誘殺植物香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲解毒酶和乙酰膽堿酯酶的影響

魯艷輝, 梁 齊, 鄭許松, 王國榮, 呂仲賢*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所, 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地, 杭州 310021;2. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)局, 杭州 211203)

誘殺植物香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲解毒酶和乙酰膽堿酯酶的影響

魯艷輝1, 梁 齊1, 鄭許松1, 王國榮2, 呂仲賢1*

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所, 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地, 杭州 310021;2. 浙江省杭州市蕭山區(qū)農(nóng)業(yè)局, 杭州 211203)

香根草能夠有效誘集水稻害蟲稻蛀莖夜蛾Sesamiainferens雌成蟲在其上產(chǎn)卵,但孵化出的幼蟲在香根草上不能完成生活史。為了初步明確香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲生理生化水平的影響,本研究分析測定了取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲體內解毒酶和乙酰膽堿酯酶AChE活性的變化。結果表明:與取食水稻的幼蟲相比,取食香根草后幼蟲解毒酶谷胱甘肽硫轉移酶GSTs和AChE活性顯著提高。其他兩種解毒酶,羧酸酯酶CarE和細胞色素P450酶活性無顯著差異。取食香根草后,4齡幼蟲GSTs比活力約為取食水稻的2.1倍;2齡幼蟲AChE比活力約為取食水稻的2.9倍。本研究結果表明香根草可能存在某些有毒活性物質或者次生代謝物質,誘導了稻蛀莖夜蛾體內GSTs和AChE的活性,這可能是稻蛀莖夜蛾取食香根草后的應急防御機制之一。此研究結果為深入闡明香根草在生理、生化水平上對稻蛀莖夜蛾幼蟲的影響奠定了基礎,為開發(fā)以香根草為基礎的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術提供了理論依據(jù)。

稻蛀莖夜蛾; 香根草; 解毒酶; 乙酰膽堿酯酶; 誘殺植物

稻蛀莖夜蛾Sesamiainferens(Walker),舊稱大螟, 屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是一種鉆蛀性害蟲,寄主范圍廣,能夠取食水稻、茭白、高粱、玉米、甘蔗等數(shù)十種禾本科植物[1]。長久以來,稻田稻蛀莖夜蛾的防治仍依靠化學農(nóng)藥。但是,化學農(nóng)藥的不合理使用,導致其抗藥性不斷提高,加大了稻蛀莖夜蛾的猖獗危害。同時,也帶來了農(nóng)藥殘留超標、環(huán)境污染等問題。目前,水稻害蟲的綠色防控技術已經(jīng)成為當前的研究熱點,比如利用禾本科香根草Vetiveriazizanioides(Linn.)Nash防治水稻螟蟲[2]。香根草對稻蛀莖夜蛾具有較強的引誘作用,可引誘稻蛀莖夜蛾雌成蟲在其上產(chǎn)卵,但孵化出的幼蟲取食香根草后生長發(fā)育緩慢進而不能完成生活史,從而降低了稻蛀莖夜蛾種群數(shù)量,減少了其對水稻的危害[3]。

在植物與植食性昆蟲的協(xié)同進化過程中,植物產(chǎn)生化學防御物質抵御害蟲侵害,害蟲也誘導其體內相關酶系來克服植物中的潛在毒性[4]。植物次生代謝產(chǎn)物是影響昆蟲與植物相互作用的重要因素,表現(xiàn)為影響昆蟲的取食行為及其對食物的利用[5]。許多植物次生物質對昆蟲的解毒酶系具有誘導作用[6]。昆蟲體內重要的解毒酶系有羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)、細胞色素P450和谷胱甘肽硫轉移酶(glutathioneS-transferase, GSTs)等[7],解毒酶系的改變是昆蟲取食適應性的重要表現(xiàn)形式之一[8]。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)是有機磷和氨基甲酸酯類藥劑的作用靶標,因此常被定義為靶標酶。目前,已有許多關于取食不同寄主植物影響昆蟲解毒酶和AChE活性變化的報道[5, 9-12]。但是取食香根草后對稻蛀莖夜蛾解毒酶系影響的研究尚未見報道,本研究通過測定取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲體內解毒酶和AChE活性的變化,分析香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響,以期為更好地建立以香根草為基礎的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試植物

