部位較遠(yuǎn)，故本研究將所得該結(jié)構(gòu)模型直接作為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，詳?jiàn)圖1。該模型包含223個(gè)殘基，1 808個(gè)原子，15個(gè)β折疊，3個(gè)α螺旋，其結(jié)構(gòu)類似于三明治結(jié)構(gòu)。同源結(jié)構(gòu)的模板為1oq1.C，分辨率為1.70，序列相似性為6544%。

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

通過(guò)同源序列分析，以及氨基酸疏水性（http：//pic.mbu.iisc.ernet.in/index.html）、氨基酸深度和活性位點(diǎn)（http：//mspc.bii.a-star.edu.sg/tankp/intro.html）預(yù)測(cè)分析，筆者得出R226、G224氨基酸殘基位于該結(jié)構(gòu)模型的內(nèi)部，且2個(gè)氨基酸周圍存在大量的疏水性氨基酸，因此筆者可以認(rèn)為，R226、G224可能不利于該酶的熱穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證分析結(jié)果，本試驗(yàn)使用Deepview軟件對(duì)建模結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到R226A、G224A突變體模型；采用Groamcs軟件[10]進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，力場(chǎng)選擇OPLS-AA/L全原子力場(chǎng)[11]，水分子選用SPCE模型[12]，為了模擬真實(shí)環(huán)境，將蛋白質(zhì)置于立方體盒子中，蛋白質(zhì)距離盒子邊緣1.0 nm，采用周期邊界條件，盒子周圍被相同的盒子包圍，以消除邊界效應(yīng)，盒子內(nèi)填充spc216.gro模型水分子，添加離子使得整個(gè)系統(tǒng)的電荷為0，處于中性的環(huán)境中。在能量?jī)?yōu)化后，使用約束動(dòng)力學(xué)的方法，進(jìn)行800 ps的約束動(dòng)力學(xué)模擬，通過(guò)逐步升溫的方法將體系的溫度從50 K升到模擬需要的溫度（324、344、364 K）。之后，采用弱耦合的方法保持體系中溫度、壓強(qiáng)（100 kPa）的穩(wěn)定，溫度和壓強(qiáng)的耦合時(shí)間常數(shù)均為0.1 ps[13]，范德華和庫(kù)倫作用的截?cái)喟霃骄鶠?.4 nm[14]，靜電相互作用使用PME方法計(jì)算[15]，模擬步長(zhǎng)為2 fs，對(duì)3個(gè)體系進(jìn)行20 ns的自由動(dòng)力學(xué)模擬，每2 ps采集1次構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡聚糖酶結(jié)構(gòu)的總體特征

根據(jù)建模所得的模型，筆者分析了該模型的結(jié)構(gòu)合理性，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http：//services.mbi.ucla.edu/SAVES/）進(jìn)行分析。如圖2所示，該模型的各個(gè)氨基酸殘基的平均 3D-ID 值都在0以上，并且有96.86%氨基酸殘基的3D-ID值≥0.2（蛋白質(zhì)的總氨基酸至少有80%≥0.2），這說(shuō)明其三維結(jié)構(gòu)建模所用的模板序列兼容性較好。此外，葡聚糖酶主鏈二面角的99.4%Φ-Ψ角落在Ramachandran圖的核心區(qū)和允許區(qū)，這也表明蛋白質(zhì)主鏈結(jié)構(gòu)具有合理性。

2.2 均方根偏差分析

采用計(jì)算蛋白質(zhì)分子均方根偏差（root mean squared deviation，簡(jiǎn)稱RMSD）的方法來(lái)分析模擬過(guò)程中3個(gè)體系偏離初始位置的大小[16]。在整個(gè)模擬過(guò)程中，初始結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架RMSD可以作為衡量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)。在不同的溫度下，野生蛋白與突變體R226A、G224A的RMSD變化如圖3所示?？梢钥闯?，在324 K的溫度下，3個(gè)體系均較快達(dá)到平衡，在10 ns后，突變體R226A的RMSD明顯低于野生型蛋白，而G224A的RMSD整體略低于野生型蛋白。在 344 K 的溫度下，起始在0～5 ns之間，3個(gè)體系的RMSD呈上升趨勢(shì)，在10～20 ns之間呈平衡的趨勢(shì)，這說(shuō)明溫度的增加對(duì)體系的影響較大。R226A突變體的RMSD變化較小，約為 0.16 nm，G224A與野生型蛋白的RMSD相差無(wú)幾。在 364 K 的溫度下，突變體體系在后10 ns內(nèi)，其RMSD都低于野生蛋白。整體來(lái)看，突變體R226A在324、344 K溫度下，其結(jié)構(gòu)偏離較小，而在364 K溫度下，相比初始結(jié)構(gòu)，其偏離較大，約為0.2 nm；突變體G224A整體相比初始位置偏離較小，約為0.18 nm。這說(shuō)明與野生型蛋白相比，突變體R226A、G224A的熱穩(wěn)定性得以提高，更有利于適應(yīng)高溫環(huán)境。endprint

