芒果ANS基因的鑒定及與其他植物的比較分析

蓋江濤+黃建峰+黨志國+朱敏+陳華蕊+王鵬+陳業(yè)淵

摘要：花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS，EC：1.14.11.19）是花青素合成中的一個關(guān)鍵酶。為了鑒定和分析芒果ANS基因，以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以擬南芥的ANS基因?yàn)閰⒖?，通過BLAST方法獲得了番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、小果野蕉、桃子、葡萄、龍眼、甜櫻桃、棗、石榴、西洋梨、中華獼猴桃、荔枝、無油樟的ANS基因序列，對其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進(jìn)化樹沒有單獨(dú)形成分支，推測在進(jìn)化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后；理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，酸性蛋白占97.2%、穩(wěn)定性蛋白占13.9%，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無信號肽的親水性蛋白；蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，α-螺旋、無規(guī)則卷曲是主要結(jié)構(gòu)元件。說明芒果ANS基因具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，并與本試驗(yàn)中的絕大多數(shù)植物ANS基因具有相似的性質(zhì)。這為進(jìn)一步研究芒果ANS基因在花青素合成途徑中的作用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：芒果；花青素；花青素合成酶；系統(tǒng)進(jìn)化；同源性；蛋白二級結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S667.701 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0043-07

芒果（Mangifera indica Linnaeus）俗稱芒果，是漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera Linnaeus）的著名熱帶果樹，因其果肉細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)價值豐富，且具有理氣、健脾、益胃、降低膽固醇、防治心血管疾病、預(yù)防乳腺癌等多種功效，深受人們歡迎[1]。芒果果實(shí)色澤作為人們挑選芒果的一個重要參考指標(biāo)，它的形成是一個非常復(fù)雜的代謝過程，主要與類胡蘿卜素和花青素代謝途徑有關(guān)?；ㄇ嗨兀╝nthocyanin）又稱花色素，是一類決定顏色的重要的天然水溶性色素，屬于黃酮類化合物，廣泛分布于多種植物組織中，是形成植物花、果實(shí)等組織顏色的主要色素[2]。花青素的含量在決定植物的花色、葉色、果色和其他經(jīng)濟(jì)器官的色澤及其營養(yǎng)品質(zhì)方面起著重要作用，還可以起到吸引昆蟲和植食性動物以達(dá)到傳播花粉和種子的目的[3-4]。

花青素合成酶（無色花色素雙加氧酶，anthocyanidin synthase，ANS/leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX，EC：114.11.19）是花青素合成途徑末端的一個關(guān)鍵酶，通過Fe2+和 2-酮戊二酸離子將無色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族[5]。因此，可通過上調(diào)或抑制ANS基因的表達(dá)來改變花青素的含量或成分，從而引起植物花色的變化。ANS （LDOX）最初是從玉米的A2突變體中克隆得到[6]。目前，ANS基因已在擬南芥[7]、荔枝[8]、芒果[9]、龍眼[10]、葡萄[11]、蘋果[12]、越橘[13]、茶樹[14]、棕色棉[15]等多種植物中克隆。

ANS基因的表達(dá)水平與花青素累積之間的關(guān)系也在多種植物中被研究。游向榮等研究結(jié)果表明，龍眼芽軸顏色和ANS基因的表達(dá)差異有關(guān)[10]。龍眼正常成花的頂芽芽軸萌動時，芽軸顏色變紅，ANS基因正常表達(dá)；而發(fā)生成花逆轉(zhuǎn)時，芽軸顏色保持淺黃色，ANS基因下調(diào)表達(dá)。Honda等在蘋果中發(fā)現(xiàn)，5個花青素合成相關(guān)基因在果皮著色過程中協(xié)同表達(dá)，并且其表達(dá)水平和花青素含量呈正相關(guān)[16]。Salvatierra等研究表明，在草莓果實(shí)成熟過程中，花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，并且其在紅色果實(shí)中的表達(dá)水平明顯高于白色果實(shí)[17]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，ANS基因表達(dá)活性上調(diào)，使得桑樹的果實(shí)變?yōu)榧t色[18]。李曉艷等研究發(fā)現(xiàn)，越橘從開花到果實(shí)成熟的整個發(fā)育過程中都能檢測到ANS基因的表達(dá)，在成熟果的果皮中，ANS基因的表達(dá)量最高；而花色素苷的含量隨著果實(shí)的成熟而增高，在越橘成熟果的果皮中，花色素苷的含量最高，與ANS基因表達(dá)量的變化一致[13]。研究說明，ANS基因在越橘果實(shí)花色素苷形成過程中可能起到調(diào)控作用，并具有一定的組織特異性。

