SSR分子標(biāo)記鑒定栽培茄與野生茄雜種F1研究

楊 旭，劉 飛，霍秋月，張 宇，成玉富

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

SSR分子標(biāo)記鑒定栽培茄與野生茄雜種F1研究

楊 旭，劉 飛，霍秋月，張 宇，成玉富

（揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)鑒定作物雜種真實(shí)性及茄子種間雜交研究具有重要意義。文章以16份茄子雜交材料及其親本為試驗(yàn)材料，參考茄子基因組，以SSR分子標(biāo)記技術(shù)為鑒定手段，鑒別茄子雜交材料真?zhèn)?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2對(duì)SSR引物（emg01J09和emh21J12）可用于試驗(yàn)材料雜交種真實(shí)性檢測(cè)，與田間鑒定結(jié)果一致。研究表明，SSR分子標(biāo)記可應(yīng)用于栽培茄與野生茄雜種鑒定，可及時(shí)排除假雜種，減少后期試驗(yàn)工作量，準(zhǔn)確驗(yàn)證雜交結(jié)果。該技術(shù)對(duì)雜種后續(xù)研究及茄子品種改良具有應(yīng)用價(jià)值。

茄子；種間雜交；SSR分子標(biāo)記；鑒定

茄子（Solanum melongena L.）是暖季蔬菜作物， 茄子生產(chǎn)易遭受病蟲(chóng)危害，出現(xiàn)黃萎病（Verticillium wilt）、根結(jié)線蟲(chóng)（Nematodes）等。劉富中等研究表明，茄子野生資源中具有多種優(yōu)良抗性基因[1]，赤茄（S.aethiopicum L.）對(duì)青枯病具有抗性[2]；喀西茄（S.khasianum L.）和刺天茄（S.indicum L.）對(duì)小葉、嫩芽和果實(shí)蛀蟲(chóng)具有抗性[3-4]；托魯巴姆（S.torvum L.）和刺天茄（S.indicum L.）對(duì)黃萎病有抗性[5]。茄子野生種質(zhì)是砧木材料、抗病蟲(chóng)害材料和抗逆性材料重要來(lái)源，也是茄子新品種變異來(lái)源，可改善茄子品質(zhì)、提高產(chǎn)量[6]。

為實(shí)現(xiàn)栽培品種改良，Behera等研究表明可以通過(guò)多種方法將抗性基因?qū)朐耘嗲裑7]，Daunay等認(rèn)為種間雜交是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的重要途徑[8]。由于種間雜交存在雜交障礙，檢測(cè)雜種F1真實(shí)性十分重要。本研究通過(guò)SSR（微衛(wèi)星DNA）分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定茄子栽培種與野生種雜種F1真實(shí)性，篩選有效SSR引物，為雜種后續(xù)研究及創(chuàng)制雜種優(yōu)勢(shì)種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記后發(fā)展的理想遺傳標(biāo)記形式，以蛋白質(zhì)和核酸分子突變?yōu)榛A(chǔ)，檢測(cè)研究對(duì)象遺傳結(jié)構(gòu)與變異現(xiàn)象。DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、簡(jiǎn)單快速和限制因素（組織類(lèi)別、發(fā)育階段、環(huán)境影響）少等優(yōu)點(diǎn)，第二代分子標(biāo)記技術(shù)中SSR標(biāo)記手段已廣泛應(yīng)用于基因定位及克隆、作物育種、親緣分析與品種鑒定等領(lǐng)域及純合體和雜合體鑒定。SSR（微衛(wèi)星DNA）是一類(lèi)由幾個(gè)（多為1～5個(gè)）堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)DNA序列，串聯(lián)數(shù)目不同決定SSR高度多態(tài)性，不同材料重復(fù)次數(shù)不同，PCR反應(yīng)根據(jù)差異核心序列重復(fù)數(shù)目擴(kuò)增不同長(zhǎng)度PCR產(chǎn)物，檢測(cè)DNA多態(tài)性[9]。

