紫外線消毒和異噻唑啉酮殺毒對鐵皮石斛破損蒴果育苗效果的影響

嚴榮斌，玉桂成，陳劍成，吳 俊，龐永容，黃麗丹

(玉林市林業(yè)科學研究所,廣西 玉林 537501)

紫外線消毒和異噻唑啉酮殺毒對鐵皮石斛破損蒴果育苗效果的影響

嚴榮斌，玉桂成，陳劍成，吳 俊，龐永容，黃麗丹

(玉林市林業(yè)科學研究所,廣西 玉林 537501)

對鐵皮石斛正常蒴果和破損蒴果進行常規(guī)消毒，破損蒴果紫外線0.5、1、1.5、2、3、10、24h消毒和紫外線1.0、1.5、2.0 h消毒、異噻唑啉酮10、15、20、30、40、50 mg·l-1濃度殺毒育苗試驗，破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100 %；試驗結(jié)果為，正常蒴果播種后20d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1 %，成活率為96.7 %；紫外線消毒時間0.5～24.0 h污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時間延長，成活率逐步下降；紫外線消毒0.5～24.0 h+異噻唑啉酮含量10～50 mg·l-1污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時間延長和異噻唑啉酮濃度升高，成活率逐步下降；異噻唑啉酮含量10 mg·l-1+紫外線消毒1.0 h成活率最高(89.6%)，是破損蒴果種子消毒較好條件，生產(chǎn)中也可選擇種子用紫外線燈消毒1～2h+異噻唑啉酮濃度15～40 mg·l-1作為抗菌劑。

鐵皮石斛；蒴果；紫外線消毒；異噻唑啉酮殺毒；育苗

鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)為蘭科多年生附生草本植物，具有重要的觀賞價值、藥用價值和食用價值[1]。目前，鐵皮石斛自然狀態(tài)下的無性分蘗繁殖和有性種子繁殖系數(shù)都很低，無法滿足工廠化育苗需求，只有通過組織培養(yǎng)的方法進行無性繁殖(如取根、莖、葉等器官組培繁殖)或是種子瓶播育苗，其中種子瓶播繁殖是目前工廠化育苗的最常用方式。鐵皮石斛種子瓶播育苗繁殖一般都是通過采收成熟的蒴果進行表面消毒后，取出果內(nèi)無菌種子播種在萌芽培養(yǎng)基內(nèi)生長成原球莖，原球莖長成1～3片小葉的小苗后，再通過移接到生根壯苗培養(yǎng)基進行壯苗和生根等步驟來組培擴繁。鐵皮石斛種子播種時要求蒴果外表無破損才能進行常規(guī)方法——液態(tài)消毒液消毒，而其為粉末狀且輕于水，破損后漂浮在消毒溶液上，按常規(guī)消毒方法無法從消毒液中取出大量種子、也無法完全清洗掉種子表面殘留的消毒液。本試驗探討篩選能夠大量高效處理鐵皮石斛粉末狀種子的方法，達到即快速消毒鐵皮石斛種子且不影響種子瓶播后正常生長。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

正常與破損的鐵皮石斛蒴果均為人工授粉所產(chǎn)，從廣西玉林市林科所鐵皮石斛大棚采集。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

(1)種子紫外線消毒試驗

設(shè)8個處理水平，即種子紫外線消毒時間設(shè)置為：0、0.5、1、1.5、2、3、10、24 h，對照2個，即CK1為完好蒴果常規(guī)消毒處理，接種在萌芽培養(yǎng)基；CK2為破損蒴果種子不采用紫外線消毒處理，直接接種到萌發(fā)培養(yǎng)基。每個處理3次重復(fù)。

紫外線燈消毒方法為將破損蒴果預(yù)處理、放入育苗容器，再將容器放置在實驗或生產(chǎn)用的無菌操作臺上，打開紫外燈按試驗設(shè)計時間進行消毒，風速調(diào)至最低速檔位。把實驗處理后的種子均勻撒播在萌發(fā)基質(zhì)上，瓶播育苗2～3周后，種子萌發(fā)成原球，統(tǒng)計種子萌發(fā)成活率。

(2)含異噻唑啉酮成分的育苗基質(zhì)消毒試驗

在種子紫外線消毒試驗即試驗一初步結(jié)論——單一使用紫外線消毒種子效果并不理想的基礎(chǔ)上，設(shè)計試驗二；試驗二設(shè)2個因素，即種子紫外線消毒時間(因素1)和不同異噻唑啉酮濃度(因素2)，因素1設(shè)3個水平，即種子紫外線消毒中效果較好的3個消毒時間——1.0、1.5、2.0 h，因素2設(shè)6個處理水平 ，即異噻唑啉酮濃度為10、15、20、30、40、50 mg·l-1，對照為破損蒴果種子不采用紫外線消毒處理，接種含異噻唑啉酮萌發(fā)培養(yǎng)基；每個處理3次重復(fù)。