本試驗(yàn)以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以已知ANS基因功能的雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）十字花科（Brassicaceae）擬南芥[Arabidopsis thaliana （Linnaeus） Heynhold]的ANS基因?yàn)閰⒖?，依托全基因組數(shù)據(jù)庫，通過BLAST的方法獲得了雙子葉植物（Dicotyledons）番木瓜科（Caricaceae）番木瓜（Carica papaya Linnaeus），蕓香科（Rutaceae）金錢橘（Citrus clementina Hortulanorum ex Tanaka）、甜橙[Citrus sinensis = C. ×sinensis （Linnaeus） Osbeck]，薔薇科（Rosaceae）蘋果（Malus domestica Borkhausen=Malus pumila Miller）、桃子[Prunus persica （Linnaeus） Batsch= Amygdalus persica Linnaeus]、甜櫻桃[Prunus avium （Linnaeus） Linnaeus = Cerasus avium （Linnaeus） Moench]、西洋梨（Pyrus communis Linnaeus），葡萄科（Vitaceae）葡萄（Vitis vinifera Linnaeus），鼠李科（Rhamnaceae）棗（Ziziphus jujuba Miller），石榴科（Punicaceae）石榴（Punica granatum Linnaeus），獼猴桃科（Actinidiaceae）中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planchon），漆樹科芒果，無患子科（Sapindaceae）龍眼（Dimocarpus longan Loureiro）、荔枝（Litchi chinensis Sonnerat），無油樟科（Amborellaceae）無油樟（Amborella trichopoda Baillon），單子葉植物（Monocotyledons）芭蕉科（Musaceae）小果野蕉（Musa acuminata Colla）的ANS基因序列，通過系統(tǒng)進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等分析這17種植物ANS基因序列，比較果樹中ANS基因的特性，為分析ANS基因在芒果中的表達(dá)特性及其在花青素合成途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為推動芒果ANS基因功能研究提供理論支持。endprint

1 材料與方法

1.1 同源性搜索和數(shù)據(jù)提取

從NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome V9.1[19]（http：//www.phytozome.net）中搜索得到擬南芥含有花青素合成酶結(jié)構(gòu)域（pfam：cl21496、pfam：cl21672）的序列；從趙志常等文章中獲得芒果ANS蛋白序列[9]。將得到的序列合并，刪除重復(fù)序列。以得到的無重復(fù)序列集作為探針，通過BLASTP進(jìn)行同源性搜索，為了防止錯誤丟失與探針相似度低但含有花青素合成酶結(jié)構(gòu)域的序列，搜索的E值設(shè)為10，對應(yīng)的檢索閾值為Pfam數(shù)據(jù)庫提供的“cut-off ”值。從Kiwifruit Genome Database[20] （http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/download.cgi）中搜索得到中華獼猴桃ANS基因序列，從趙志常等文章中獲得荔枝ANS蛋白序列[8]。合并檢索得到的所有序列，刪除冗余序列和結(jié)構(gòu)域較短的序列，得到芒果、擬南芥、番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉、無油樟的ANS蛋白序列，共36條序列，均含有完整的花青素合成酶結(jié)構(gòu)域。

