針刺對SAMP8小鼠海馬Flotillin-1、NEP及Aβ42表達的影響

李廣誠,龍聰,朱宏,董克禮,任丹,梁梅亭,李雅悅

(中南大學湘雅三醫(yī)院,長沙 410013)

針刺對SAMP8小鼠海馬Flotillin-1、NEP及Aβ42表達的影響

李廣誠,龍聰,朱宏,董克禮,任丹,梁梅亭,李雅悅

(中南大學湘雅三醫(yī)院,長沙 410013)

目的探討針刺對阿爾茨海默病模型小鼠SAMP8的行為學影響及其作用機制。方法將60只6月齡雄性SAMP8小鼠隨機分為針刺治療組、模型對照組和非穴位對照組,每組20只,另備同月齡雄性SAMR1小鼠20只作為正常對照組。針刺治療組采用針刺腎俞、百會、血海、膈俞進行干預。8星期后,采用Morris水迷宮對各組小鼠的行為學進行檢測,同時采用western blot檢測小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP以及Aβ42表達情況。結(jié)果Morris水迷宮實驗中,與模型對照組比較,針刺治療組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05),其停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數(shù)增加(P＜0.05);與模型對照組比較,非穴位對照組小鼠的逃避潛伏期無明顯差別(P＞0.05),其停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數(shù)也無明顯差別(P＞0.05)。Flotillin-1在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,Flotillin-1的表達水平無明顯差別(P＞0.05);NEP在針刺治療組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,NEP的表達水平無明顯差別(P＞0.05);Aβ42在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),而在非穴位對照組與模型對照組之間,Aβ42的表達水平無明顯差別(P＞0.05)。結(jié)論針刺能夠明顯改善AD模型小鼠SAMP8的學習記憶能力,降低SAMP8小鼠海馬Flotillin-1含量及上調(diào)NEP的表達,從而減少Aβ42表達,減輕神經(jīng)毒性,發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

針刺療法;阿爾茨海默病;SAMP8;小鼠;癡呆

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是發(fā)生于老年和老年前期、以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。其主要表現(xiàn)為記憶障礙、失語、失用、失認等改變。AD是老年期最常見的癡呆類型,占老年期癡呆的50%～70%。AD典型病理改變是腦神經(jīng)炎性斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元減少及顆粒空泡變性等。隨著我國快速的人口老齡化進程,AD已然成為一個不可回避的公共衛(wèi)生問題。

Aβ級聯(lián)學說是 AD病因機制中學界認可程度最高的發(fā)病假說。它認為Aβ啟動了AD的發(fā)病過程,Aβ的生成過多、降解減少及細胞外Aβ沉積是AD發(fā)病最原始、最重要的病因,在 AD發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Flotillin-1與Aβ的生成密切相關(guān),可以為APP生成Aβ提供工作平臺從而促進 Aβ的產(chǎn)生。中性內(nèi)肽酶(neprilysin, NEP)是體內(nèi)催化Aβ降解的關(guān)鍵酶,是調(diào)節(jié)大腦Aβ水平的重要因素,NEP可以增加Aβ的降解。因此,對Flotillin-1、NEP的表達進行調(diào)節(jié)會影響Aβ的代謝過程。

目前AD尚沒有有效的治療策略[1]。針刺療法是中醫(yī)學的精髓之一,具有雙向調(diào)節(jié)及良性調(diào)節(jié)的特點,且操作簡便、無毒副反應,近年來針刺在AD治療中的臨床運用,顯示了十分理想的前景[2]。“補腎活血”針刺法是本課題組臨床治療阿爾茨海默病的常用方法之一,在前期研究中,筆者發(fā)現(xiàn)“補腎活血”針刺法能夠改善AD患者的認知功能,降低AD患者體內(nèi)異構(gòu)前列腺素的水平,減輕患者體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)[3],同時筆者也在動物實驗中發(fā)現(xiàn)“補腎活血”針刺法能夠改善AD模型小鼠(senescence accelerated mouse P8, SAMP8)的學習記憶能力,其作用機制可能涉及抗氧化應激,抑制AChE活性,調(diào)節(jié) Ach代謝,改善膽堿能系統(tǒng)功能等方面[4-7]。本研究旨在觀察針刺對AD模型小鼠SAMP8海馬Flotillin-1、NEP以及Aβ42表達的影響,從Aβ代謝角度闡釋針刺對阿爾茨海默病的治療機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡雄性AD模型小鼠SAMP8共60只,同齡雄性正常老化小鼠SAMR1共20只,均由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供(實驗動物質(zhì)量合格證NO0001353),小鼠體重為(24±3.5)g。