茄子種間雜交研究，目前主要集中于如何獲得野生茄×栽培茄雜交種，劉園研究不同授粉方式對(duì)茄子遠(yuǎn)緣雜交影響，發(fā)現(xiàn)重復(fù)授粉法和破壞柱頭法能克服遠(yuǎn)緣雜交親本不親和性[10]。目前茄子雜種鑒定及其后續(xù)利用方面研究較少。現(xiàn)在主要集中于形態(tài)學(xué)鑒定、親本與雜種F1同工酶（POD，COD）分析及第一代分子標(biāo)記RAPD檢測(cè)等方面[11-13]，形態(tài)學(xué)鑒定方法影響雜種鑒定和后續(xù)育種工作效率，同時(shí)形態(tài)指標(biāo)主觀判定也存在人為誤差；同工酶（POD，COD）分析方法在鑒定過(guò)程中可能受非生物脅迫等因素限制。隨著分子標(biāo)記技術(shù)日益成熟，第二代乃至帶三代分子標(biāo)記相繼開(kāi)發(fā)。

目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于番茄[14]、辣椒[15]、馬鈴薯[16]、甜瓜[17]、水稻[18]及大豆[19]等雜交種真實(shí)性和純度鑒定及指紋圖譜標(biāo)記等，研究表明SSR分子標(biāo)記鑒定雜種真實(shí)性具有可靠性，且檢測(cè)時(shí)間短，為后續(xù)工作提供技術(shù)支撐和決策依據(jù)，減少假雜種造成經(jīng)濟(jì)損失和育種失誤。Nunome等發(fā)表236對(duì)SSR標(biāo)記引物[20]，為開(kāi)發(fā)高效SSR標(biāo)記引物，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)栽培茄與野生茄雜交F1代雜種真實(shí)性鑒定提供可能，對(duì)雜種后續(xù)研究及茄子品種改良具有參考作用。

本研究以10份常見(jiàn)栽培茄為母本，5份具有優(yōu)良抗性野生茄為父本，參照文獻(xiàn)[13]方法，以雜交獲取16份雜交組合種子為鑒定材料，引物序列來(lái)源于Nunome等公開(kāi)發(fā)表236對(duì)SSR標(biāo)記引物[20]，結(jié)合課題組前期研究茄子種質(zhì)資源遺傳多樣性篩選的SSR引物為擴(kuò)增材料，通過(guò)7對(duì)多態(tài)性較好SSR引物作DNA產(chǎn)物PCR擴(kuò)增[21]，解決不同物種間共用SSR引物造成盲目性大、費(fèi)時(shí)費(fèi)力和操作理論依據(jù)不足等問(wèn)題。通過(guò)SSR分子標(biāo)記分析雜種F1真實(shí)性，為茄子種間雜交提供驗(yàn)證方法，為提高茄子雜交品種選育質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

16份栽培茄與野生茄雜交種F1，10份母本材料（栽培茄）和5份父本材料（野生茄）種子均由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院提供（見(jiàn)表1，2）。

備選多態(tài)性較好的7對(duì)SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見(jiàn)表3）。

PCR擴(kuò)增過(guò)程所需Taq酶、10×Buffer和dNTP購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 茄子抗病蟲(chóng)害野生種質(zhì)資源Table 1 Sources of resistance against diseases and pests in wild species of eggplant

表2 16份茄子雜種組合基本情況Table2 Basic situation of sixteen eggplant hybrid combinations

表3 7對(duì)多態(tài)性SSR引物序列Table 3 Seven pairs of polymorphic SSR primer sequences

1.2 方法

1.2.1 材料

2016年選擇10份栽培茄為母本，與5份優(yōu)良抗性野生茄為父本雜交，設(shè)計(jì)多個(gè)雜交組合，并以5：2（栽培種：野生種）比例種植，每份母本材料種植10株。以雜種植株坐果率、單果種子數(shù)、F1代種子發(fā)芽率以及父本野生茄花粉活力確定種間雜交可交配性，其中16種組合可交配性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。2017年4月對(duì)母本、父本和16份雜交種F1種子55℃浸種催芽，在揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地穴盤(pán)育苗，待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)采集植株葉片，樣品于-80℃保存。其余幼苗種植于實(shí)驗(yàn)基地大棚。