1.2 多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析及物種進(jìn)化分析

通過MEGA 6.0[21]軟件中的MUSCLE[22]工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的多序列比對，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。將比對結(jié)果導(dǎo)入Gblocks[23-24]在線服務(wù)器中，選擇保守區(qū)域進(jìn)行后續(xù)研究，為了獲得更多保守區(qū)域位點(diǎn)，選中3個較為寬松的選項(xiàng)（option for a less stringent selection）。調(diào)整后的序列使用MrBayes 322[25]進(jìn)行基于貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析，共進(jìn)行2次獨(dú)立運(yùn)算，每次運(yùn)行設(shè)置2 000 000代，且每次運(yùn)算使用4條蒙特卡洛-馬爾科夫鏈（Markov chain Monte Carlo，MCMC）進(jìn)行隨機(jī)取樣，冷鏈溫度設(shè)置為0.1，在取樣中每1 000代保存1棵樹，共保存2 000棵樹。前20的樹作為burn-in舍棄，其余80的樹用來構(gòu)建貝葉斯一致樹和后驗(yàn)概率。生成的貝葉斯一致樹保存為nexus格式，并在Figtree v1.4.0軟件中進(jìn)行編輯。物種系統(tǒng)進(jìn)化分析通過在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi）完成。

1.3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

利用CD search （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[26]進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，采用ProtParam tool （http：//web.expasy.org/protparam/）[27]在線工具預(yù)測分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，應(yīng)用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMpred-form.html）[28]在線分析來預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向。用TargetP 1.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[29]在線預(yù)測氨基酸序列導(dǎo)肽，應(yīng)用signalP 4.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[30]中完成蛋白質(zhì)信號肽的預(yù)測。亞細(xì)胞定位應(yīng)用Cell-PLoc 2.0 package軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）[31]進(jìn)行在線分析。二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）[32]完成。利用NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[33]分析編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

1.4 擬南芥ANS基因生育期芯片數(shù)據(jù)表達(dá)模式的分析

從Plant Expression Database （http：//www.plexdb.org/）[34]的數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥的RMA文件，提取擬南芥的5條ANS基因AT4G22880.1、AT4G16330.2、AT5G05600.1、AT2G38240.1、AT3G11180.2分別在各生育期組織[下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、幼葉（10 d）、成熟葉（17 d）、老葉（35 d）、葉柄（17 d）、種子（8周）、根（7 d）、根（15 d）、根（21 d）、芽（7 d）、莖尖（14 d）、花萼（>21 d）、花瓣（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）、花梗（>21 d）]的表達(dá)情況，結(jié)果用gplots軟件包中的heatmap.2軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果與其他16種植物ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用CD search對36條ANS氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示所有的ANS蛋白序列包含1個DIOX-N[35]（non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal，嗎啡合成N-端的非血紅素加氧酶）亞家族結(jié)構(gòu)域和1個2OG-FeII_Oxy[36]（2-oxoglutarate Fe（II） oxygenase，2-酮戊二酸-Fe2+氧化酶）亞家族結(jié)構(gòu)域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，ANS酶通過Fe2+和（2-oxoglutarate）離子將無色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族。芒果ANS蛋白序列的結(jié)構(gòu)域如圖1，與其他16種植物ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域一致。endprint

2.2 芒果與其他16種植物ANS蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析及ANS蛋白質(zhì)氨基酸基序分析

本試驗(yàn)得到的36條氨基酸序列中，包含擬南芥5條、番木瓜1條、金錢橘4條、甜橙4條、蘋果3條、小果野蕉4條、桃子3條、葡萄2條、龍眼1條、甜櫻桃1條、棗2條、石榴1條、西洋梨1條、中華獼猴桃1條、芒果1條、荔枝1條、無油樟1條。對36條氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選自成一目、一科、一屬的孑遺植物無油樟為外類群，結(jié)果（圖2-A）顯示，進(jìn)化樹分為3支，其中被選為外類群的無油樟科無油樟的ANS基因?yàn)閱为?dú)一支，其余16種植物的ANS基因分為2支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進(jìn)化樹沒有單獨(dú)形成分支，而是互相摻雜在一起，推測在進(jìn)化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