水稻品種‘浙優(yōu)12號’購自浙江省農(nóng)科種業(yè)有限公司。播種于溫室塑料槽內,約30 d后移栽至直徑為12 cm的塑料盆中,至45 d分蘗期時剪取莖稈用于稻蛀莖夜蛾幼蟲的飼喂試驗。

香根草種苗購自深圳市鑫淼森園林草坪有限公司。將香根草種苗種于溫室,以分蘗苗作為繁殖體,待香根草分蘗較多時剪取莖稈用于稻蛀莖夜蛾幼蟲的飼喂試驗。

1.2 供試昆蟲

稻蛀莖夜蛾種群于2014年5月采自杭州市蕭山區(qū)義橋鎮(zhèn)(30°04′ N,120°12′ E)水稻田,室內建立并維持種群,幼蟲采用人工飼料飼養(yǎng),飼料配方由中國水稻研究所提供[13],置于溫度(27±2)℃,相對濕度(70±5)%,光周期L∥D=16 h∥8 h的智能人工氣候室內飼養(yǎng)。待稻蛀莖夜蛾化蛹后將蛹收集起來,放置在干凈的養(yǎng)蟲籠中,保濕,讓其繼續(xù)發(fā)育羽化,對羽化后的成蟲以10%的蜂蜜水提供營養(yǎng)。

選取初孵幼蟲用于水稻(對照)和香根草的飼喂試驗。當水稻飼喂的幼蟲達1、2、3、4齡時,對水稻和香根草飼喂的幼蟲分別進行取樣,幼蟲饑餓3 h后,在液氮中速凍并立即轉至-80℃冰箱中保存,供后續(xù)酶活性測定試驗用。試驗中每處理各重復3次。

1.3 取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲體內解毒酶活性測定

CarE活性測定:參照Lu等[7]的方法稍加改進。每個樣品稱取100 mg,加入pH 7.0的PBS 1 mL,充分勻漿后,在4℃,12 000×g條件下離心15 min,取上清液40 μL加入酶標板中,每孔加入100 μL底物與顯色劑的混合液(含0.2 mol/L、pH6.0的PBS,10 mmol/Lα-乙酸萘酯和1 mmol/L固藍RR鹽,混合后過濾)。然后加入5 μL酶液和45 μL 0.1 mol/L、pH 7.6的PBS,利用動力學方法測定10 min內OD450值變化,以反應速度mol/(min·mg)表示酶活力。

GSTs活性測定:參照Habig等[14]的方法稍加改進。用0.1 mol/L,pH 6.5的PBS制備酶液,在96孔酶標板中每孔依次加入45 μL PBS、5 μL酶液(制備方法同蛋白酶)、50 μL 1.2 mmol/L的1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和50 μL 6 mmol/L的還原型谷胱甘肽(GSH)。利用動力學方法測定10 min內OD340值變化,以反應速度nmol/(min·mg)表示酶活力。

細胞色素P450酶活性測定:參考Rose等[15]的方法稍加改進。利用0.1 mol/L、pH 7.6、含1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/L苯基硫,1 mmol/L PMSF的PBS制備酶液。在96孔酶標板中依次加入2 μmol/L對硝基苯甲醚(溶解于0.1 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液)50 μL,9.6 mmol/L的NADPH 5 μL和45 μL制備好的酶液。利用動力學方法測定10 min內OD405值變化,以反應速度nmol/(min·mg)表示酶活力。

1.4 取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲體內AChE活性測定

AChE活性測定:參照Ellman[16]的方法并稍加改進。將稻蛀莖夜蛾幼蟲利用0.1 mol/L,pH 7.5的PBS充分勻漿,勻漿液于4℃,12 000×g條件下離心15 min,取50 μL酶液加入酶標板中,依次加入100 μL碘化硫代乙酰膽堿ATChI(0.5 mmol/L)、100 μL DTNB溶液(20 mmol/L)混合后,利用酶標儀測OD405。以反應速度mol/(min·mg)表示酶活力。

1.5 蛋白含量測定

利用Bradford[17]的考馬斯亮藍G-250法測定酶提取液中的蛋白含量,用于酶活性計算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,并采用T測驗進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 稻蛀莖夜蛾幼蟲取食香根草后體內解毒酶活性

稻蛀莖夜蛾在取食水稻和香根草后,1～4齡幼蟲體內CarE比活力無顯著差異(表1)。

表1取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內CarE比活力1)

Table1CarEspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantCarE比活力/nmol·min-1·mg-1 CarEspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(0．082±0．023)a(0．093±0．022)a(0．118±0．017)a(0．113±0．011)a香根草Vetiver(0．092±0．009)a(0．177±0．021)a(0．186±0．011)a(0．257±0．047)a

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤,同列數(shù)據(jù)后相同字母表示在0.05水平差異不顯著。下同。

Data in the table are mean±SE; The same letters in the same column indicate no significant difference at 0.05 level. The same below.