1.2 試劑與儀器

甘氨酸、Tris、SDS、Tween-20(武漢天源慧達生物科技有限公司);Na2HPO3·12H2O、NaH2PO3·2H2O、NaCl、KCl(上海國藥集團化學試劑有限公司);BPB(上海三愛思試劑有限公司);甘油(天津市化學試劑三廠);2-ME、無水甲醇(上海振興化工一廠);PVDF膜(德國Milipore公司);顯影底物(美國Thermo公司)。

Morris水迷宮(中南大學湘雅醫(yī)學院神經(jīng)生物中心);電泳儀(北京六一儀器廠);電泳槽;轉(zhuǎn)移槽;低溫高速離心機。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

將60只6月齡雄性SAMP8小鼠隨機分為針刺治療組、SAMP8模型對照組及SAMP8非穴位對照組,每組20只。另備20只6月齡雄性SAMR1小鼠作為正常對照組。所有小鼠均喂養(yǎng)于層流室,溫度為 18℃～22℃,濕度為55%～58%,飲用水及所食飼料均高溫蒸汽滅菌。

針刺治療組選取百會、血海、腎俞、膈俞。百會向后平刺 3～5 mm,血海、腎俞直刺 2～3 mm,膈俞以80°角斜向上刺2～3 mm,其中血海、腎俞、膈俞先刺激左側(cè)穴位,次日再刺激右側(cè),交替進行。小鼠穴位定位以及針刺深度均參照《實驗針灸學》[8]。進針后,補瀉手法參考石學敏院士的針刺手法量學標準進行[9],血海、膈俞施捻轉(zhuǎn)瀉法,施針幅度為180°～360°,施針頻率為50～60次/min;腎俞、百會施捻轉(zhuǎn)補法,施針幅度 60°～90°,施針頻率為 120～150次/min,運針1 min,留針10 min。

SAMP8非穴對照組取雙側(cè)肋下固定非經(jīng)非穴點,用平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法進行刺激,施針幅度 90°,施針頻率為90次/min,運針1 min,留針10 min。

SAMP8模型對照組及SAMR1正常對照組小鼠進行與以上兩組相同時間程度的捉抓刺激。

各組每日做相應處理1次,第7天暫停1次,連續(xù)干預8星期。

1.3.2 行為學測試

在治療結(jié)束后的第1天,各組小鼠開始在Morris水迷宮中進行行為學測試。前5 d進行隱蔽平臺試驗,最后1 d進行空間探索試驗。

1.3.3 Western blot步驟

行為學結(jié)束后將小鼠迅速斷頭處死,取出完整腦組織,用冷生理鹽水沖洗后置于冰盤上剝離腦膜,取出海馬組織,將小鼠海馬組織,按照1:2的比例加入全細胞裂解液,經(jīng)勻漿、超聲破碎后,用Bradford法進行蛋白定量,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)NC膜。洗滌后膜和檢測的一抗(1:500)進行結(jié)合,洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗Goat Anti Rabbit IgG/HRP(1:10000),化學發(fā)光試劑檢測,X線片顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊性時,用LSD或SNK檢驗進行兩兩比較;方差不齊時,用秩和檢驗,組間比較用Kruskal-Wallist test。

2 結(jié)果

2.1 各組行為學測試結(jié)果

由表 1及圖 1可見,隱蔽平臺實驗從干預后第 1天開始,模型對照組小鼠逃避潛期明顯長于正常對照組(P＜0.05);針刺治療組小鼠逃避潛伏期明顯小于模型對照組(P＜0.05),多于正常對照組(P＜0.05);模型對照組及非穴位對照組小鼠之間逃避潛伏期無明顯差別(P＞0.05)。由表2及圖2-3可見,在最后1天的探索試驗中,模型對照組小鼠停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數(shù)明顯少于正常對照組(P＜0.05);針刺治療組小鼠停留在原平臺象限的時間和穿越原平臺次數(shù)明顯多于模型對照組(P＜0.05),少于正常對照組(P＜0.05);而模型對照組與非穴位對照組小鼠之間的停留時間和穿臺次數(shù)無明顯差別(P＞0.05)。

