香菇菌粗酶液對(duì)豬場(chǎng)霧霾中萘的作用研究

周孟清，賈 峰,張惠茹，宴和平 ，謝申伍，黃 進(jìn) ，羅 宇,阮婷婷

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.廣州快大飼料有限公司，廣東廣州511450;3.云南東恒集團(tuán)生物飼料公司，云南曲靖655500）

香菇菌粗酶液對(duì)豬場(chǎng)霧霾中萘的作用研究

周孟清1，賈 峰1,張惠茹1，宴和平2，謝申伍3，黃 進(jìn)1，羅 宇1,阮婷婷1

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001；2.廣州快大飼料有限公司，廣東廣州511450;3.云南東恒集團(tuán)生物飼料公司，云南曲靖655500）

近5年以來,我國霧霾污染十分嚴(yán)重，豬場(chǎng)也同受其害,霧霾中包括萘等有害物質(zhì)危害豬和養(yǎng)殖人員的健康；以往的研究發(fā)現(xiàn)香菇菌分泌的漆酶等酶類可以降解多種有害物質(zhì)。為研究香菇菌粗酶液對(duì)霧霾中萘的作用，以便為消除霧霾對(duì)人和動(dòng)物的有害作用提供一些參考，文章首先采用L934正交實(shí)驗(yàn)，研究流速（0.6mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min），波長(zhǎng)（210nm、220nm、254nm），柱溫（25℃、30℃、40℃），有機(jī)相甲醇和水相之比（75:25、70:30、85:15）來確定高效液相色譜儀器檢測(cè)霧霾中的萘的條件參數(shù)。然后采用L934正交實(shí)驗(yàn)，研究溫度（35℃、40℃、30℃），酶處理時(shí)間（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5mL、10mL、15mL）對(duì)香菇粗酶液降解霧霾中萘的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：溫度35℃,pH值4.0、處理時(shí)間10h、加入酶的量5mL為最適條件；在此條件下萘含量為2.08±2.95(pg·m-3)，降解前霧霾樣品中的萘含量為0.217494ng·m-3，降解率達(dá)到99.04%。結(jié)論表明，香菇菌粗酶液可以降解霧霾中的萘，具有開發(fā)潛力。

豬場(chǎng)；霧霾；萘；香菇菌；粗酶液；高效液相色譜；降解

香菇(Lent i nusedodes)不僅是一種食用菌而且還具有很高的藥用價(jià)值，其子實(shí)體中存在漆酶（Lac），它是一種非特異性氧化酶，能夠氧化的底物有250種[1],包括木質(zhì)素，漆酶氧化木質(zhì)素的過程已有多種理論[2]，這些理論都認(rèn)為氧化過程中會(huì)形成木質(zhì)素自由基，使得單元結(jié)構(gòu)之間的連接斷裂,整個(gè)反應(yīng)過程中是通過4個(gè)銅離子協(xié)同傳遞電子和其價(jià)態(tài)的變化來實(shí)現(xiàn)的[3]。

霧霾是由于大量懸浮在近地面的小水滴以及直徑小于2.5μm的固體或液體顆粒組成的氣溶膠系統(tǒng)，是近地面層空氣中水汽和固體液體顆粒凝結(jié)的產(chǎn)物，能見度水平小于一千米則被稱為霧霾或者灰霾。環(huán)境空氣中當(dāng)量直徑小于或者等于2.5μm的顆粒物質(zhì)叫做PM2.5[4]。霧霾顆粒的來源廣，組成包括無機(jī)元素、水溶性離子、有機(jī)物、化合物等。有機(jī)質(zhì)成份包括氮氧化合物（NOx）、NH3、烴（如甲烷）等[5]。萘屬芳香族烴類是有特殊氣味的白色結(jié)晶,易氧化,易揮發(fā),萘對(duì)血液的損害已被公認(rèn)[6];萘可以影響細(xì)胞遺傳[7]。

霧霆天氣加劇畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)舍內(nèi)空氣環(huán)境惡化,畜禽出現(xiàn)食欲不振、疾病率提高等現(xiàn)象。研究畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)霧霾中萘的生物降解，對(duì)防治霧霾和改善空氣環(huán)境質(zhì)量具有實(shí)際意義,可以為我國治理霧霾污染提供一種借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種∶香菇菌種購自中國菌種保藏中心。香菇菌粗酶液由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；霧霾樣品由大氣顆粒物中流量采樣器采集，TH-150型（武漢天虹儀器儀表有限公司），采樣平均流量為100 L·m i n-1。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑：愈創(chuàng)木酚，化學(xué)純；甲醇，色譜純。瓊脂粉，生化級(jí)試劑。丁二酸（琥珀酸）、檸檬酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、葡萄糖都是分析純級(jí)別。

