水稻谷氨酰胺合成酶同工型基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)關(guān)系分析

金正勛，李 丹，李明月，同拉嘎，潘 冬，張玉磊，王海微，韓云飛，張忠臣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

水稻谷氨酰胺合成酶同工型基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)關(guān)系分析

金正勛，李 丹，李明月，同拉嘎，潘 冬，張玉磊，王海微，韓云飛，張忠臣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

研究選用籽粒蛋白質(zhì)含量差異顯著的5個(gè)品種（系），比較分析品種間GS同工型基因在灌漿過(guò)程中籽粒和葉片表達(dá)特性及啟動(dòng)子序列與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。結(jié)果表明，不同品種間OsGS同工型基因表達(dá)量差異顯著；OsGS1;1和OsGS1;2基因在籽粒和葉片中大量表達(dá)；OsGS1;3和OsGS2基因分別僅在籽粒和葉片中大量表達(dá)；在灌漿過(guò)程中籽粒和葉片中OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量均呈單峰曲線變化，灌漿前期mRNA表達(dá)量平穩(wěn)升高，中期出現(xiàn)峰值，后期快速降低，且高蛋白質(zhì)含量品種mRNA表達(dá)量高于低蛋白質(zhì)含量品種。籽粒蛋白質(zhì)含量差異顯著品種間OsGS同工型基因啟動(dòng)子序列同源性高達(dá)99%以上；品種間有性雜交子代OsGS同工型基因啟動(dòng)子序列可發(fā)生堿基變化，但啟動(dòng)子核心元件無(wú)變化。在調(diào)控元件數(shù)量和功能上OsGS同工型基因啟動(dòng)子保守性很強(qiáng)，啟動(dòng)子在結(jié)構(gòu)和功能上不易發(fā)生遺傳變異，籽粒OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量變化受OsGS基因啟動(dòng)子調(diào)控影響較小。

水稻；超親變異系；谷氨酰胺合成酶基因；轉(zhuǎn)錄表達(dá)；啟動(dòng)子序列

谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）為調(diào)控籽粒蛋白合成關(guān)鍵酶之一，與植物中GS活性、GS基因表達(dá)量及其蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)[1]。Bernard等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)沉默油菜GS2基因后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜蛋白質(zhì)含量顯著下降[2]。在GS1基因過(guò)表達(dá)楊樹(shù)植株中發(fā)現(xiàn)葉總可溶性蛋白質(zhì)含量增加[3-4]。GS在水稻中有2個(gè)同工型酶，即GS1和GS2，其中GS1由OsGS1;1,OsGS1;2和 OsGS1;3基因共同編碼[5]，而GS2僅一個(gè)成員OsGS2。

基因啟動(dòng)子中含基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控元件，啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)變異可能引起啟動(dòng)子活性和功能變化，影響下游結(jié)構(gòu)基因mRNA水平變化。近年研究通過(guò)克隆基因啟動(dòng)子序列，分析不同材料間啟動(dòng)子活性差異原因。GS基因表達(dá)調(diào)控始于GS啟動(dòng)子[6]。Cai等研究表明，轉(zhuǎn)GS1啟動(dòng)子植株葉片中GS活性及可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高[7]。Takaiwa等通過(guò)克隆2.3和1.3 kb GluB-1啟動(dòng)子片段，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)模式相似，但前者活性為后者10倍，2.3 kb啟動(dòng)子中存在一個(gè)或多個(gè)ACGT基序[8]。

品種間有性雜交是選育新品種主要途徑，稻米籽粒中蛋白質(zhì)含量是影響蒸煮食味品質(zhì)重要內(nèi)在因素之一。然而，有關(guān)品種間有性雜交后代結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子堿基序列變異與其轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間關(guān)系研究較少。因此，本研究選用籽粒蛋白含量較高秈稻品種馬尾占及遺傳背景相似但籽粒蛋白質(zhì)含量差異顯著粳稻親本和雜交子代為供試材料，分析水稻灌漿過(guò)程中GS基因mRNA表達(dá)特性及其與GS啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)變化間關(guān)系，旨在深入了解GS基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控關(guān)系，為解析基因分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用籽粒蛋白質(zhì)含量差異顯著五個(gè)水稻品種（系），即親本系選1號(hào)和通769及子代穩(wěn)定品系東農(nóng)1601和東農(nóng)1624及秈稻品種馬尾占，其籽粒蛋白質(zhì)含量分別為9.52%、8.24%、7.81%、10.18%、14.50%。2016年在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院開(kāi)展盆栽試驗(yàn)，盆規(guī)格為長(zhǎng)60 cm×寬40 cm×高40 cm。為使抽穗期盡量一致，4月初按供試材料生育期分期播種，大缽體育秧盤，每穴播催芽籽3粒，大棚旱育秧管理，5月中旬選取長(zhǎng)勢(shì)一致秧苗等距離插秧，每個(gè)品種插4盆，每盆插8穴，每穴插3棵，正常水肥管理。