通過MEME程序在ANS蛋白中識別出10個潛在的保守基序（圖2-B），不同的基序用不同顏色的方框表示。根據(jù)這10個基序的分布，可以將36條ANS蛋白分為與進(jìn)化結(jié)果相似的3個亞家族。由圖2-B可以看出，除Prupe|Prupe.3G183300.1外，都有Motif1基序；除Arath|AT4g16330.2與Ambtr|XP_006828895外，都有Motif10。在3個亞家族中，基序的排列順序都高度保守。第Ⅰ亞家族中基序的分布情況：（1）都有Motif6基序；（2）除Musac|GSMUA_Achr11T23830_001外，都有Motif7；（3）除Maldo|MDP0000156478外，都有Motif9；（4）除Arath|AT4G16330.2外，都有Motif8；（5）除Arath|AT4G16330.2、Prupe|Prupe.3G183300.1、Citcl|Ciclev10012063m、Citsi|orange1.1g018466m外，都有Motif3。第Ⅱ亞家族中分布情況：（1）除Musac|GSMUA_Achr5T04080_001外，都有Motif4；（2）除Zizju|XP_015896715、Arath|AT4G22880.1外，都有Motif2；（3）除Manin|ANS外，都有Motif5。在第Ⅲ亞家族中，Ambtr|XP_006828895基序的特征：（1）有絕大多數(shù)氨基酸都有的Motif1基序，卻沒有絕大多數(shù)氨基酸都有的Motif10；（2）有第Ⅰ亞家族的保守基序Motif8，有第Ⅱ亞家族的保守基序Motif2、Motif4。

2.3 芒果與其他16種植物ANS基因的物種進(jìn)化分析

將本試驗(yàn)中選定的17種植物做物種進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，雙子葉植物綱的植物聚為一大分支，單子葉植物綱的植物為一支，外類群植物為一支。在本研究選取的15種果樹中，同是薔薇科的蘋果、西洋梨、桃子、甜櫻桃聚為一支，同是蕓香科金錢橘和甜橙聚為一支，同是無患子科的龍眼、荔枝聚為一支，說明在物種進(jìn)化過程中，同綱植物親緣關(guān)系更近，不同綱的植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時，芒果處于金錢橘、甜橙與荔枝、龍眼之間，說明在物種進(jìn)化過程中，芒果與金錢橘、甜橙、荔枝、龍眼的親緣關(guān)系更近，其次是番木瓜，而與蘋果、西洋梨、桃子、甜櫻桃、棗、葡萄、中華獼猴桃親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與小果野蕉的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 芒果與其他16種植物ANS蛋白的理化性質(zhì)分析

對36條ANS氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表1）顯示，除Arath|AT2G38240.1為堿性蛋白（理論pI>7）外，其余蛋白均為酸性蛋白質(zhì)（理論pI<7），酸性蛋白質(zhì)占972%；根據(jù)Guruprasad方法[37]，除Arath|AT5G05600.1、Citcl|Ciclev10031811m、Maldo|MDP0000156478、Musac|GSMUA_Achr10T00230_001、Ambtr|XP_006828895為穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)<40）外，其余蛋白均為不穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)>40），穩(wěn)定性蛋白占13.9%；相對分子量除Maldo|MDP0000621569為52841.2外，其余位于36.21～46.16 ku；僅金錢橘Citcl|Ciclev10012063m與甜橙Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m基因具有線粒體靶向肽M （mitochondrial targeting peptide，mTP），其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%；所有蛋白均為親水性蛋白（GRAVY<0）、無信號肽；所有基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。說明芒果與其他絕大多數(shù)植物ANS蛋白具有相似的性質(zhì)，為非分泌性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝活動。

2.5 芒果ANS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區(qū)段的相互關(guān)系及側(cè)鏈構(gòu)象。常見的二級結(jié)構(gòu)元件有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲4種形式，α-螺旋是蛋白質(zhì)中最常見的二級結(jié)構(gòu)元件。α-螺旋靠氫鍵維持穩(wěn)定，在DNA結(jié)合基序中有非常重要的作用；β-折疊是由伸展的肽鏈組成，通過位于同一個肽鏈或相鄰肽鏈的另一個酰胺氫和一個肽鍵的羰基氧之間的氫鍵維持；β-轉(zhuǎn)角連接蛋白質(zhì)分子中的二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋和β-折疊），是肽鏈走向改變的一種非重復(fù)多肽區(qū)，蛋白質(zhì)的抗體識別、磷酸化、糖基化和羥基化位點(diǎn)經(jīng)常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角；無規(guī)則卷曲主要指那些不能被歸入明確的二級結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段，也是明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，它們受側(cè)鏈相互作用的影響很大，經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。

