50份哈薩克斯坦小麥高分子量谷蛋白亞基解析

吳勇昊，劉玉秀，王一釗，桑 珠，朱酉正捷，張正茂

(西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

小麥作為中國重要的糧食作物，對保障糧食安全發(fā)揮著重要的作用[1]。目前，我國小麥產(chǎn)需平衡有余，但隨著居民膳食結構升級，對優(yōu)質(zhì)小麥的需求量不斷增大，致使專用優(yōu)質(zhì)小麥供給不足[2]。我國小麥品質(zhì)面臨的主要問題是面筋強度和延展性較差，蛋白質(zhì)和面筋質(zhì)量有待進一步提高[3]，因此，進口小麥逐漸成為中國糧食消費的重要補充。哈薩克斯坦是優(yōu)質(zhì)小麥的生產(chǎn)國家之一，并穩(wěn)固全球第六大小麥出口國。哈薩克斯坦小麥籽粒蛋白質(zhì)相對較高，近一半的小麥籽粒蛋白質(zhì)含量在14%以上[4]；胚乳的蛋白含量占全麥蛋白的65%，比國產(chǎn)小麥高20%[5]。

小麥品質(zhì)主要包括加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[6]。谷蛋白是影響小麥加工品質(zhì)的重要因素，根據(jù)其分子量大小分為高分子量谷蛋白(HMW-GS，high molecular weight glutenin subunits)和低分子量谷蛋白(LMW-GS，low molecular weight glutenin subunits)[7]。研究表明，小麥的HWM-GS是形成谷蛋白聚合體的主要成分，與其面筋特性、烘焙品質(zhì)等密切相關[8-11]。

HMW-GS由位于小麥1A、1B、1D染色體長臂上的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點上的編碼基因控制，統(tǒng)稱為Glu-1位點[12]。Glu-B1和Glu-D1位點各包含x、y兩種亞基類型，如Glu-B1位點的Bx7、By8、By9、Bx14等，Glu-D1位點的Dx5、Dy10、Dy12等。2種亞基類型通常成對出現(xiàn)，如Bx7+By8(7+8)、Bx6+By8(6+8)、Dx4+Dy12(4+12)及Dx3+Dy12(3+12)，單個類型出現(xiàn)的情況較少；Glu-A1位點只含x類型，常見的亞基類型為Ax1(Glu-A1a)、 Ax2*(Glu-A1b)和 Null(Glu-A1c)[13-14]。HMW-GS的組成和數(shù)量明顯影響小麥面筋特性、烘焙品質(zhì)[15-16]，不同的亞基和亞基組合類型對小麥品質(zhì)的貢獻也不盡相同[17]。Ax1(1)、Ax2*(2*)、Bx7+By8(7+8)、Bx13+By16(13+16)、Bx14+By15(14+15)和Bx17+By18(17+18)亞基對烘烤品質(zhì)有正向效應，攜帶Dx5+Dy10(5+10)亞基的小麥品種具有較好的面包品質(zhì)，這些亞基都是公認的小麥優(yōu)質(zhì)的高分子量麥谷蛋白亞基；而攜帶Null和Dx2+Dy12(2+12)亞基則與較差的烘烤品質(zhì)相關[13,18-21]。在Glu-B1位點，Bx7在小麥中廣泛分布，通常會與By8或By9亞基連鎖，但Bx7+By8(7+8)亞基組合對小麥面筋的貢獻遠大于亞基組合Bx7+By9(7+9)[22]。

Payne等[8]利用SDS-PAGE分析小麥的HWM-GS組成，并建立了HWM-GS的Glu-1評分體系，被國內(nèi)外學者廣泛采用[23]。Bustos等[24]和Ovideo等[25]設計了系列區(qū)分Glu-D1位點上的2、5、10、12等亞基的特異性引物；張曉科等[26]和Ma等[27]分別建立Glu-A1位點上2*亞基、Glu-B1位點上17亞基的多重PCR反應體系。小麥品種的HWM-GS組成取決于遺傳因素，我國小麥品種HWM-GS類型豐富，但Dx5+Dy10(5+10)等優(yōu)質(zhì)亞基頻率較低[28]，且含有多個優(yōu)質(zhì)亞基組合的品種也較少，這是導致我國小麥品質(zhì)差的重要原因。引進國外優(yōu)質(zhì)HMW-GS的種質(zhì)資源可為我國小麥的品質(zhì)育種及優(yōu)質(zhì)亞基的聚合提供材料，是改善我國小麥品質(zhì)的重要途徑之一，對提高我國小麥加工品質(zhì)有著極其重要的作用[29]。

