荷負(fù)電氣溶膠對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的影響

佘文莉 王曉東 謝光輝 劉 暉 曹 鳳 羅良濤

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形美容科，廣東 廣州 510630)

荷負(fù)電氣溶膠對(duì)大鼠燒傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的影響

佘文莉 王曉東1謝光輝 劉 暉 曹 鳳 羅良濤2

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院燒傷整形美容科，廣東 廣州 510630)

目的分析大鼠燒傷創(chuàng)面采用荷負(fù)電氣溶膠對(duì)表皮干細(xì)胞的影響并分析作用機(jī)制。方法選取清潔級(jí)健康大鼠，在背部側(cè)分別做燒傷創(chuàng)面，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組采取荷負(fù)電氣溶膠治療，對(duì)照組大鼠不做任何治療，分析兩組大鼠創(chuàng)面愈合過(guò)程，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法分析干細(xì)胞含量，并分析表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、β1整合素表達(dá)變化。結(jié)果燒傷24 h后取創(chuàng)面組織染色觀察為深Ⅱ度病理改變，第2天基底層細(xì)胞增殖，5 d表皮細(xì)胞增殖，排列緊密。對(duì)照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明顯，分布稀疏。經(jīng)過(guò)治療，相同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組組織切片內(nèi)陽(yáng)性單位含量顯著大于對(duì)照組(Plt;0.05)。實(shí)驗(yàn)組平均愈合時(shí)間〔(7.1±1.2)d〕顯著短于對(duì)照組〔(9.5±1.2)d〕。實(shí)驗(yàn)組大鼠在傷后EGF和β1整合素該表達(dá)；在傷后第3天表達(dá)明顯增高，第7天仍然維持較高表達(dá)，對(duì)照組大鼠EGF和β1整合素在傷后第3天有所表達(dá)，第7天表達(dá)高峰，兩組大鼠EGF和β1整合素隨著治療時(shí)間不同存在顯著差異(Plt;0.05)。結(jié)論大鼠燒傷創(chuàng)面實(shí)施荷負(fù)電氣溶膠治療能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與EGF、β1整合素表達(dá)上升有關(guān)。

燒傷創(chuàng)面；表皮干細(xì)胞；荷負(fù)電氣溶膠

燒傷創(chuàng)面愈合受到多種因素的影響，在治療中關(guān)鍵在于促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。表皮干細(xì)胞是皮膚起源，整合素能夠參與調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞增殖分化，因此可以認(rèn)為促進(jìn)表皮干細(xì)胞分化有可能加快創(chuàng)面的愈合，創(chuàng)面愈合速度和質(zhì)量可以通過(guò)檢測(cè)表皮干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)〔1〕。負(fù)荷電氣溶膠能夠引起表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等高表達(dá)，促進(jìn)表皮干細(xì)胞組織分化。本文擬分析大鼠燒傷創(chuàng)面采用荷負(fù)電氣溶膠對(duì)表皮干細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 選取健康清潔級(jí)大鼠20只(中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限，體重200～250 g，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，劑量在0.3 ml/100 g，背部剃毛，作直徑2 cm圓性皮膚區(qū)。所有大鼠水浴法燒傷，水溫設(shè)定在85℃，持續(xù)時(shí)間15 s，組織學(xué)檢查為深Ⅱ創(chuàng)面。

1.2方法 治療儀器為珠?？祈锕こ淘O(shè)備有限公司生產(chǎn)生物電創(chuàng)傷治療儀。大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，大鼠均按照常規(guī)簡(jiǎn)單清理創(chuàng)面，實(shí)驗(yàn)組大鼠采用NB-Ⅰ型生物電創(chuàng)傷治療儀，調(diào)整發(fā)射窗距離，自第2日開(kāi)始每次照射1.5 h，直至創(chuàng)面愈合。對(duì)照組大鼠不做氣溶膠照射。