應(yīng)用在線工具SOPMA預(yù)測17種植物的ANS氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)（表1），除Arath|AT5G05600.1、Arath|AT3G11180.2、Maldo|MDP0000621569、Maldo|MDP0000156478的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲、β-折疊外，其余蛋白均以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件。芒果ANS氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）顯示，α-螺旋是芒果ANS最大量的結(jié)構(gòu)元件，占43.3%；其余由31.91%的無規(guī)則卷曲、15.38%的β-折疊、9.4%的β-轉(zhuǎn)角組成。說明芒果ANS與本試驗(yàn)中的絕大多數(shù)植物ANS蛋白一樣，具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。endprint

2.6 芒果ANS蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的基本機(jī)制，一般發(fā)生在翻譯后修飾；由于氨基酸側(cè)鏈加入了1個帶強(qiáng)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，發(fā)生酯化作用，從而改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、活性。因此，蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)是判斷其功能的特征之一。蛋白質(zhì)磷酸化作為普遍存在于生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)方式，其主要發(fā)生在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基側(cè)鏈的羥基上。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明，芒果ANS基因所編碼的蛋白質(zhì)含有15個磷酸化位點(diǎn)（圖5），其中Ser 11個、Thr 1個和Tyr 3個。推測芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過改變自身構(gòu)象來轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至外模蛋白有關(guān)，也可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

2.7 擬南芥ANS基因生育期芯片中的表達(dá)模式

由于芒果ANS基因的研究目前只限于克隆，在進(jìn)一步的試驗(yàn)研究過程中，以期在模式植物的研究成果中得到借鑒作用。現(xiàn)以擬南芥ANS基因生育芯片的表達(dá)模式為例，繪制出擬南芥ANS基因家族的表達(dá)模式圖，如圖6所示。擬南芥5條ANS基因的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的組織特異性：AT4G16330.2基因除在花粉（6周）表達(dá)較弱外，其余組織均表達(dá)較強(qiáng)；AT5G05600.1基因在成熟葉（17 d）、花萼（>21 d）中表達(dá)最強(qiáng)，在花粉（6周）、莖尖（14 d）、幼葉（10 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、花梗（>21 d）表達(dá)較弱，其余組織均表達(dá)較強(qiáng)；AT2G38240.1基因在雄蕊（>21 d）表達(dá)較強(qiáng)，在花瓣（>21 d）、成熟葉 （17 d）、葉柄（17 d）表達(dá)較弱，其余組織均無表達(dá)；AT4G22880.1在老葉（35 d）中表達(dá)最強(qiáng)，在種子（8周）、老葉（35 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、成熟葉（17 d）中表達(dá)較弱，其余組織均無表達(dá)；AT3G11180.2除在花粉（6周）、種子（8周）中有較強(qiáng)表達(dá)外，其余組織均無表達(dá)。

3 討論

ANS基因作為花青素合成途徑中的關(guān)鍵基因，廣泛用于植物基因工程研究。本試驗(yàn)以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以擬南芥ANS基因?yàn)閰⒖?，對芒果、擬南芥、番木瓜、金錢橘、甜橙、蘋果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉和無油樟17種植物共36條ANS基因編碼蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，系統(tǒng)進(jìn)化樹中被選為外類群的雙子葉植物綱無油樟科無油樟為單獨(dú)一支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因互相摻雜在一起，ANS基因進(jìn)化樹沒有將雙子葉植物與單子葉植物分開，與植物物種之間的親緣關(guān)系及進(jìn)化關(guān)系不一致，推測在進(jìn)化過程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，所有蛋白中，酸性蛋白占972%、穩(wěn)定性蛋白占13.9%，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無信號肽的親水性蛋白。通過蛋白質(zhì)導(dǎo)肽分析可知，僅金錢橘基因Citcl|Ciclev10012063m與甜橙基因 Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m具有線粒體靶向肽M （mTP）外，其余氨基酸序列均沒有導(dǎo)肽。芒果ANS蛋白與其他植物ANS蛋白表現(xiàn)出相似的性質(zhì)，為酸性、無信號肽、無導(dǎo)肽的不穩(wěn)定親水性蛋白，是一種非分泌性蛋白，由游離核糖體合成，參與細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)代謝過程中發(fā)揮重要作用。這與亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)果一致，也與花色素苷的合成主要在細(xì)胞質(zhì)中完成一致。