2.3 蛋白質(zhì)的均方根漲落（root mean square fluctuation，簡(jiǎn)稱RMSF）分析

隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)也會(huì)有相應(yīng)的變化，

在較高的溫度下，會(huì)使蛋白質(zhì)失去一些力的作用，例如氫鍵，通過(guò)RMSF值主要是分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的柔性[17]。由圖4可以看出，溫度對(duì)不同位置的殘基影響不一樣，其中在β折疊（73～82、86～96、99～109、184～199aa）內(nèi)的氨基酸殘基受溫度影響波動(dòng)較小，其RMSF在0.15 nm以下波動(dòng)，在loop環(huán)（61～72、110～126、209～220aa）和α螺旋（148～152aa）內(nèi)的氨基酸殘基受溫度影響較大，最大RMSF可達(dá)到0.4 nm；在324、344 K溫度下，突變體G224A與野生型蛋白的RMSF較突變體R226A大，說(shuō)明G224A與野生型的柔性高于R226A，在364K溫度下，G224A整體柔性低于R226A和野生型，這與上文中蛋白質(zhì)分子均方根偏差的研究結(jié)果一致。此外，在突變位點(diǎn)處的RMSF與野生型相差不大，這也說(shuō)明本研究所選用的位點(diǎn)殘基突變不會(huì)影響蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，且該突變點(diǎn)附近構(gòu)象的異質(zhì)性較小。

2.4 回旋半徑分析

體系的回旋半徑（Rg）是指體系中每個(gè)粒子離體系質(zhì)心距離的幾何平均值。其計(jì)算公式如下：Rg=1n∑ni=1r2i。式中：n表示體系中粒子數(shù)；ri表示體系內(nèi)粒子離體系質(zhì)量中心的距離。對(duì)于相同粒子數(shù)的體系，Rg反映了體系的緊密程度：Rg越大，說(shuō)明體系越膨脹，結(jié)構(gòu)越松散[18]。為了考察3個(gè)體系在不同溫度下的形態(tài)變化，本研究分別計(jì)算了其回旋半徑徑向分布函數(shù)。由圖5可知，在324 K下，突變體R226A的回旋半徑分布在1.675～1.720 nm范圍內(nèi)，其構(gòu)象集中在1.690 nm附近；野生型蛋白回旋半徑分布在1.690～1.730 nm 范圍內(nèi)，其構(gòu)象集中在1.710 nm附近；G224A的回旋半徑分布在1.690～1.720 nm范圍內(nèi)，其構(gòu)象集中在 1.705 nm 附近；在344 K下，野生型蛋白構(gòu)象集中在 1.715 nm 附近，R226A構(gòu)象集中在1.700 nm附近，G224A構(gòu)象集中在1.710 nm附近；在364K溫度下，野生型蛋白構(gòu)象集中在 1.720 nm 附近，R226A構(gòu)象集中在1.705 nm附近，而G224A構(gòu)象集中在1.685 nm附近。整體來(lái)看，R226A、G224A的回旋半徑都低于野生型蛋白，這說(shuō)明突變體體系比野生型更加緊密。在不同溫度下，隨著溫度的增加，R226A與野生型蛋白的Rg值呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這說(shuō)明溫度的增加破壞了部分相互作用，使得整個(gè)體系變得膨脹，而G224A在 364 K 下比 324 K 的Rg值小，這可能是由于溫度的增加破壞了一部分互相作用，同時(shí)也形成了新的相互作用，使得整個(gè)體系變得緊密，更能抵抗高溫環(huán)境。