取食香根草后的2～4齡稻蛀莖夜蛾幼蟲體內GSTs比活力顯著高于取食水稻的,且在4齡時兩者差異最顯著,取食香根草的幼蟲GSTs比活力約為取食水稻的2.1倍(表2)。

表2取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內GSTs比活力

Table2GSTsspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantGSTs比活力/nmol·min-1·mg-1 GSTsspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(21．348±9．367)a(23．988±11．336)b(39．177±7．081)b(33．850±9．294)b香根草Vetiver(32．799±15．480)a(48．343±23．327)a(53．721±23．193)a(71．487±27．352)a

稻蛀莖夜蛾在取食水稻和香根草后,1～4齡幼蟲體內細胞色素P450酶的比活力無顯著差異(表3)。

表3取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內P450酶比活力

Table3SpecificactivityofP450enzymesofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantP450酶比活力/nmol·min-1·mg-1 P450enzymespecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinstar3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(29．934±11．564)a(47．751±6．605)a(47．697±1．800)a(85．879±17．399)a香根草Vetiver(57．393±3．153)a(58．271±1．157)a(56．222±5．785)a(88．326±5．736)a

2.2 稻蛀莖夜蛾幼蟲取食香根草后體內AChE活性

取食香根草后的2～4齡稻蛀莖夜蛾幼蟲體內AChE比活力顯著高于取食水稻的,且在2齡時兩者差異最顯著,取食香根草約為取食水稻上AChE比活力的2.9倍(表4)。

表4取食水稻和香根草后稻蛀莖夜蛾體內AChE比活力

Table4AChEspecificactivityofSesamiainferensafterfeedingonriceandvetiver

植物PlantAChE比活力/nmol·min-1·mg-1 AChEspecificactivity1齡1stinstar2齡2ndinster3齡3rdinstar4齡4thinstar水稻Rice(14．204±0．943)b(44．767±6．130)b(65．133±11．708)b(103．235±8．251)b香根草Vetiver(21．142±2．237)a(128．958±7．845)a(119．910±2．777)a(187．488±34．821)a

3 討論

香根草作為誘殺植物防治水稻螟蟲已成為稻螟綠色防控的重要措施之一,具有很大的開發(fā)潛力[2, 18-20]。筆者前期研究表明,二化螟Chilosuppressalis幼蟲取食香根草后體內CarE和細胞色素P450酶的活性顯著下降[12]。為了進一步明確香根草在生理、生化水平上對稻蛀莖夜蛾幼蟲的影響,我們測定了取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲體內3種重要解毒酶和AChE酶的活性變化。

昆蟲取食寄主植物后,解毒酶系統(tǒng)會發(fā)生明顯改變,包括酶的誘導作用等[5-6]。寄主植物中的毒素或次生物質在昆蟲體內的降解主要依靠解毒酶,昆蟲體內的解毒酶系主要是以GSTs、CarE、細胞色素P450酶為主,這些酶系對維持昆蟲體內正常的生理代謝功能和分解外源毒物都起著重要作用[21]。本文研究結果表明,取食香根草后稻蛀莖夜蛾幼蟲GSTs活性顯著升高,說明GSTs在稻蛀莖夜蛾對香根草的解毒代謝中發(fā)揮著重要作用。關于寄主植物誘導解毒酶活性的研究很多,呂朝軍等[22]研究發(fā)現(xiàn):取食蘋果樹的蘋果黃蚜Aphiscitricola的CarE活性顯著高于取食梨樹、李樹和杏樹的蘋果黃蚜的CarE活性,推測這可能與寄主植物體內次生代謝物的種類不同相關。林佳和謝佳燕發(fā)現(xiàn)取食鵝觀草的禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi與取食小麥和燕麥的禾谷縊管蚜酯酶活性存在顯著差異[4]。安志蘭等發(fā)現(xiàn)取食番茄、一品紅、棉花和茄子的煙粉虱BemisiatabaciCarE、GSTs等解毒酶均存在顯著差異[11]。此外,李飛等研究發(fā)現(xiàn):害蟲能夠通過改變自身的解毒酶或AChE的特性等方式不斷適應寄主植物體內產(chǎn)生的次生代謝物[23]。稻蛀莖夜蛾取食香根草后,AChE活性顯著上升,可能是稻蛀莖夜蛾取食香根草后應急防御機制之一。也有研究表明,取食茄子的煙粉虱AChE活性分布與取食番茄的明顯不同[11];取食馬鈴薯、玉米、藜和大豆后對草地螟Loxostegesticticalis中腸AChE活性影響顯著[24];番茄、四季豆、苦瓜等寄主植物對南美斑潛蠅LiriomyzahuidobrensisAChE活性影響顯著[10]。

