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    一例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

    2017-11-29 06:42:03費(fèi)中杰揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院225001
    關(guān)鍵詞:克雷伯血清型菌落

    費(fèi)中杰 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 225001

    一例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

    費(fèi)中杰 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 225001

    2016年11月,泰州市某畜主送2只病羊到揚(yáng)州某動(dòng)物醫(yī)院就診。病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、眼睛紅腫、咳嗽。從病羊中分離出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,兩種菌株對(duì)諾氟沙星和氧氟沙星等藥物高敏,對(duì)青霉素和紅霉素等藥物耐藥。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)調(diào)整用藥方案,從而使病情迅速得到控制。

    羊;肺炎克雷伯菌;大腸桿菌

    肺炎克雷伯菌廣泛分布于動(dòng)物的呼吸道和消化道中,是一種條件致病菌。該菌在韓國、歐洲和非洲等地都有報(bào)道,并呈現(xiàn)增多的趨勢[1]。近年來由于抗生素的濫用,導(dǎo)致肺炎克雷伯菌的耐藥性普遍存在,給治療帶來困難[2]。本研究從病死湖羊的組織中分離培養(yǎng)出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌,通過實(shí)驗(yàn)室診斷和藥敏試驗(yàn),為病羊的診斷與治療提供依據(jù)。

    1 材料

    (1)病料來源。泰州某養(yǎng)殖場2只湖羊。

    (2)主要試劑。血平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管 (杭州微生物)、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(寶生物工程有限公司)和大腸桿菌診斷血清(杭州微生物)等。

    2 方法

    (1)剖檢病變。剖檢可見肺淤血、壞死,心外膜增厚,肝臟腫大、壞死,腸道出血,其他組織器官無特征病變。

    (2)細(xì)菌分離培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取病變臟器內(nèi)部組織,在麥康凱平板劃線,放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)18小時(shí),觀察結(jié)果。

    (3)革蘭氏染色鑒定。挑取疑似菌落進(jìn)行固定,滴加結(jié)晶紫初染1分鐘、碘液1分鐘、乙醇脫色0.5分鐘、沙黃水溶液復(fù)染30秒,吸干,鏡檢[3]。

    (4)生化試驗(yàn)。菌株1和菌株2均屬于腸桿菌科,用腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管鑒定。

    (5)血清型鑒定。將菌株1和菌株2用大腸桿菌診斷血清做玻板凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

    (6)16S rRNA基因序列測定。將純化好的菌液煮沸法提取DNA作為PCR模板,用16SrDNA Bacterial PCR Kit試劑盒中的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物送去金斯瑞公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析。

    (7)藥敏試驗(yàn)。取純化好的菌液滅菌棉簽在LB培養(yǎng)基上涂抹均勻,再用滅菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中,經(jīng)18~24小時(shí)用尺測量抑菌圈直徑。

    3 結(jié)果

    (1)細(xì)菌形態(tài)。分別挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),分離到2種菌株。菌株1在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊、偏大的紅色菌落,在血培養(yǎng)基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、較大的灰白色菌落。菌株2與菌株1相似,顏色偏淡,形態(tài)較小。

    (2)革蘭氏染色結(jié)果。菌株1在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到粉紅色的直桿菌,菌體較大,兩端鈍圓,散在或成對(duì)。菌株2與1相似,形態(tài)較小。

    (3)生化試驗(yàn)結(jié)果。菌株1對(duì)照伯杰氏細(xì)菌手冊,鑒定結(jié)果該菌株為大腸桿菌。菌株2鑒定結(jié)果該菌株為肺炎克雷伯菌(見表1)。生化特性與楊紅軍等研究一致[4]。

    表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

    (4)血清型鑒定結(jié)果。將菌株1和菌株2分別進(jìn)行血清型鑒定,通過大腸桿菌診斷血清,玻板凝集試驗(yàn)確定菌株1是大腸桿菌,血清型是020。

    (5)16S rDNA序列測定。菌株2PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物條帶為1800bp(見圖1)。序列與肺炎克雷伯菌的序列同源性達(dá)到99%以上(見圖1)。

    圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖2 序列比對(duì)圖

    (6)藥敏試驗(yàn)結(jié)果。菌珠1和2分別選用24種藥物做藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明大腸桿菌對(duì)頭孢唑啉等13種藥物高敏,對(duì)頭孢氨芐等4種藥物中敏,對(duì)苯唑西林等7種藥物耐藥;肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢唑啉等8種藥物高敏,頭孢氨芐等4種藥物中敏,對(duì)紅霉素等12種藥物耐藥(見表2)。

    表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果(單位:mm)

    4 小結(jié)與討論

    (1)肺炎克雷伯菌是羊腸道中的一種常在菌,在飼養(yǎng)管理不善的養(yǎng)殖場,肺炎克雷伯菌病經(jīng)常發(fā)生,從而給養(yǎng)殖場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

    (2)在觀察疑似菌落時(shí)注意大腸桿菌,大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的顏色、形態(tài)相似,而且少數(shù)大腸桿菌對(duì)羊具有致病性。通過血清型鑒定,分離出大腸桿菌的血清型是020,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究,確定血清型020對(duì)羊沒有致病性[5],從而確認(rèn)肺炎克雷伯菌是致病菌,需要開展動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。

    (3)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均對(duì)喹諾酮類藥物高敏,用諾氟沙星對(duì)羊群進(jìn)行預(yù)防治療,使疫情得到了控制。在臨床用藥過程中,我們應(yīng)當(dāng)選擇敏感性高的藥物治療。

    [1]Shon AS,Bajwa RP,Russo TA, Hypervirulent(hypermucoiscous)Klebsiella pneumoniae:a new and dangerous breed.[J]Virulence.2013,4(2):107-118.肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48(2):1-2.

    [2]張智,李再新,曾光菊,李丙超,胡衛(wèi)東,趙志平,劉章琴,陳欲云.一株兔源耐藥性肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(9):1-5.

    [3]李超,王玉英,王冬冬,范丹丹,王平,紀(jì)鴻翔,尹燕博.引起幼貂大量死亡的肺炎克雷伯菌的分離和鑒定 [J].中國獸醫(yī)雜志,2015,11(51):1-4.

    [4]楊紅軍,陳海華,孫鳳青,王豪舉,彭遠(yuǎn)義,張建明.雞肺炎克雷伯菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志.2009,7(45):1-2.

    [5]黃青云.畜牧微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009,5:220-221.

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