2.5 疏水性分析

疏水相互作用是指非極性基團(tuán)即疏水基團(tuán)為了避開(kāi)水相而聚集在一起的作用力。一般來(lái)說(shuō)，疏水性殘基被包埋在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到重要的作用[19]。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同溫度下的疏水溶劑可及表面的大小來(lái)衡量蛋白質(zhì)解折疊的程度，進(jìn)而判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[20]，模擬試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯?24 K下，野生型蛋白質(zhì)的疏水溶劑可及表面的分布范圍為53～61 nm2，其構(gòu)象集中在58 nm2附近；R226A的疏水溶劑可及表面的主要分布范圍為52～62 nm2，其構(gòu)象集中在57 nm2附近；G224A的疏水溶劑可及表面主要分布在53～61 nm2，構(gòu)象集中在55～57 nm2 附近；在344、364 K下，野生型蛋白的疏水溶劑可及表面變化較小，主要分布在53～62 nm2；R226A體系疏水溶劑可及表面呈隨溫度增加而增加的趨勢(shì)，主要分布在53～63 nm2，其構(gòu)象分別集中于57、58 nm2附近；而G224A體系隨著溫度的增加，其疏水溶劑可及表面呈下降趨勢(shì)，其構(gòu)象分別主要集中在59、56 nm2 附近，這說(shuō)明溫度的增加使得該體系的結(jié)構(gòu)變得更緊密，以抵抗高溫環(huán)境，與以上研究中G224A回旋半徑變小一致，進(jìn)一步可以說(shuō)明，疏水性大小對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)性起著重要作用。整體來(lái)看，R226A、G224A在324、364 K 下，其疏水溶劑可及表面都低于野生型，這可能是由突變后的氨基酸造成的。Arg226、Gly224氨基酸殘基是極性氨基酸，具有親水性，并位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏水內(nèi)核，不利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而突變?yōu)锳la226、Ala224氨基酸殘基后，由于它實(shí)際上并非極性氨基酸，具有疏水性，有利于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核更好地折疊，因此可以推測(cè)，突變體系的熱穩(wěn)定性要高于野生型。

2.6 其他參數(shù)分析

影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素有很多，例如氫鍵、鹽鍵和分子靜電勢(shì)能等[21]，本研究分別考察了突變體與野生型蛋白的氫鍵數(shù)、鹽鍵數(shù)和分子靜電勢(shì)能，進(jìn)一步研究溫度對(duì)突變體系、野生型體系的影響。由表1 可以看出，隨著溫度升高，突變體與野生型蛋白形成的鹽橋數(shù)量增加，在相同的溫度下，突變體的鹽橋數(shù)略高于野生型。由于鹽橋可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的剛性，維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此認(rèn)為，在高溫環(huán)境下，嗜熱酶可能會(huì)形成更多的鹽橋來(lái)維持自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[22]。在不同的溫度下，突變體和野生型分子間、蛋白質(zhì)與水分子間的氫鍵數(shù)隨溫度上升有下降趨勢(shì)，因此可認(rèn)為，溫度升高破壞了部分氫鍵，使得蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)間的作用力下降，造成結(jié)構(gòu)松散，抵抗高溫環(huán)境能力變差；在相同的溫度下，野生型蛋白與突變體蛋白相比氫鍵數(shù)相差不大，而野生型蛋白質(zhì)與水分子之間的氫鍵數(shù)高于突變體系，這也可能與野生型可及溶劑表面高于突變體系，可以與水分子形成更多的氫鍵有關(guān)。蛋白質(zhì)分子靜電勢(shì)能是衡量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分子是否穩(wěn)定的重要參數(shù)，其值越小，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。在相同溫度下，突變體體系與野生型分子靜電勢(shì)能相差較大，突變體體系之間靜電勢(shì)能相差無(wú)幾；而隨著溫度的升高，野生型與突變體體系的分子靜電勢(shì)能出現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)，這說(shuō)明溫度的升高使3個(gè)體系的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。整體來(lái)看，溫度破壞了分子結(jié)構(gòu)的各種作用力，并且重新形成了新的作用力，因此評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定，需要綜合各種參數(shù)作出正確的判斷。endprint