1.2.2 主要儀器：高效液相色譜儀（1260 Inf i ni t y,Agil entTechnol ogi es，配PAH專用柱）；AR224CN電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；便攜式pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L934正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)控制高效液相色譜儀的溫度、波長(zhǎng)、流速、有機(jī)相與水的配比來尋找分析霧霾溶液成份的最佳條件。之后，又通過L934正交試驗(yàn)控制粗酶液作用于霧霾樣品的溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、加入的酶量，尋找香菇粗酶液降解霧霾樣品中蒽的最適條件。

表1 霧霾檢測(cè)條件的4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)表

1.4 香菇粗酶的提取

PDA培養(yǎng)基以及倒平板與接種參照張玉（2006）的方法進(jìn)行，將培養(yǎng)好的香菇菌充分碾碎，加入適量的蒸餾水在25℃的環(huán)境下泡4h，然后在3500r/m i n的離心機(jī)中離心5m i n，就得到香菇菌的粗酶液。

1.5 愈創(chuàng)木酚法測(cè)Lac的酶活

Lac活性的測(cè)定按照王鼎（2009）所述的方法進(jìn)行測(cè)定，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。經(jīng)過公式1：酶活（U/m L）=106×V總×ΔA/(V酶×ε×Δt)（式1）∶其中V總、V酶分別代表反應(yīng)體系的總體積及反應(yīng)酶液的體積；ε為吸光系數(shù)，愈創(chuàng)木酚的ε465=1.21×104m ol-1·L·cm-1)。算得香菇粗酶液中Lac的活性為8.0126U/m L。

1.6 霧霾樣品中萘的測(cè)定

霧霾樣品的含量采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以甲醇和超純水為有機(jī)溶劑，每次進(jìn)樣量為20 μL。采用 Agi l entPAH專用柱（3μm，100m m×4.6m m）。用L934正交實(shí)驗(yàn),以流速（0.6m L/m i n、0.8m L/m i n、1.0 m L/m i n），波長(zhǎng)（210nm、220nm、254nm），柱溫（25℃、30℃、40℃），有機(jī)相甲醇和水相之比（75∶25、70∶30、85∶15）設(shè)計(jì)的正交表，經(jīng)試驗(yàn)的最佳測(cè)定條件見表1中8號(hào)試驗(yàn)條件。萘的標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制,稱取0.2142 m g的萘標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇溶液，配制成5m L體積備用，萘的標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為42.84518 μg/m L。

1.7 香菇粗酶液處理霧霾樣品

采用L934正交實(shí)驗(yàn)，四因素分別是溫度（35℃、40℃、30℃），處理時(shí)間（10h、20h、30h），pH（4.0、4.4、4.8），加入酶的量（5m L、10m L、15m L）。結(jié)果如表2所示。

1.8 霧霾樣品中物質(zhì)的檢測(cè)

按操作要求打開高效液相儀器，按照波長(zhǎng)210nm、柱溫30℃、流速1.0m L/m i n、有機(jī)相與水相的比為75∶25，待基線平衡后，開始進(jìn)樣。得出數(shù)據(jù)如表2、表3和圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜檢測(cè)條件參數(shù)的確定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中作者采用表1霧霾檢測(cè)條件的4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)表來找出檢測(cè)霧霾樣品的最適條件，可以看到在序號(hào)1條件為最適條件：流速1.0m L/m i n,溫度30℃,波長(zhǎng)210nm,有機(jī)相和水相之間的比為 75∶25。

2.2 不同條件下香菇粗酶液降解霧霾樣品的效果

表2 香菇粗酶液處理霧霾樣品中萘的4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)表

由表2可知，降解前霧霾樣品中的萘含量為0.217494ng·m-3，在溫度35℃,pH值4.0,處理時(shí)間10h,加入酶的量5m L的條件下降解，萘含量為2.08 ±2.95(pg·m-3)，降解率達(dá)到 99.04% 。

在表2的實(shí)驗(yàn)條件下，采用香菇粗酶液降解霧霾樣品，然后通過高效液相色譜儀檢測(cè)降解前后樣品中物質(zhì)含量的變化,可見樣品中的所含物質(zhì)數(shù)量發(fā)生了變化。表明此試驗(yàn)不但降解了萘，同時(shí)還降解了一些其他物質(zhì)。

并且在試驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)在添加香菇粗酶液后，霧霾樣品溶液中有沉淀生成，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)粗酶液與霧霾樣品中物質(zhì)有反應(yīng)，所以導(dǎo)致生成沉淀。

在表2中，3號(hào)和9號(hào)試驗(yàn)條件的降解效果也較好，3號(hào)的試驗(yàn)條件萘的降解率達(dá)到99.46%；9號(hào)的試驗(yàn)條萘的降解率達(dá)到99.50%，與1號(hào)條件差異不顯著（P＞0.05）。