1.3觀察指標(biāo) 分別在治療前、治療3、7、10 d取組織樣本檢查。石蠟切片烤片，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，清除過(guò)氧化物酶，加一抗二抗和三抗，采用PBS清晰標(biāo)本，DAB液顯色，蘇木精染色水洗。第一抗體作為對(duì)照試驗(yàn)。采用陽(yáng)性細(xì)胞術(shù)半定量法，將玻片放在相同光線下觀察，棕褐色為陽(yáng)性，依照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目判斷陽(yáng)性染色程度。采用SABC法測(cè)定EGF、β1整合素，在200倍鏡下觀察免疫組化記錄，計(jì)算平均陽(yáng)性單位(PU)值，PU值越小陽(yáng)性單位越大。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t或者F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及創(chuàng)面觀察 基底膜上免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞較小，呈現(xiàn)橢圓形，內(nèi)含棕色顆粒，陰性細(xì)胞位于基底膜上層和毛囊內(nèi)層。燒傷24 h后取創(chuàng)面組織染色觀察為深Ⅱ度病理改變，第2天基底層細(xì)胞增殖，5 d表皮細(xì)胞增殖，排列緊密。對(duì)照大鼠第3天局部增殖，第7天增殖明顯，分布稀疏。治療組大鼠創(chuàng)面腫脹較對(duì)照組輕。平均愈合時(shí)間為(7.1±1.2)d，顯著短于對(duì)照組大鼠愈合時(shí)間(9.5±1.2)d(Plt;0.05)。

2.2治療前后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化 治療后，實(shí)驗(yàn)組組織切片內(nèi)陽(yáng)性單位含量顯著大于對(duì)照組(Plt;0.05)。見(jiàn)表1。

2.3EGF和β1整合素水平比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠在傷后第3天EGF和β1整合素表達(dá)明顯增高，第7天仍然維持較高表達(dá)；對(duì)照組大鼠在傷后第3天有所表達(dá)，第7天表達(dá)高峰，兩組大鼠EGF和β1整合素隨著治療時(shí)間不同存在顯著差異(Plt;0.05)。見(jiàn)表2。

表1 創(chuàng)面治療前后大鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100個(gè)細(xì)胞)

表2 大鼠EGF和β1整合素免疫組化染色圖像分析PU值

3 討 論

皮膚損傷是影響人類(lèi)健康的重要威脅之一，皮膚延遲愈合是引起并發(fā)癥的主要原因之一。目前臨床促進(jìn)創(chuàng)面愈合可以通過(guò)兩種途徑，一種是激活內(nèi)源性物質(zhì)，采用EGF、維生素C等激活皮膚干細(xì)胞，加速皮膚的愈合；另外一種是外源性應(yīng)用〔2〕。生物電治療儀能夠產(chǎn)生荷負(fù)電氣溶膠，可穿透創(chuàng)面、黏膜等組織，直接刺激細(xì)胞和堅(jiān)持，影響細(xì)胞生物電的活性，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。在以往研究中發(fā)現(xiàn)荷負(fù)電氣溶膠能夠顯著促進(jìn)燒傷后創(chuàng)面干細(xì)胞的愈合，而且沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，采用荷負(fù)電氣溶膠治療能夠有效促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖，刺激表皮干細(xì)胞，加快創(chuàng)面愈合。

在體外研究中發(fā)現(xiàn)正常人10%皮膚基底層有足夠增殖潛能的干細(xì)胞，其中一半具有增殖分裂能力，分化細(xì)胞〔3〕。正常情況下，干細(xì)胞數(shù)量是恒定的，但是在機(jī)械、化學(xué)刺激等作用下，停留在G0～G1期的細(xì)胞可能出現(xiàn)增殖情況。燒傷后，皮下組織殘留的毛細(xì)血管等在刺激后，干細(xì)胞成為表皮干細(xì)胞主要來(lái)源，從理論上分析，給予適當(dāng)刺激有助于細(xì)胞增殖。在本組研究中采取荷負(fù)電氣溶膠，發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞確實(shí)存在增殖表現(xiàn)。以往有研究發(fā)現(xiàn)外環(huán)境變化也會(huì)引起表皮細(xì)胞逆向分化，針對(duì)潰瘍創(chuàng)面采用EGF治療，發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞層聚集成島狀，表皮細(xì)胞分化為干細(xì)胞，創(chuàng)面表皮呈現(xiàn)多源頭性。