3 結(jié)論與討論

目前，嗜熱蛋白以其自身獨(dú)特的優(yōu)越性被廣泛關(guān)注，已成為研究的熱門。有研究表明，增加蛋白質(zhì)中的氫鍵[23]、鹽鍵[24]和二硫鍵[25]有利于提高酶的穩(wěn)定性。也有研究表明，增加精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）的含量，降低谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）的含量有助于提高酶的熱穩(wěn)定性，主要的原因是Ala利于螺旋結(jié)構(gòu)的形成[26]；Pro由于其結(jié)構(gòu)熵相比其他氨基酸小而更易于發(fā)生折疊，折疊后的結(jié)構(gòu)需要更高的能量才能使其去折疊，這樣在不影響酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)的前提下，引入Pro有助于提高酶的熱穩(wěn)定性[27]；Arg由于具有胍基和較大的側(cè)鏈， 可提高與其他氨基酸殘基之間的疏水作用和離子間的作用力，有助于提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[28]；而Asn和Gln由于在高溫條件下易發(fā)生脫氨作用，造成酶部分失活，因此不利于提高酶的熱穩(wěn)定性[29]。

為了研究葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性機(jī)制，本研究通過(guò)使用分子模擬的方法，從原子水平分析了突變體R226A、G224A和野生型蛋白的熱動(dòng)力學(xué)特性。相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在相同溫度下，突變體R226A、G224A的RMSD要低于野生型，在不同溫度下，突變體與野生型蛋白的RMSD均升高，這表明突變體由于一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化進(jìn)而使得高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其與野生型相比，熱穩(wěn)定性提高；同時(shí)也可以得出，溫度可以破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的作用力，造成結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定；通過(guò)對(duì)突變體與野生型蛋白的均方根漲落分析可以得出，氨基酸片段突變體較野生型的無(wú)規(guī)則卷曲和α螺旋部分波動(dòng)大，而β折疊部分波動(dòng)較小，且突變體R226A的柔性總體要低于野生型，α螺旋柔性較大可能與其所處的位置及氨基酸的組成、數(shù)量有關(guān)。在不同溫度下，隨著溫度的升高，部分氨基酸殘基的柔性有增加的趨勢(shì)，然而也有部分氨基酸殘基的柔性降低，這可能是與其他氨基酸殘基形成新的作用力造成的?；匦霃奖硎镜囊粋€(gè)體系的膨脹程度，回旋半徑越小，說(shuō)明該體系結(jié)合越緊密，分子間的作用力越強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子的耐熱性越好。在相同的溫度下，可以得出，突變體R226A、G224A的回旋半徑比野生型小，這說(shuō)明突變體的熱穩(wěn)定性較野生型強(qiáng)，可能是與突變后的氨基酸有關(guān)；然而在不同的溫度下，突變體與野生型的回旋半徑變化略微增大，這可能與本研究所使用的溫度不足以使得蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊有關(guān)。疏水作用在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能方面有著重要的作用，本研究通過(guò)分析突變體與野生型蛋白的疏水溶劑可及表面得出，突變體R226A的疏水溶劑可及表面積比野生型蛋白小，由此可以推測(cè)，突變體R226A主要是由于突變后的A226是疏水氨基酸，改變了蛋白質(zhì)的疏水環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得內(nèi)部疏水內(nèi)核進(jìn)一步折疊，增強(qiáng)了該突變體的熱穩(wěn)定性。本研究同時(shí)分析了不同溫度下3個(gè)體系的其他參數(shù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：隨著溫度的升高，突變體與野生型蛋白的分子勢(shì)能明顯升高，蛋白質(zhì)間與蛋白質(zhì)與水之間的氫鍵數(shù)下降，而鹽橋數(shù)有上升的趨勢(shì)，這與Thomas等研究鹽鍵在100 ℃下比25 ℃下的作用力大幅度增強(qiáng)，并對(duì)于體系溫度的增加具有一定彈性一致[22]。由此，筆者通過(guò)結(jié)合以上研究結(jié)果，認(rèn)為R226A、G224A有助于提高葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。本研究首次從原子水平上探討葡聚糖酶的耐熱機(jī)制，對(duì)今后提高葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提供了理論指導(dǎo)意義。

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