3.討論

3.1 高效液相色譜檢測(cè)霧霾樣品萘的前提條件

實(shí)驗(yàn)中高效液相色譜儀器的穩(wěn)定對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確都十分重要，在進(jìn)樣前的準(zhǔn)備工作顯得十分重要[8]，一定等到基線完全平衡時(shí)在進(jìn)樣，甲醇試劑必須是色譜純級(jí)[9]，并且霧霾樣品、水相和甲醇都必須經(jīng)過超聲脫氣，來保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[10]。高效液相色譜被用來檢測(cè)生物質(zhì)燃燒時(shí)產(chǎn)生的表面活性物質(zhì),配上GC/M S檢測(cè)非常有用[11]。

3.2 高效液相色譜檢測(cè)霧霾樣品萘的正交試驗(yàn)條件

何藝（2017）用固相萃?。咝б合嗌V法測(cè)定PM2.5中多環(huán)芳烴的條件為柱溫為35℃，流速0.5m L/m i n，以水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫[12]。蒲彥利（2016）研究PM2.5中16種多環(huán)芳烴的高效液相色譜測(cè)定中用At hena PAH s專用柱（4.6 m m×250 m m，5μm），柱溫 30℃，流動(dòng)相為乙腈和超純水，流速1.2 m L/m i n，進(jìn)樣量10μL[13]。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造性的將正交實(shí)驗(yàn)用于高效液相色譜檢測(cè)條件的優(yōu)化中，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有試驗(yàn)次數(shù)少，選擇的試驗(yàn)條件水平數(shù)較多的優(yōu)點(diǎn)。

3.3 香菇粗酶液成分及活性

香菇粗酶液中含有錳過氧化酶和漆酶,產(chǎn)酶量受氮營養(yǎng)素影響[14]。釀酒的副產(chǎn)物可作為香菇培養(yǎng)基來生產(chǎn)漆酶和錳過氧化酶[15]。葉漢玲,王傳槐（1997）對(duì)香菇子實(shí)體漆酶進(jìn)行分離純化，得到單一組分的漆酶，其摩爾式量為55 000。最適PH為2.6，溫度為70℃，Km值為0.142m m ol[16]。本試驗(yàn)中對(duì)漆酶的性質(zhì)未進(jìn)行研究。

漆酶和錳過氧化物酶不能單獨(dú)降解木質(zhì)素，甚至單一漆酶在降解木質(zhì)素時(shí)幾乎不起作用,兩者在一起能有效地降解木質(zhì)素。對(duì)于木質(zhì)素,其降解是一個(gè)復(fù)雜的多種酶體系共同作用的結(jié)果，不同實(shí)驗(yàn)得到不同的結(jié)果是完全可以理解的[1]。

張玉 (2006)發(fā)現(xiàn)香菇的靜置培養(yǎng)優(yōu)于振蕩培養(yǎng);最適生長(zhǎng)及產(chǎn)酶條件：pH值3.5，20℃，Cu2+濃度為0.4m m ol/L，阿魏酸、愈創(chuàng)木酚、沒食子酸、黎蘆醇會(huì)抑制香菇菌絲生長(zhǎng)；Tween-80不利于漆酶合成。以2,2′-連氮-雙 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)為底物的最佳反應(yīng)溫度是65℃,pH值為2.2[17]。孫瑞雪（2015）對(duì)虎皮香菇漆酶發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，漆酶活性達(dá)462.59 U/m L，為優(yōu)化前的26倍[18]。本實(shí)驗(yàn)中香菇粗酶液中漆酶的活性為8.0126U/m L，數(shù)值較低，未采取優(yōu)化培養(yǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)漆酶、碳水化合物清除酶、α-支鏈淀粉酶和β葡聚糖酶組成的復(fù)合體系可以用來促進(jìn)香菇發(fā)酵大豆粉過程中酚類抗氧化劑的形成[19]。

3.4 霧霾中萘的含量分布

李建平（2017）發(fā)現(xiàn)天津霧霾中萘的含量為0.12～0.22ng/m3[20]。何藝(2017)測(cè)定杭州某小吃街PM 2.5中多環(huán)芳烴未檢測(cè)到萘[12]，王茜(2016)測(cè)定唐山市區(qū)大氣PM2.5中18種PAH s也未檢測(cè)到萘[21]。常君瑞 (2016)研究北京某地PM2.5中萘濃度為0.02～0.15 ng/m3[22]。江陽(2015)研究成都市不同區(qū)域的空氣中在11月、12月和1月的霧霾中萘的含量為0.26～2.26 ng/m3[23]。彭希瓏（2009）發(fā)現(xiàn)冬季廣州市越秀區(qū)某小學(xué)霧霾中萘的平均含量為0.652ng/m3[24]。彭希瓏(2009)研究南昌市區(qū)霧霾成分,未檢出萘[25]。高少鵬（2006）發(fā)現(xiàn)北京市某鋼鐵廠和焦化廠附近空氣中16種EPA優(yōu)控多環(huán)芳烴(PAH s)污染情況嚴(yán)重[26]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)高效液相檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適條件為流速1.0 m L/m i n，溫度30℃，波長(zhǎng)210nm，甲醇和水相之間的比為75∶25;然后再用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化香菇粗酶液降解霧霾中萘的條件參數(shù)，結(jié)果為溫度35℃,pH值4.0,處理時(shí)間10h,加入酶的量5m L；降解前霧霾中的萘含量為0.217494ng·m-3，降解后萘含量為2.08±2.95(pg·m-3)，降解率達(dá)到 99.04% 。