大量資料顯示參與調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合過(guò)程因素有很多，其中多肽生長(zhǎng)因子是最主要的因素之一，能夠參與創(chuàng)面細(xì)胞增殖、趨化等過(guò)程，并能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的增生〔4〕。與燒傷創(chuàng)面有關(guān)生長(zhǎng)因子較多，包括EGF、TGF、IGF等，臨床研究發(fā)現(xiàn)燒傷創(chuàng)面、慢性潰瘍面采用EGF能夠顯著縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。EGF是膠質(zhì)細(xì)胞化學(xué)趨化因子，能夠有效促進(jìn)皮膚和黏膜創(chuàng)面組織修復(fù)過(guò)程，促進(jìn)皮膚和黏膜創(chuàng)面組織的修復(fù)，加速膠質(zhì)細(xì)胞遷移和增殖，并能夠誘導(dǎo)α2β1整合素表達(dá)。整合素類(lèi)型較多，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與ECM的黏附，調(diào)控細(xì)胞增殖，因此是影響傷口收縮重要因子。在以往研究中發(fā)現(xiàn)整合素能夠與生長(zhǎng)因子相互協(xié)調(diào)參與創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程〔5〕。有研究指出，整合素能夠增強(qiáng)EGF的作用，其中β1整合素是比較具有代表性的因子，高表達(dá)時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖活化，因此，β1整合素常作為表皮干細(xì)胞重要影響因子之一〔6〕。本組研究說(shuō)明荷負(fù)電氣溶膠治療能夠參與促進(jìn)EGF的表達(dá)，加快細(xì)胞增殖，采用荷負(fù)電氣溶膠治療還能夠促進(jìn)創(chuàng)面殘留表皮細(xì)胞與生長(zhǎng)因子結(jié)合，誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖，微環(huán)境的變化觸發(fā)跨膜信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，產(chǎn)生促修復(fù)效應(yīng)。

大鼠燒傷創(chuàng)面實(shí)施荷負(fù)電氣溶膠治療能夠促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖，EGF、β1整合素表達(dá)上升可能是其作用機(jī)制；關(guān)于荷負(fù)電氣溶膠刺激表皮細(xì)胞的逆向分化還需要進(jìn)一步分析。

1李仙松,杜 娟,宋振嵐,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞重建表皮細(xì)胞及皮膚附件〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2014；(6):853-9.

2廖鏘云,吳曉健,容詠新,等.濕性療法對(duì)創(chuàng)面表皮干細(xì)胞影響的研究〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2013;51(30):29-30.

3梁 玲,李新平,白文芳,等.低頻電磁場(chǎng)在基因修飾表皮干細(xì)胞移植修復(fù)創(chuàng)面中的作用〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2013；(32):5827-33.

4王艷波,王思農(nóng).表皮干細(xì)胞在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的作用研究進(jìn)展〔J〕.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2014;12(20):58-60.

5吳麗萍,謝肖霞,梁運(yùn)轉(zhuǎn),等.荷負(fù)電氣溶膠對(duì)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的效果觀察〔J〕.中華損傷與修復(fù)雜志(電子版),2010;5(2):224-6.

6王 淞.生物電對(duì)表皮干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用的影響〔D〕.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué),2015.

〔2016-05-17修回〕

(編輯 徐 杰)

R644

A

1005-9202(2017)21-5253-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.21.016

國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心“重大疾病防治科技行動(dòng)計(jì)劃-創(chuàng)傷修復(fù)專(zhuān)項(xiàng)”課題(ZX-01-C2016021)；2014年廣州市花都區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(HD14CXY001);2014年暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院護(hù)理科研專(zhuān)項(xiàng)基金立項(xiàng)項(xiàng)目(2014305)

1 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科 2 天門(mén)市第一人民醫(yī)院外科

佘文莉(1972-) ，女，主管護(hù)師，主要從事燒傷整形外科及慢性創(chuàng)面方面研究。