結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，芒果ANS蛋白與其他蛋白序列都包含1個DIOX-N亞家族結(jié)構(gòu)域和1個2OG-FeII_Oxy亞家族結(jié)構(gòu)域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，屬于雙加氧酶家族，具有ANS基因家族的特征結(jié)構(gòu)；芒果蛋白二級結(jié)構(gòu)與大多數(shù)蛋白一樣，以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。

蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明，芒果ANS蛋白存在15個磷酸化位點(diǎn)。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過改變自身構(gòu)象來轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至外模蛋白有關(guān)，也可能與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，磷酸化在該蛋白上的具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

模式植物擬南芥ANS基因生育期芯片表達(dá)模式分析結(jié)果表明，5條基因的表達(dá)差異較大，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。以擬南芥的ANS基因?yàn)閰⒖?，以期對研究芒果ANS基因的表達(dá)、功能具有借鑒作用。

目前，雖有關(guān)于芒果中ANS基因的研究，但主要是對單個基因的克隆及生化特性的研究[9]。本研究以不同植物ANS基因具有較高的同源性為依據(jù)，選取17個物種（包括15種果樹、1種模式植物、1種系統(tǒng)發(fā)育樹選為外類群的植物），比較了芒果與其他植物中ANS基因的特性，具有更強(qiáng)的針對性和借鑒性。研究結(jié)果得出，芒果ANS蛋白性質(zhì)與其他植物ANS蛋白表現(xiàn)出高度相似性，芒果ANS基因具有ANS基因家族特征，推測芒果ANS基因與其他植物起著相同或相似的生物學(xué)功能，但還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)對進(jìn)一步研究芒果ANS基因的時空表達(dá)特性及在花青素合成途徑中的作用機(jī)制提供理論支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅學(xué)兵. 芒果的營養(yǎng)價值、保健功能及食用方法[J]. 中國食物與營養(yǎng)，2011，17（7）：77-79.

[2]Andersen M，Jordheim M. The anthocyanins[M]//Andersen M，Markham K R. Flavonoids：chemistry，biochemistry and applications. Boca Raton，F(xiàn)lorida：CRC Press，2006：471-551.endprint

[3]Ravindra P V，Narayan M S. Antioxidant activity of the anthocyanin from carrot （Daucus carota） callus culture[J]. International Journal of Food Sciences & Nutrition，2003，54（5）：349-355.

[4]Lev-Yadun S，Gould K S. Role of anthocyanins in plant defence[M]//Gould K，Davies K，Winefield C. Anthocyanins：biosynthesis，functions，and applications. New York：Springer，2009：22-28.

[5]Xie D Y，Jackson L A，Cooper J D，et al. Molecular and biochemical analysis of two cDNA clones encoding dihydroflavonol-4-reductase from Medicago truncatula[J]. Plant Physiology，2004，134（3）：979-994.

[6]Menssen A，Hhmann S，Martin W，et al. The En/Spm transposable element of Zea mays contains splice sites at the termini generating a novel intron from a dSpm element in the A2 gene[J]. The EMBO Journal，1990，9（10）：3051-3057.

[7]Wilmouth R C，Turnbull J J，Welford R W，et al. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from Arabidopsis thaliana [J]. Structure，2002，10（1）：93-103.

[8]趙志常，胡福初，黃建峰，等. 荔枝ANS基因的克隆及其序列分析[J]. 北方園藝，2012 （19）：118-121.

[9]趙志常，陳業(yè)淵，高愛平，等. 芒果ANS基因的克隆及其序列分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2014，29 （增刊1）：6-9.

[10]游向榮，許鴻川，梁文裕，等. 龍眼花芽ANS基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2010，18（3）：288-292.

[11]Wang H，Wang W，Zhang P，et al. Gene transcript accumulation，tissue and subcellular localization of anthocyanidin synthase （ANS） in developing grape berries[J]. Plant Science，2010，179（1）：103-113.