1.2.2 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

所有試驗(yàn)槍頭和容器均高壓滅菌鍋滅菌，采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒作親本和F1植株葉片DNA提取，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，取5 μL DNA溶液和1 μL 6×Loading Buffer充分混勻后快速點(diǎn)樣于1.0%瓊脂糖凝膠中，30 min后紫外透射儀觀察并拍照，優(yōu)良DNA樣品于-20℃冰箱保存。

1.2.3 SSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序

對(duì)提取基因組DNA建立10 μL SSR反應(yīng)體系：6.7 μL ddH2O，1.0 μL 10×PCR Buffer，0.2 μL dNTPs，1.0 μL 引物，0.1 μL rTaq聚合酶、1.0 μL DNA模板。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀中基因擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性5 min，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃充分延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)聚丙烯酰胺凝膠反應(yīng)。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳下檢測(cè)，每個(gè)樣品取 1.4 μL 和 0.7 μL 6×Loading Buffer混合點(diǎn)樣，以DL500 DNA Maker為對(duì)照，在180V恒壓下，電泳1.5 h。電泳結(jié)束后銀染：先放入固定液（2.5 mL冰醋酸+95%乙醇55 mL+450 mL蒸餾水）中輕搖2～3 min；在0.2%AgNO3染色液中輕晃3～5 min；取出后蒸餾水中漂洗2～3次，每次時(shí)間不超過(guò)15 s；最后于顯影液中（7.5 g NaOH+ 2 mL甲醛+500 mL蒸餾水）輕輕搖晃，直至條帶出現(xiàn)。觀察后拍照作條帶分析。

1.2.5 雜種鑒定

對(duì)于共顯性標(biāo)記SSR分子標(biāo)記，在雜交后代擴(kuò)增產(chǎn)物中，通過(guò)比較親本與雜種PCR擴(kuò)增條帶，雜種F1具有父母本互補(bǔ)型或父本型條帶，鑒定為真雜交種，反之僅有母本型條帶鑒定為假雜交種。

1.2.6 田間形態(tài)學(xué)觀察

其余幼苗種植于揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地大棚，待茄子到成熟期，調(diào)查茄子田間農(nóng)藝性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征型引物篩選

本研究利用多態(tài)性較好7對(duì)SSR引物作多態(tài)性篩選，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染，獲得7對(duì)SSR引物擴(kuò)增條帶，其中2對(duì)SSR引物（emg01J09和emh21J12）在親本與雜種中擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定特異性條帶，其余5對(duì)SSR引物擴(kuò)增條帶較模糊。研究引物emg01J09和emh21J12擴(kuò)增出親本與雜種條帶大小、特征型，分析雜種F1真實(shí)性。

2.2 雜種F1鑒定分析

利用emg01J09對(duì)雜交組合eH6、eH7、eH8、eH9、eH10、eH11、eH12、eH13、eH14、eH15、eH16及親本作譜帶特征分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150～200bp，鑒定出西安綠茄、 迷你茄、 蘇牛角、14c-28和14c-30與野生茄雜交雜種F1真實(shí)性（見(jiàn)圖 1a）；emh21J12對(duì)雜交組合 eH1、eH2、eH3、eH4、eH5及親本作譜帶特征分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為330～340 bp，鑒定出L146、L161、L162、L165和L171與野生茄雜交雜種F1真實(shí)性（見(jiàn)圖1b）。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳可見(jiàn)，eH1表現(xiàn)出母本L146帶型，eH11表現(xiàn)母本14c-30帶型，eH12帶型存在不穩(wěn)定性，認(rèn)定eH1、eH11和eH12為 假 雜 種 ； 而 eH2、 eH3、 eH4、 eH6、 eH7、eH9、eH14、eH15和eH16顯示出父母本互補(bǔ)帶型，eH5、eH8、eH10和eH13顯示為父本帶型，出現(xiàn)父母本型或父本型兩種帶型F1認(rèn)定為真雜種。通過(guò)對(duì)SSR引物擴(kuò)增條帶分析，結(jié)果表明，eH1、eH11和eH12在SSR分子標(biāo)記鑒定下，為假雜種；而其余13份雜交種（eH2、eH3、eH4、eH5、 eH6、 eH7、 eH8、 eH9、 eH10、 eH13、eH14、eH15、eH16）在SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果均為真雜種，圖中以箭頭標(biāo)注。