本試驗利用SDS-PAGE技術、STS分子標記檢測和近紅外谷物分析儀，對引進的50份哈薩克斯坦小麥種質(zhì)進行HMW-GS組成及品質(zhì)性狀的分析，旨在了解哈薩克斯坦小麥種質(zhì)HWM-GS的組成，以期篩選出含有優(yōu)質(zhì)亞基及優(yōu)質(zhì)亞基組合的小麥材料，為我國小麥品質(zhì)的改良提供重要參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以引進的50份哈薩克斯坦小麥種質(zhì)為供試材料，西農(nóng)979(1/7+8/2+12)、中國春(Null/7+8/2+12)為HWM-GS亞基對照材料，均由西北農(nóng)林科技大學旱地小麥育種課題組提供。

試驗材料于2019-2020年度在西北農(nóng)林科技大學曹新莊試驗農(nóng)場種植，采用隨機區(qū)組設計，每個品種(系)種植3行，行長1.5 m，行距0.25 m，重復三次。田間管理同當?shù)卮筇锷a(chǎn)，收獲后，種子經(jīng)過精選、晾曬后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 HMW-GS提取及評分

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對HMW-GS的組成進行分析，按照鄭青煥等[30]方法提取HMW-GS，參照Payne等[8]方法，建立Glu-1位點亞基的質(zhì)量評分系統(tǒng)，具體見表1。

1.2.2 PCR分子標記

取幼苗0.3 g左右，采取改良CTAB方法提取小麥的基因組DNA[31]。特異性分子標記的引物序列、反應體系和程序同文獻，具體見表2。PCR擴增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TAE溶液，160 V電壓電泳 45 min，染色、掃描成像。

1.2.3 品質(zhì)性狀分析

利用DA7200近紅外谷物分析儀測定供試小麥籽粒的粗蛋白含量、濕面筋含量、吸水率、淀粉含量、沉降值、容重。

表1 HMW-GS的評分Table 1 Quality scores assigned to individual or pairs of HMW glutenin subunits

表2 試驗用分子標記Table 2 Primers of molecular markers used in the study

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 哈薩克斯坦小麥種質(zhì)HMW-GS的組成分析

由表3和圖1可知，在50份供試小麥種質(zhì)資源中，共檢測出8種不同類型的HWM-GS。其中，Glu-A1位點有1和N共2種類型，N亞基出現(xiàn)頻率較高，為66%，1亞基出現(xiàn)頻率為34%；Glu-B1位點有7+8和7+9共2種類型，7+9亞基出現(xiàn)頻率較高，為78%，7+8亞基出現(xiàn)頻率為22%；Glu-D1位點有5+10、2+10、2+12及4+12共4種類型，5+10亞基出現(xiàn)頻率最高，為56%，2+12亞基出現(xiàn)頻率為38%，2+10和4+12出現(xiàn)頻率較低，分別為4%和2%。利用HWM-GS特異性分子標記對供試小麥各個亞基進行驗證，在Glu-A1位點，含亞基Null的品種中可擴增出920 bp的條帶(圖2)；在Glu-B1位點上，則含亞基9的品種中可擴增出707 bp的條帶(圖3)；Glu-D1位點，含亞基5的品種中可擴增出478 bp的條帶(圖4)；在Glu-B1位點，含亞基8的品種中可擴增出527 bp的條帶(圖5)；沒有檢測到2*、7OE相應的條帶。此結果與SDS-PAGE結果一致，說明兩種檢測方法均準確可靠。