[12]Kim S H，Lee J R，Hong S T，et al. Molecular cloning and analysis of anthocyanin biosynthesis genes preferentially expressed in apple skin[J]. Plant Science，2003，165（2）：403-413.

[13]李曉艷，裴嘉博，張志東，等. 越橘VcANS基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012（6）：201-209.

[14]金琦芳，陳志丹，孫威江，等. 茶樹CsANS基因及其啟動子的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 茶葉科學(xué)，2016，36（2）：219-228.

[15]孫宏偉，李艷軍，王雅琴，等. 棕色棉GhANS基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2014，28（2）：200-207.

[16]Honda C，Kotoda N，Wada M，et al. Anthocyanin biosynthetic genes are coordinately expressed during red coloration in apple skin[J]. Plant Physiology & Biochemistry，2002，40（11）：955-962.

[17]Salvatierra A，Pimentel P，Moya-Leon M A，et al. Comparison of transcriptional profiles of flavonoid genes and anthocyanin contents during fruit development of two botanical forms of Fragaria chiloensis ssp. chiloensis[J]. Phytochemistry，2010，71（16）：1839-1847.

[18]Li J，Lü R H，Zhao A C，et al. Isolation and expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in Morus alba L.[J]. Biologia Plantarum，2014，58（4）：618-626.

[19]Goodstein D M，Shu S，Howson R，et al. Phytozome：a comparative platform for green plant genomics[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（D1）：D1178-D1186.endprint

[20]Huang S，Ding J，Deng D，et al. Draft genome of the kiwifruit Actinidia chinensis [J]. Nature Communications，2013，4：2640.

[21]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology & Evolution，2013，30（12）：2725-2729.

[22]Edgar R C. MUSCLE：multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[J]. Nucleic Acids Research，2004，32（5）：1792-1797.

[23]Castresana J. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis[J]. Molecular Biology & Evolution 2000，17（4）：540-552.

[24]Talavera G，Castresana J. Improvement of phylogenies after removing divergent and ambiguously aligned blocks from protein sequence alignments[J]. Systematic Biology，2007，56（4）：564-577.

[25]Ronquist F，Teslenko M，van der Mark P，et al. MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space[J]. Systematic Biology，2012，61（3）：539-542.

[26]Marchler-Bauer A，Derbyshire M K，Gonzales N R，et al. CDD：NCBIs conserved domain database[J]. Nucleic Acids Research，2015，43（Database issue）：222-226.

[27]Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M]//Walker J M. The Proteomics protocols handbook. Totowa，New Jersey，US：Humana Press，2005：571-607.

[28]Hofmann K，Stoffel W. Tmbase—A database of membrane spanning protein segments[J]. Biological Chemistry Hoppe-Seyler，1993，374：166.

[29]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[30]Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[31]Chou K C，Shen H B. Plant-mPLoc：a top-down strategy to augment the power for predicting plant protein subcellular localization[J]. PLoS One，2010，5（6）：e11335.

[32]Sapay N，Guermeur Y，Deléage G. Prediction of amphipathic inplane membrane anchors in monotopic proteins using a SVM classifier[J]. BMC Bioinformatics，2006，7：255.

[33]Blom N，Gammeltoft S，Brunak S. Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites[J]. Journal of Molecular Biology，1999，294（5）：1351-1362.

[34]Dash S，Van Hemert J，Hong L，et al. PLEXdb：gene expression resources for plants and plant pathogens[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（D1）：D1194-D1201.

[35]Hagel J M，F(xiàn)acchini P J. Dioxygenases catalyze the O-demethylation steps of morphine biosynthesis in opium poppy[J]. Nature Chemical Biology，2010，6（4）：273-275.

[36]Aravind L，Koonin E V. The DNA-repair protein AlkB，EGL-9，and leprecan define new families of 2-oxoglutarate-and iron-dependent dioxygenases[J]. Genome Biology，2001，2（3）：181-200.

[37]Guruprasad K，Reddy B V B，Pandit M W. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition：a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence[J]. Protein Engineering，1990，4（2）：155-161.endprint