圖1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較

圖2 各組干預后探索試驗穿越平臺次數(shù)比較

圖3 各組干預后探索試驗停留原平臺象限時間比較

表1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 各組干預后小鼠隱蔽平臺實驗逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與正常對照組比較1)P＜0.05;與模型對照組比較2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常對照組 2 0 7 3 . 3 2 ± 2 . 0 6 5 7 . 4 7 ± 3 . 8 0 3 9 . 0 8 ± 5 . 4 6 3 4 . 9 8 ± 6 . 0 7 3 2 . 2 0 ± 4 . 0 3模型對照組 2 0 7 9 . 9 5 ± 2 . 4 1 1) 6 9 . 8 8 ± 2 . 8 4 1) 6 3 . 1 6 ± 4 . 0 9 1) 5 9 . 2 6 ± 2 . 7 3 1) 5 6 . 7 0 ± 3 . 1 9 1)非穴位對照組 2 0 8 0 . 5 0 ± 2 . 5 8 1) 7 0 . 8 8 ± 3 . 7 5 1) 6 2 . 9 1 ± 2 . 9 8 1) 5 9 . 5 0 ± 2 . 5 7 1) 5 6 . 5 1 ± 3 . 2 2 1)針刺治療組 2 0 7 6 . 3 4 ± 3 . 1 2 1)2)3) 6 5 . 0 3 ± 3 . 1 7 1)2)3) 5 0 . 3 0 ± 4 . 2 2 1)2)3) 4 5 . 9 3 ± 3 . 9 6 1)2)3) 4 0 . 5 6 ± 3 . 6 9 1)2)3)

表2 各組干預后探索試驗各項指標比較 (±s)

表2 各組干預后探索試驗各項指標比較 (±s)

注:與正常對照組比較 1)P＜0.05;與模型對照組比較 2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

組別 n 穿越平臺次數(shù)(次) 停留原平臺象限時間(s)正常對照組 20 9.00±2.20 30.98±5.85模型對照組 20 4.50±1.961) 15.43±2.601)非穴位對照組 20 4.90±2.221) 15.68±2.611)針刺治療組 20 6.90±1.681)2)3) 22.20±3.891)2)3)

2.2 Western blot結(jié)果

本研究采用 western blot方法檢測 NEP、Aβ42以及Flotillin-1在模型對照組、針刺治療組、非穴位對照組以及正常對照組小鼠海馬的表達水平。

實驗結(jié)果顯示,干預后 Flotillin-1在正常對照組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組增強(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,Flotillin-1的表達水平無明顯差異(P＞0.05);同時,Aβ42在正常對照組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯減弱(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組增強(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,Aβ42的表達水平無明顯差異(P＞0.05);干預后,NEP在正常對照組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),在針刺治療組的表達較模型對照組明顯增強(P＜0.05),在針刺治療組的表達較正常對照組減弱(P＜0.05),而非穴位對照組與模型對照組之間相比較,NEP的表達水平無明顯差異(P＞0.05)。詳見表3及圖4-5。

表3 各組小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot數(shù)據(jù)分析 (±s)

表3 各組小鼠海馬組織Flotillin-1、NEP及Aβ42的western blot數(shù)據(jù)分析 (±s)

注:與正常對照組比較1)P＜0.05;與模型對照組比較2)P＜0.05;與非穴位對照組比較3)P＜0.05

正常對照組 2 0 0 . 7 9 0 ± 0 . 0 4 5 1 . 2 2 5 ± 0 . 0 5 0 0 . 7 2 6 ± 0 . 0 1 6模型對照組 2 0 1 . 2 9 3 ± 0 . 1 1 7 1) 0 . 7 7 4 ± 0 . 0 1 3 1) 1 . 0 8 3 ± 0 . 0 1 2 1)非穴位對照組 2 0 1 . 1 9 7 ± 0 . 0 1 1 1) 0 . 7 5 7 ± 0 . 0 1 1 1) 1 . 0 9 1 ± 0 . 0 0 7 1)針刺治療組 2 0 1 . 0 1 2 ± 0 . 0 1 0 1)2)3) 0 . 8 4 6 ± 0 . 0 1 5 1)2)3) 1 . 0 5 9 ± 0 . 0 1 2 1)2)3)

圖4 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各組小鼠海馬組織中的表達

圖5 Flotillin-1、NEP及Aβ42在各組小鼠海馬組織的western blot分析結(jié)果

3 討論

阿爾茨海默病患者一個特征性神經(jīng)病理表現(xiàn)就是腦實質(zhì)中大量老年斑的形成,而老年斑的主要成分就是Aβ,Aβ主要是由其前體蛋白APP在β和γ分泌酶的作用下生成Aβ40、Aβ42,Aβ42易于形成具有AD特征的致密纖維狀神經(jīng)炎塊斑,神經(jīng)毒性較強。過多的 Aβ生成超其清除能力,導致 Aβ的絕對數(shù)量過多,不斷沉積細胞外間隙中,沉積的 Aβ纖維不斷聚集,繼而引發(fā)復雜的瀑布樣級聯(lián)反應,包括氧化應激、神經(jīng)遞質(zhì)丟失、Tau蛋白磷酸化、神經(jīng)炎癥反應、神經(jīng)元凋亡、細胞結(jié)構(gòu)的破壞、金屬離子代謝紊亂等,這些反應可以導致一系列病理損傷,如淀粉樣斑塊的形成、神經(jīng)元纖維纏結(jié)等,從而造成神經(jīng)元的變性和功能障礙,最終導致AD的發(fā)生[10]。