圖1 引物emg01J09和emh21J12對(duì)茄子各雜種及父母本擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SSR bands amplified with primer emg01J09 and emh21J12 from eggplant hybrids and parents

2.3 SSR擴(kuò)增帶型分析

通過(guò)emg01J09和emh21J12引物擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定出13份真雜交種，其中父母互補(bǔ)帶型9個(gè)（eH2、eH3、eH4、eH6、eH7、eH9、eH14、eH15和 eH16），父本帶型 4個(gè)（eH5、eH8、eH10和eH13）。在雜交后代中，擴(kuò)增譜帶消失或出現(xiàn)新增譜帶，可能是在配子體形成過(guò)程中，染色體減數(shù)分裂中同源染色體發(fā)生配對(duì)與交換、染色體復(fù)制過(guò)程中堿基發(fā)生突變等，證明雜交可使作物后代發(fā)生豐富變異。

2.4 田間性狀調(diào)查結(jié)果

通過(guò)調(diào)查雜交種和親本植株農(nóng)藝性狀，參照文獻(xiàn)[22]方法，觀察種植在實(shí)驗(yàn)基地的種間F1雜種及其親本植株生長(zhǎng)發(fā)育情況，主要性狀有：葉刺、葉色、葉脈色、莖刺、莖色、花序、花色和花萼色等。其中，eH3、eH8和eH13父本均為赤茄，在雜種植株有無(wú)刺性狀方面，eH8和eH13更近似于父本赤茄；eH4和eH5父本均為紅茄，在雜種植株農(nóng)藝性狀方面，eH5葉色和花色更接近于父本紅茄，結(jié)果與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果相近。

通過(guò)比對(duì)親本與雜交種形態(tài)學(xué)性狀，鑒定出13份真雜種和3份假雜種，與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致，列出真雜交種及其親本形態(tài)學(xué)性狀（見(jiàn)表4）。

表4 真雜交種及其親本形態(tài)學(xué)性狀Table 4 Morphological traits of true hybrids and their parents

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)茄子雜種真實(shí)性鑒定方法以田間形態(tài)學(xué)鑒定為主，但易受田間環(huán)境影響，周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜，存在一定局限性[23]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜種真實(shí)性鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、基因克隆和物種親緣關(guān)系等方面應(yīng)用廣泛。韓小霞等利用SSR分子標(biāo)記鑒定南瓜雜種純度[24]；石星星等利用SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)球甘藍(lán)雜種真實(shí)性[25]；朱駿馳等則采用SSR分子標(biāo)記鑒定葡萄F1代雜種[26]。Nunome等公開(kāi)發(fā)表236對(duì)SSR標(biāo)記引物，本研究利用茄子基因組文庫(kù)開(kāi)發(fā)SSR引物，結(jié)合SSR分子標(biāo)記方法，鑒定茄子種間雜種并獲得真雜種，與王艷娜等茄子雜種研究結(jié)論一致[27]。張敏等和潛宗偉等在茄子雜種鑒定中，分別于100對(duì)SSR引物中發(fā)現(xiàn)2對(duì)，152對(duì)SSR引物中發(fā)現(xiàn)2對(duì)可以用于雜交種子純度鑒定[28-29]。本試驗(yàn)在茄子基因組基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)7對(duì)SSR引物發(fā)現(xiàn)，2對(duì)快速有效鑒定雜種。劉軍等發(fā)現(xiàn)2對(duì)SSR引物可用于栽培茄雜交種鑒定[30]，張洪源等研究表明，8對(duì)引物可鑒定雜交種純度[31]。本研究篩選出多態(tài)性較好SSR引物在雜種鑒定上具有高效性和針對(duì)性，能夠可靠、準(zhǔn)確鑒定真雜交種。