解毒酶和AChE是昆蟲體內重要的生化物質,取食不同寄主植物能夠改變昆蟲解毒酶或AChE活性。由于目前并無香根草內殺蟲活性物質鑒定及香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲致死作用機制的相關報道,我們推測可能是香根草內的次生物質或者有毒活性成分誘導或激活了稻蛀莖夜蛾體內與解毒代謝相關酶的表達,這也是昆蟲對寄主植物的應急防御機制之一,但是這種現(xiàn)象是否能引起稻蛀莖夜蛾對香根草的完全適應,使其成為替代寄主,或者是否影響稻蛀莖夜蛾的耐藥性仍有待進一步研究探討。此研究結果為深入闡明香根草對稻蛀莖夜蛾幼蟲生理生化水平的影響,為開發(fā)以香根草為基礎的稻蛀莖夜蛾綠色防控新技術提供理論依據(jù)。

[1] 趙鈞,付文曦,韓召軍.大螟對7種殺蟲劑的抗藥性監(jiān)測及相對敏感基線驗證[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2016,39(1):84-88.

[2] Lu Zhongxian, Zhu Pingyang, Gurr G M, et al. Rice pest management by ecological engineering: a pioneering attempt in China [M]∥Heong K L, Cheng Jiaan, Escalada M M.Rice planthoppers: ecology, management, socio-economics and policy.Springer,2015:161-178.

[3] 梁齊, 魯艷輝, 王國榮, 等. 寄主植物噴藥對大螟產(chǎn)卵選擇性的影響[J]. 植物保護學報, 2017, 44(1):39-44.

[4] 林佳, 謝佳燕. 不同植物對禾谷縊管蚜酯酶和乙酰膽堿酯酶活性的誘導作用[J]. 植物保護, 2014, 40(4): 115-117.

[5] 高希武. 寄主植物對棉蚜羧酸酯酶活性的影響[J]. 昆蟲學報, 1992, 35(3): 267-272.

[6] Riskallah M R, Dauterman W C, Hodgson E.Host plant induction of microsomal monooxygenase activity in relation to diazinon metabolism and toxicity in larvae of the tobacco budwormHeliothisvirescens(F.)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1986, 25(2): 233-247.

[7] Lu Y H, Gao X W. Multiple mechanisms responsible for differential susceptibilities ofSitobionavenae(Fabricius) andRhopalosiphumpadi(Linnaeus) to pirimicarb [J]. Bulletin of Entomological Research, 2009, 99(6): 611-617.

[8] Lindroth R L. Host plant alteration of detoxification activity inPapilioglaucus[J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1989, 50(11): 29-35.

[9] 李騰武, 宗靜, 高希武, 等. 寄主植物對桃蚜羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的誘導作用[J]. 植物保護, 1997, 23(2): 14-16.

[10] 魏秋學, 何玉仙, 楊秀娟, 等. 寄主植物對南美斑潛蠅羧酸酯酶及乙酰膽堿酯酶活力的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 2004, 26(3): 345-347.

[11] 安志蘭,褚棟,郭篤發(fā),等.寄主植物對B型煙粉虱(Bemisiatabaci)幾種主要解毒酶活性的影響[J].生態(tài)學報,2008,28(4): 1536-1543.