APP的異常代謝途徑正是在脂筏上進行的,脂筏是膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的微區(qū),聚集著許多蛋白質(zhì),為它們之間發(fā)生相互作用提供了平臺。研究發(fā)現(xiàn)脂筏在淀粉樣蛋白的生物起源和積累中發(fā)揮重要作用,這意味著脂筏在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[11-14]。脂筏參與了各種細胞活動,諸如細胞信號轉(zhuǎn)導、分子的識別、跨膜轉(zhuǎn)運等。脂筏蛋白(Flotillin-1)作為脂筏的主要組成成分和標記物,可以為 APP生成Aβ提供平臺。研究表明APP順序性酶切生成Aβ的異常代謝過程正是在脂筏上進行的[15],也就是說脂筏是APP生成Aβ的工作平臺。Flotillin-1與AD的發(fā)病關(guān)系密切,研究發(fā)現(xiàn)其在 AD患者含有β淀粉樣蛋白沉積的腦組織中表達明顯增強,并且表達強度和 Aβ的沉積程度成正比關(guān)系[16],可能是 Flotillin-1表達增強使APP生成Aβ的工作平臺增多從而導致Aβ產(chǎn)生過多。

NEP是位于軸突和突觸膜的Ⅱ型跨膜糖蛋白,廣泛分布于全身各組織。在腦中,特別是在易于發(fā)生 Aβ沉積的腦區(qū)如海馬、大腦皮質(zhì)、上丘腦、下丘腦、杏仁核和中央灰質(zhì)部位,NEP存在較多。NEP為細胞降解Aβ的主要酶,降解不溶性Aβ,因此,NEP被稱為腦內(nèi)Aβ的清道夫[17]。有研究顯示NEP亞細胞定位與Aβ生成及降解部位相一致,NEP對 Aβ的降解可能發(fā)生在突觸或突觸附近及軸漿運輸?shù)姆置谛∨葜衃18]。大量研究表明,NEP是體內(nèi)催化 Aβ降解的關(guān)鍵酶,是調(diào)節(jié)大腦 Aβ水平的重要因素。

本實驗研究表明,補腎活血針刺法能夠通過降低AD模型小鼠SAMP8小鼠海馬組織中Flotillin-1、上調(diào)NEP的表達來促進Aβ的降解,從而減少Aβ的沉積,下調(diào) Aβ42的表達,具有減輕其神經(jīng)毒性作用,并能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

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Effect of Acupuncture on Hippocampal Flotillin-1, NEP and Aβ42 Expressions in SAMP8 Mice

LI Guang-chen,LONG Cong,ZHU Hong,DONGKe-li,REN Dan,LIANGMei-ting,LIYa-yue.Department of Traditional Chinese Medicine,Central South University Third Xiangya Hospital,Changsha410013,China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on behaviors and its mechanism of action in a SAMP8 mouse model of Alzheimer disease.MethodsSixty 6-month-old male SAMP8 mice were randomized to acupuncture, model and non--acupoint groups. Twenty male SAMP1 mice of the same age constituted a normal control group. The acupuncture group

intervention by acupuncture at Shenshu, Baihui, Xuehai and Geshu. After eight weeks, a behavioral test was performed using the Morris water maze in every group of mice. The expressions of Flotillin-1, NEP and Aβ42 in mouse hippocampus were determined by western blot.ResultsThe Morris water maze test showed that as compared with the model group, escape latency shortened significantly (P＜0.05) and the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings increased (P＜0.05) in the acupuncture group of mice; escape latency, the time spent in the former platform quadrant and the number of former platform position crossings had no significant differences in the non-meridian-acupoint group of mice (allP＞0.05). As compared with the model group, Flotillin-1 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); NEP expression increased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05); Aβ42 expression decreased significantly in the acupuncture group (P＜0.05) but had no significant difference in the non-meridian-acupoint group (P＞0.05).ConclusionsAcupuncture can markedly improve learning and memory abilities in a SAMP8 mouse model of AD and reduce Flotillin-1 content and upregulate NEP expression in SAMP8 mouse hippocampus to decrease Aβ42 expression, relieve neurotoxicity and produce a neuroprotective effect.

Acupuncture therapy; Alzheimer disease; SAMP8; Mice; Dementia

1005-0957(2017)11-1356-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.11.1356

國家自然科學基金青年基金項目(81202730);湖南省自然科學基金項目(2011JJ3097);中央高?；究蒲袠I(yè)務經(jīng)費項目(2012QNZT162);湖南省中醫(yī)藥科技項目(201413)

李廣誠(1968—),男,副主任醫(yī)師,博士,Email:x7080@126.com

朱宏(1981—),男,主治醫(yī)師,博士,Email:yellingu@163.com

2017-05-06