本研究利用7對(duì)SSR多態(tài)性標(biāo)記鑒定15個(gè)親本及其16份雜交種，以區(qū)分真假雜種。在實(shí)際應(yīng)用中，emg01J09和emh21J12可擴(kuò)增出全部條帶，用于野生茄和栽培茄雜交種鑒定。在利用分子標(biāo)記鑒定時(shí)，引物選擇至關(guān)重要。另外，從親本和雜交種條帶上看，多數(shù)雜種條帶偏向于父母互補(bǔ)帶型，部分雜種條帶偏向于父本帶型，研究結(jié)果呈父母互補(bǔ)帶型：父本帶型=9：4，與謝文剛等在鴨芽雜交種SSR分子鑒定中父母互補(bǔ)帶型：父本帶型=4：3（80：60）一致[32]，證明本試驗(yàn)可靠性。

本研究運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，在雜種F1苗期即可鑒定種子真實(shí)性，及時(shí)排除假雜種，減少后期試驗(yàn)，準(zhǔn)確驗(yàn)證雜交結(jié)果，為雜種后續(xù)研究提供依據(jù)同時(shí)，有利于推進(jìn)茄子品種改良研究。后續(xù)研究中，可運(yùn)用SSR標(biāo)記對(duì)材料在非生物脅迫處理下相關(guān)性狀作關(guān)聯(lián)分析[33]，進(jìn)一步通過(guò)ISSR分析方法對(duì)優(yōu)良抗性茄子種質(zhì)資源作相關(guān)遺傳研究[34]。

采用SSR分子標(biāo)記方法，鑒定栽培茄與野生茄雜交獲得16個(gè)雜交組合的雜交種，鑒定出13份真雜種（eH2、eH3、eH4、eH5、eH6、eH7、eH8、eH9、eH10、eH13、eH14、eH15、eH16）和3份假雜種（eH1、eH11、eH12），并且田間形態(tài)學(xué)和SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果一致。

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Identification of interspecific F1hybrid betweenSolanum melongena and wild relatives by using SSR molecular marker technology/

YANG Xu,
LIU Fei,HUO Qiuyue,ZHANG Yu,CHENG Yufu
(School of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Yangzhou Jiangsu 225009,China)

SSR molecular marker technology has the advantages of identificating the authenticity of crop hybrids,which is of great significance to intergeneric hybridization in eggplant.In this study,16 eggplant hybrid materials and their parents were used as experimental materials.Based on the genome of eggplant,SSR molecular marker technique was used to identify the true and false species of eggplant hybrids.The results showed that two pairs of SSR primers(emg01J09 and emh21J12)could be used to confirm the hybrids of the tested materials and the results were consistent with the field identification results.Our study showed that SSR molecular markers could be effectively used in the identification of cultivated and wild eggplant hybrids,so as to accurately confirm the hybridization,eliminate the fake hybrids and reduce the post-trial workload.The application of this technology will have a positive effect on the follow-up study of hybrids and the improvement of eggplant varieties.

eggplant;interspecific hybridization;SSR molecular marker;identification

S641.1

A

1005-9369（2017）10-0020-08

楊旭,劉飛,霍秋月,等.SSR分子標(biāo)記鑒定栽培茄與野生茄雜種F1研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(10)：20-27.

Yang Xu,Liu Fei,Huo Qiuyue,et al.Identification of interspecific F1hybrid betweenSolanum melongenaand wild relatives by using SSR molecular marker technology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(10)：20-27.(in Chinese with English abstract)

2017-07-08

江蘇省“六大人才高峰”高層次人才選拔培養(yǎng)資助項(xiàng)目（2015-NY-020）

楊旭（1974-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail：yangxu@yzu.edu.cn