表3 50份哈薩克斯坦小麥種質(zhì) Glu-A1、 Glu-B1、 Glu-D1位點的HMW-GS及其頻率Table 3 HMW-GS and their frequency on Glu-A1, Glu-B1,and Glu-D1 loci of the 50 Kazakhstan wheat germplasm

2.2 50份哈薩克斯坦小麥亞基組合及其評分

由表4可知，供試小麥的品質(zhì)評分大都在7、8分，平均得分為7.10。在Payne 評分體系中(表1)，1A、1B、1D最高得分分別是3、3、4分。在50份供試小麥中，組合為1/7+8/5+10的得分達到10分，占比8%；評分≥7的材料有34份，占供試材料的68%；評分最低的亞基組合為1/7+9/4+12(3分)，頻率是2%。評分為7的哈薩克斯坦小麥種質(zhì)材料最多，共有17份，其亞基組合有N/7+9/5+10和1/7+9/2+12，頻率為34%。

由表4可知，在供試小麥中，共檢測出9種HMW-GS組合類型，其中組合N/7+9/5+10，出現(xiàn)頻率最高，達到30%，其次是組合N/7+9/2+12，出現(xiàn)頻率為28%；組合1/7+9/5+10、1/7+8/5+10、N/7+8/5+10、1/7+9/2+12、1/7+8/2+12、1/7+9/4+12、N/7+9/2+12、1/7+8/2+10出現(xiàn)頻率分別是12%、8%、8%、6%、4%、2%、2%、2%。

SP和979:中國春和西農(nóng)979; 22～33:試驗材料

M:D2000;1～8:試驗材料

M:D2000;1～9：試驗材料

表4 50份哈薩克斯坦小麥種質(zhì)的HMW-GS 組合及其評分Table 4 HMW-GS combinations and quality score of the 50 wheat germplasm from Kazakhstan

2.3 50份哈薩克斯坦小麥品質(zhì)性狀分析

由表5可知，在品質(zhì)性狀中，沉降值的變化范圍最大，為11.2～34.7 mL，變異系數(shù)為21.8%；其他指標變異系數(shù)較低，依次為濕面筋含量、粗蛋白含量、淀粉含量、含水量、吸水率和容重。總體來看，沉降值和濕面筋含量的變異系數(shù)較高，遺傳多樣性豐富，具有遺傳改良潛質(zhì)。小麥的烘焙品質(zhì)主要與濕面筋含量、粗蛋白含量以及沉降值呈正向相關[11-12]。對供試小麥進行品質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)，編號為9、18、36號的烘焙品質(zhì)較好。

M:D2000;16～24:試驗材料

M:D2000;9～19:試驗材料

表5 50份哈薩克斯坦小麥品質(zhì)性狀分析Table 5 Quality trait analysis of the 50 wheat germplasm in Kazakhstan

2.4 50份哈薩克斯坦小麥HMW-GS亞基分布對小麥品質(zhì)影響

由表6可知，在Glu-A1位點上，攜帶1亞基的小麥材料的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和吸水率顯著高于攜帶Null亞基的材料。在Glu-B1位點上，攜帶7+8亞基的小麥材料的蛋白質(zhì)含量、濕面筋含量、沉降值和吸水率顯著高于攜帶7+9亞基的材料。在Glu-D1位點上，四種亞基對小麥不同品質(zhì)指標的影響不同，其中，攜帶2+12和5+10亞基的材料的吸水率明顯高于含有其他亞基的材料，而攜帶5+10亞基的材料的沉降值顯著高于含有2+12亞基的材料；對蛋白質(zhì)含量和濕面筋含量，含有2+12和5+10亞基的材料間無顯著性差異；攜帶4+12亞基材料的沉降值顯著高于攜帶其他亞基的材料，但其蛋白質(zhì)和濕面筋含量低于攜帶其他亞基的小麥材料。

表6 不同HMW-GS亞基對小麥品質(zhì)的影響Table 6 Effect of different HMW-GS subunits on wheat quality