(3)不同消毒處理對種苗生長的影響

待試驗(1)和試驗(2)所培育的幼苗生長約3個月即原球莖已長成合適移接的小苗時(CK2、CK3沒有育出幼苗)，轉(zhuǎn)移到專門的生根壯苗培養(yǎng)基[2]內(nèi)生長，再經(jīng)過2個多月的生長，測定其植株高度、根長、根數(shù)等。

1.2.2 蒴果預(yù)處理

(1)破損蒴果

用棉花團蘸取75%乙醇擦拭蒴果表面(避開蒴果開裂處)，待乙醇自然揮發(fā)后，打開蒴果，取粉末狀種子均勻地鋪開在育苗容器內(nèi)。

(2)正常蒴果

使用75 %乙醇消毒1分鐘洗凈再用0.1 %氯化汞消毒30 min后用無菌水洗凈五遍，剖開蒴果，取出粉狀種子接種不含抗菌成分的種子萌發(fā)培養(yǎng)基。

1.2.3 發(fā)芽培養(yǎng)條件 種子萌發(fā)培養(yǎng)基：MS+NAA0.5 mg·l-1+蔗糖30 g·l-1+瓊脂粉7.2 g·l-1；培養(yǎng)溫度控制在20～27℃，光照培養(yǎng)時間：12h·d-1，光照強度：1000～2000 lux。

1.2.4 污染率及種子發(fā)芽率調(diào)查 鐵皮石斛種子萌發(fā)后，經(jīng)過20天左右萌發(fā)生長成原球莖，統(tǒng)計種子的成活率和污染率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒴果狀況對種子發(fā)芽的影響

試驗結(jié)果為，正常蒴果播種后20 d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1%，成活率為96.7%；破損蒴果種子進行常規(guī)消毒時，漂浮在消毒溶液表面，取出十分困難，故不宜采用常規(guī)消毒；破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100%。表明鐵皮石斛正常蒴果經(jīng)過常規(guī)消毒就可以在適宜培養(yǎng)條件下播種育苗，破損的蒴果采取常規(guī)方法不能消毒，且不經(jīng)紫外線消毒處理也不能正常進行播種育苗。

2.2 紫外線消毒對破損種子發(fā)芽的影響

由表1可知，隨著紫外線消毒時間的延長，鐵皮石斛破損種子污染率逐步下降，同時，紫外線消毒時間為0.5 h時，成活率最高，為95.6%，之后隨著消毒時間延長，成活率逐步下降，表明紫外線不僅對鐵皮石斛破損種子表面等處的致病微生物有毒殺作用，也會對種子的活力造成一定傷害。

表1 紫外線消毒時間效果

2.3基質(zhì)不同異噻唑啉酮濃度對破損種子發(fā)芽的影響

表2顯示，當紫外線消毒時間為1.0～2.0 h、異噻唑啉酮濃度為10～50 mg·l-1時，破損的鐵皮石斛種子在萌發(fā)培養(yǎng)基上的污染率為0～23.1%，種子成活率為3.8%～89.6%，且當紫外線消毒時間一定隨異噻唑啉酮濃度的增加，或當異噻唑啉酮濃度一定隨紫外線消毒時間的延長，污染率和成活率都逐步降低；只有采取紫外線消毒和異噻唑啉酮消毒結(jié)合的條件下，破損鐵皮石斛種子才能取得較好的育苗結(jié)果；異噻唑啉酮濃度為10 mg·l-1、紫外線消毒1.0h時，種子成活率最高，是破損鐵皮石斛種子的最適宜育苗環(huán)境。

表2 紫外線消毒的種子接種在含不同異噻唑啉酮含量的培養(yǎng)基效果

2.4 不同消毒方式對幼苗生長的影響

試驗結(jié)果顯示，試驗(1)和試驗(2)所培育的幼苗經(jīng)2個月左右生長，植株高度為3～5 cm左右，生根量為4～6根，根長2～3 cm,不同處理之間差異不明顯，說明紫外線消毒和加入異噻唑啉酮對鐵皮石斛種子發(fā)育成原球莖的生長沒有影響。