[1]王鼎.香菇漆酶優(yōu)化培養(yǎng)[D].[武漢]:武漢工程大學(xué),2009.

[2]江凌,吳海珍,韋朝海,等.白腐菌降解木質(zhì)素酶系的特征及其應(yīng)用[J].化工進(jìn)展,2007,26(2):198-203.

[3]池玉杰,伊洪偉.木材白腐菌分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)-錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶催化分解木質(zhì)素的機(jī)制 [J].菌物學(xué)報(bào),2007,26(1):153-160.

[4]李建糧,陳宏義,葛敏俊.霧霾現(xiàn)象及其定義的探討[C].浙江省臺(tái)州市:浙江省臺(tái)州市氣象局,2014:1-6.

[5]程春英,尹學(xué)博.霧霾之PM_(2.5)的來源、成分、形成及危害[J].大學(xué)化學(xué),2014,(5):1-6.

[6]柴靜雯，陳玉浩，孫文監(jiān)，付寶華，邵志良，馮文德.長(zhǎng)期萘接觸對(duì)人體的危害及中毒診斷指標(biāo)研究[J].衛(wèi)生研究,1994,23(2):113-115.

[7]柴靜雯,陳玉浩,李成昌.職業(yè)性慢性萘暴露對(duì)人體危害的研究[J].職業(yè)與健康,2000,16(4):1-4.

[8]吳少敏,張雅芝,殷博昊.高效液相色譜的使用與維護(hù)[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué),2011,14(3):183-186.

[9]曾令權(quán).高效液相色譜柱使用心得[J].黑龍江醫(yī)藥,2013,26(1):96.

[10]鄭偉,孫東方.高效液相色譜柱的選擇、使用與維護(hù)[J].口腔護(hù)理用品工業(yè),2011,21(6):37-39.

[11]Ahmed M,Guo X,Zhao X.Application of Simple μLtrasonic Assisted Extraction Coupled with Hplc and Gc/ms for the Determination of Surface Active Compounds in Atmospheric ParticμLate Matter[J].Microchemical Journal,2017,130(1):400-411.

[12]何藝,馮濤.固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定PM2.5中多環(huán)芳烴[J].山西化工,2017,167(1):38-40,44.

[13]蒲彥利,張春玲,薛淵,等.PM_(2.5)中16種多環(huán)芳烴的高效液相色譜測(cè)定法[J].職業(yè)與健康,2016,?32(24):3349-3352,3358.

[14]Buswell JA,Cai Y,Chang S.Effect of Nutrient Nitrogen and Manganese on Manganese Peroxidase and Laccase Production By LentinμLa(lentinus)Edodes[J].Fems Microbiology Letters,1995,128(1):81-87.

[15]Hatvani N,Mécs I.Production of Laccase and Manganese Peroxidase By Lentinus Edodes on Malt-containing By-product of the Brewing Process[J].Process Biochemistry,2001,37(5):491-496.

[16]葉漢玲,王傳槐,John A.Buswel.新鮮香菇子實(shí)體漆酶的純化與性質(zhì)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1997,21(2):52-55.

[17]張玉,洪楓.優(yōu)化培養(yǎng)條件對(duì)提高香菇漆酶產(chǎn)量的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2006,26(2):74-78.

[18]孫瑞雪,楊萍,劉琦,等.虎皮香菇漆酶的發(fā)酵優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā),2015,36(21):156-161.

[19]Mccue P,Horii A,Shetty K.Mobilization of Phenolic Antioxidants From Defatted Soybean Powders By Lentinus Edodes During Solidstate Bioprocessing1 Is Associated with Enhanced Production of Laccase[J].Innovative Food Scienceamp;Emerging Technologies,2004,5(3):385-392.

X172；S828.45

A

1006-4907（2017）05-0038-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.05.018

周孟清（1976～），男，湖南長(zhǎng)沙人，講師，主要研究方向:飼料資源和添加劑開發(fā)，E-mail:zhoumq2005@163.com。

2017-08-10