3 討 論

準確有效地鑒定HMW-GS對加快小麥品質(zhì)改良具有重要意義[32]。目前，分離鑒定HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE、RP-HPLC及分子標記等[33-36]。SDS-PAGE 是分離和鑒定HWM-GS的傳統(tǒng)方法，但這種方法不能有效鑒定Bx7OE和By8*亞基及Ax2和Ax2*等分子量接近的亞基[36-37]，且費時費力。隨著越來越多的HWM-GS基因被克隆，相應的分子標記也不斷地發(fā)展[38]，本研究先利用SDS-PAGE對50份哈薩克斯坦小麥種質(zhì)HWM-GS進行鑒定，并利用PCR分子標記進行了驗證，發(fā)現(xiàn)兩種方法鑒定結果一致，說明這兩種方法均可用于小麥育種中優(yōu)質(zhì)亞基檢測。

對國外引進材料進行HMW-GS組成分析，可以為我國小麥品質(zhì)育種提供重要種質(zhì)資源。在Glu-A1位點上，1和2*亞基是強筋小麥的優(yōu)質(zhì)亞基，陳 杰等[20]在94個黃淮麥區(qū)新育成的小麥品種Glu-A1位點，檢測到1和N亞基，未檢測到2*優(yōu)質(zhì)亞基。這與本研究結果一致，推測Glu-A1位點上優(yōu)質(zhì)亞基的匱乏是制約小麥品質(zhì)提升的重要因素。在Glu-B1位點，我國小麥主要攜帶7+9和7+8亞基，張自陽等[19]分析了148份小麥種質(zhì)Glu-B1位點亞基類型，發(fā)現(xiàn)7+9和7+8亞基占比81.8%；范家霖等[17]對黃淮海麥區(qū)近20年來生產(chǎn)種植的小麥品種(系)Glu-B1位點亞基類型分析，發(fā)現(xiàn)7+9和7+8亞基出現(xiàn)頻率較高，為77.2%，本研究在Glu-B1位點檢測的7+9和7+8亞基較少，可能與檢測樣品數(shù)量較少或者哈薩克斯坦小麥種質(zhì)特性有關。張學勇等[39]分析了我國5 129份小麥初選核心種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)HWM-GS亞基組成較為單一，主要由Null、7+8、2+12組成，頻率分別是92.92%、81.65%、 85.68%，而與面包烘烤品質(zhì)顯著相關的5+10亞基出現(xiàn)頻率較低。5+10亞基是公認的對強筋品質(zhì)有正向效應的優(yōu)質(zhì)亞基，Horvat等[40]發(fā)現(xiàn)，含有1和5+10亞基的小麥具有良好的面包品質(zhì)，其中Glu-D1位點上的亞基對面包的品質(zhì)的影響最為顯著。本試驗中，共有28份小麥含有5+10亞基，頻率為56%；在強筋品種選育過程中，應加強該類資源的有效利用。

張金乾等[44]對隴東地區(qū)小麥資源的 HMW-GS組成和品質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)攜帶2*/7+9、5+12亞基組合的小麥綜合品質(zhì)性狀較優(yōu)。HMW-GS對小麥蛋白質(zhì)含量影響較小，但是對饅頭加工品質(zhì)和面團筋力有著顯著影響[45]。其中，攜帶1/7 + 9/5+10、1/7 +8/2+12亞基組合的小麥種質(zhì)饅頭的加工品質(zhì)較好[46]。本研究中，含有1/7 + 9/5+10、1/7+8/2 +12亞基組合的小麥種質(zhì)共有8份，占比16%，可用作饅頭加工的原材料。

本研究的50份哈薩克斯坦小麥的品質(zhì)評分均值為7.10，其中評分為10分的材料有4份，評分≥8的材料有17份，基本達到了中強筋小麥水平[41]。張玲麗等[42]分析國內(nèi)186份普通小麥種質(zhì)材料的平均得分為6.90；鄭青煥等[30]對21份印度小麥材料進行了分析，其平均得分為7.52；Fu等[43]對64份澳大利亞的小麥種質(zhì)進行小麥品質(zhì)評價，平均評分為7.40分。外引種質(zhì)資源評分普遍高于國內(nèi)小麥品種，其中優(yōu)質(zhì)材料可為我國小麥品質(zhì)改良提供優(yōu)良的基因來源。