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果為正常蒴果播種后20 d萌發(fā)成原球莖，種子污染率為6.1%，成活率為96.7%；破損蒴果種子不經(jīng)紫外線消毒處理，直接在種子萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)，污染率為100%。鐵皮石斛正常蒴果經(jīng)過常規(guī)消毒就可以在適宜培養(yǎng)條件下播種育苗，破損的蒴果采取常規(guī)方法不能消毒且不經(jīng)紫外線消毒處理也不能正常播種育苗。紫外線消毒0.5～24.0 h+異噻唑啉酮含量10～50 mg·l-1污染率為1.6%～97.2%，成活率為0～89.6%，隨著消毒時間延長，成活率逐步下降；異噻唑啉酮含量10 mg·l-1、紫外線消毒1.0 h成活率最高(89.6%)，是破損蒴果種子消毒較好條件，生產(chǎn)中可以選擇種子用紫外線燈消毒1～2 h、異噻唑啉酮濃度15～40 mg·l-1作為抗菌劑，效果也不錯。不同消毒處理培育的鐵皮石斛幼苗在植株高度和根系數(shù)量及長度方面無顯著差異。

紫外線對細菌、病毒的去氧核糖核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)具有強大破壞力，能使細菌、病毒喪失生存力及繁殖力進而消滅細菌、病毒，達到消毒滅菌[3,4]。異噻唑啉酮通過斷開細菌蛋白質(zhì)的鍵而起殺生作用，對常見細菌、真菌、藻類等具有很強的抑制和殺滅作用[5]，具有高溫易降解，低毒、低殘留等特點[6]，紫外線消毒與異噻唑啉酮殺毒兩者結(jié)合使用才能達到滿足生產(chǎn)要求。1個鐵皮石斛蒴果內(nèi)種子多達10萬以上，如果容器不夠大，可以分1～2次消毒，如果蒴果破損嚴重，可以省去酒精擦拭蒴果表面的步驟，并同時在一個容器中消毒幾顆破損嚴重的蒴果。

[1] 吉占和.中國植物志[M].北京.科學出版社,19995.

[2] 梁鈞淞,玉桂成,陳劍成，等.鐵皮石斛的雜交育種方法：中國, CN102388797A[P].2012-03-28.

[3] 耿文奎,王樹聲.實用消毒技術(shù)[M].南寧：廣西科學出版社,1996.

[4] 張辰,張欣,呂東明，等.紫外線消毒的理論研究[J].給水排水,2004,30(1):21-24.

[5] 丁曉京.新型二甲基異噻唑啉酮MIT殺菌劑[J].日用化學品科學，2004,27(5):40-41.

[6] 張佩玉,喻秀,陳智勇等.新型異噻唑啉酮化合物的合成和抑菌活性研究[J].有機化學，2005(25):1142-1146.

[7] 林英學,李惠運,官宇.紫外線空氣消毒時間和消毒效果變量關(guān)系的實驗研究[J].實用護理雜志,2003,19(10):3.

EffectofUVDisinfectionandIsothiazoloneinDendrobiumcandidumCapsuleonDamagedTissueCulture

YAN Rong-bin, YU Gui-chen, CHEN Jian-cheng,WU Jun, PANG Yong-rong, HUANG Li-dan

(YulinForestryResearchInstitute,Yulin,Shaanxi537501)

Before culture,Dendrobiumcandidumcapsules intact or broken were pre-treated for disinfection with ultraviolet light for 0.5h, 1h, 1.5h, 2.0h,3.0h, 10h, and 24h, or 1.0h,1.5h, and 2.0h, and with isothiazolone at 10,15,20,30,40 and 50 mg-1, respectively.The contrast is without pretreatment of ultraviolet light. The result showed that the seeds without pretreatment for culture, the infection rate were 100%. Normal seeds could germinate 20days after sowing, with infection rate at 6.1% and survival rate at 96.7%. For the seeds with UV treatment from 0.5 to 24h, infection rates ranged from 1.6% to 97.2% and survival rate from 0 to 89.6%, indicating a trend of lower survival rate with longer treatments. With UV treatments 0 to 24h plus use of isothiazolone concentrations ranging from 10 mg·l-1, infection rates ranged from 1.6% to 97.2% and survival rates from 0 to 89.6%, indicating a trend of lower survival rates with longer UV treatment and higher concentrations of isothiazolone. The optimum treatments for broken seeds ofDendrobiumcandidumwere isothiazolone at 10 mg·l-1and UV treatment for 1.0h, which could have a survival rate 89.6%.In practice, treatment of seeds can be UV for 1 to 2h plus isothiazolone at concentrations from 15 to 40 mg·l-1.

UV disinfection; isothiazolone;Dendrobiumcandidum; damaged; capsule; tissue culture

2017-04-19

嚴榮斌(1985-)，男，助理工程師，廣西梧州人，主要從事林木組織培養(yǎng)和林木遺傳育種研究。

Q813.1

A

1001-2117(2017)04-0001-03