[12] 魯艷輝, 高廣春, 鄭許松, 等. 誘集植物香根草對二化螟幼蟲致死的作用機制[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2017, 50(3): 486-495.

[13] 傅強, 袁哲明, 戴長庚, 等. 一種大螟的半人工飼料及制備方法: CN103110009A [P].2013-05-22.

[14] Habig W H, Pabst J, Jackoby W B.GlutathioneS-transferases: the first enzymatic step in mercapturic acid formation [J]. Journal of Biological Chemistry, 1974, 249(22): 7130-7139.

[15] Rose R L, Barbhaiya L, Roe R M, et al. Cytochrome P450-associated insecticide resistance and the development of biochemical diagnostic assays inHeliothisvirescens[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1995, 51(3): 178-191.

[16] Ellman G L, Courtey D, Andres V, et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterease activity [J]. Biochemical Pharmacology,1961, 7(2): 88-95.

[17] Bradford M M A.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 25(1):248-256.

[18] 夏岳章, 孫文岳. 香根草對水稻螟蟲的誘殺及應用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學, 2012(12): 1693-1695, 1698.

[19] 趙中華, 楊普云. 2011年全國農(nóng)作物病蟲害綠色防控工作進展[J]. 中國植保導刊, 2012, 32(8): 17-19.

[20] 陳桂華, 朱平陽, 鄭許松, 等. 應用生態(tài)工程控制水稻害蟲技術在金華的實踐[J]. 中國植保導刊, 2016, 36(1): 31-36.

[21] 陳長琨. 昆蟲生理生化實驗[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1993.

[22] 呂朝軍,韓巨才,劉慧平,等.寄主植物對蘋果黃蚜藥劑敏感性及解毒酶活性的影響[J].植物保護學報,2007,34(5):534-538.

[23] 李飛, 韓召軍, 吳智鋒, 等. 我國棉蚜抗藥性研究現(xiàn)狀[J]. 棉花學報, 2001, 13(2): 121-124.

[24] 尹姣, 馮紅林, 李克斌, 等. 寄主植物對草地螟中腸解毒酶及保護性酶活性的影響[J]. 植物保護, 2012, 38(1): 35-39.

(責任編輯： 田 喆)

EffectsofthevetivergrassVetiveriazizanioidesontheactivitiesofdetoxificationenzymesandacetylcholinesteraseinthepinkstemborerSesamiainferenslarvae

Lu Yanhui1, Liang Qi1, Zheng Xusong1, Wang Guorong2, Lü Zhongxian1

(1.StateKeyLaboratoryandBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl,InstituteofPlantProtectionandMicrobiology,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China; 2.XiaoshanAgriculturalBureau,Hangzhou,ZheijiangProvince,Hangzhou211203,China)

The vetiver grassVetiveriazizanioidescould effectively attract female adults ofSesamiainferensto lay eggs, while the offspring larvae could not complete their life cycles after feeding on vetiver. Aimed to preliminarily clear the physiological and biochemical effect of vetiver against the larvae ofS.inferens, we determined the activities of the detoxification enzymes and acetylcholinesterase (AChE) ofS.inferenslarvae after feeding on vetiver and rice. The results showed that, compared with the larvae fed on rice, the activities of detoxification enzyme glutathioneS-transferase (GSTs) and AChE were significantly increased in the larvae fed on vetiver. However, there was no significant difference in carboxylesterase (CarE) and cytochrome P450s activities. The GSTs activity in the fourth-instar larvae and the AChE activity in the second-instar larvae fed on vetiver were 2.1-, 2.9-fold higher than those in the larvae fed on rice. These results indicated that vetiver may have some active substances or secondary metabolite substances that induced GSTs and CarE activities in the larvae fed on vetiver, which may be one of the mechanisms for emergency adaptation ofS.inferensagainst vetiver. This study lays the foundation for further elucidating the physiological and biochemical effect of vetiver against the larvae ofS.inferens, and provides a theoretical basis for the development of sustainable control technology forS.inferensbased on the trap plant vetiver in rice ecosystem.

Sesamiainferens;Vetiveriazizanioides; detoxification enzyme; acetylcholinesterase; trap plant

2017-02-24

2017-05-02

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0200800)；重點實驗室培育基地(2010DS700124-ZZ1601)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303017)

* 通信作者 E-mail: luzxmh@163.com

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.020