取樣方法參照文獻(xiàn)[9]，抽穗時(shí)以穗部抽出葉鞘3 cm為準(zhǔn)掛牌標(biāo)記抽穗日期，分別在抽穗后10、20、30 d取同一天抽穗和劍葉，取劍葉中間部分5 cm，籽粒取灌漿程度基本一致的穗中部籽粒，低溫去穎殼，葉片和籽粒迅速放入液氮冷凍處理，-80℃保存，用于熒光定量分析。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與qRT-PCR擴(kuò)增

取-80℃冰箱中葉片和籽粒，采用Trizol法分別提取總RNA，加入RNase-free DNase I消除基因組DNA污染，NOVA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Nova，購(gòu)自江蘇愚公生命科技有限公司）合成cDNA。根據(jù)NCBI公布GS基因序列及RNA序列，OsGS1;1（GeneBank：AK109397）、OsGS1;2（GeneBank：AB180688.1）、OsGS1;3（GeneBank：AK063913）及 OsGS2（Gene-Bank：AK065491），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qRTPCR引物（見(jiàn)表1），NCBI網(wǎng)站上作Blast比對(duì)，保證引物專一性。以cDNA為模板，UBI5為內(nèi)參基因，參照Taq SYBR?Green qPCR試劑盒作qRT-PCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次。參照基因ΔCT法[10]，依據(jù)公式 ΔCT = 2Ct（reference）-Ct（target）計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。其中，Ct（reference）和Ct（target）分別為內(nèi)參基因表達(dá)量和目標(biāo)基因達(dá)到設(shè)定熒光值時(shí)擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。采用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 啟動(dòng)子克隆與載體構(gòu)建

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和載體QBV-3由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。PrimeSTAR?HS DNA Ploymerase、 DL 5000 DNA Marker vector、EcoR V限制性核酸內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程有限公司；ClonExpress?ⅡOne Step Cloning Kit購(gòu)自中國(guó)哈爾濱諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。使用方法參照產(chǎn)品說(shuō)明。采用改良酚抽提法提取水稻葉片基因組DNA。在國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/index.htm）查找OsGS基因，獲取其基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引入EcoR V酶切位點(diǎn)（見(jiàn)表1）。

參照Primer STAR HS DNA Polymerase說(shuō)明書作PCR特異性擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：5× PrimeSTAR Buffer（Mg2+Plus） 4.0 μL， dNTP Mixture（2.5 mmmol· L-1each）1.6 μL， Forward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，DNA模板 1.0 μL，Primer STAR HS DNA Polymerase（2.5 U·μL-1）0.2 μL，滅菌超純水 11.6 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃ 10 s；65℃ 10 s；72℃ 2 min，作30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，最后16℃保溫 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上分離，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收目的片段通過(guò)克隆試劑盒連接到克隆載體pQBV-3，用熱激法將構(gòu)建克隆載體pQBV-3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布在含有氯霉素（25 μg·mL-1）LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16～20 h。挑取LB培養(yǎng)基上單克隆作PCR鑒定。鑒定出陽(yáng)性克隆活化搖菌，提取質(zhì)粒，將部分質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序。

利用 NCBI在線比對(duì)工具 Blast對(duì)所得序列作同源性分析。PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析啟動(dòng)子序列中潛在順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌漿不同時(shí)期葉片和籽粒谷氨酰胺合成酶同工型基因mRNA表達(dá)量比較

由表2可知，OsGS1;1和OsGS1;2在籽粒和葉片中表達(dá)量均較大，OsGS1;3和 OsGS2分別僅在籽粒和葉片中表達(dá)，不同組織中OsGS基因表達(dá)水平差異顯著。蛋白質(zhì)含量差異顯著的5份供試材料，谷氨酰胺合成酶同工型基因mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，4個(gè)同工型基因在水稻灌漿進(jìn)程中呈單峰曲線變化，隨灌漿進(jìn)程mRNA表達(dá)量逐 漸升高，達(dá)到峰值后快速下降，峰值出現(xiàn)在灌漿中期。

在灌漿過(guò)程中，5份供試材料籽粒中OsGS1;3基因mRNA表達(dá)量分別較同時(shí)期OsGS1;1和OsGS1;2高；在葉片中OsGS2基因mRNA表達(dá)量分別較同時(shí)期OsGS1;1和OsGS1;2高，說(shuō)明OsGS1;3基因主要在籽粒中表達(dá)，OsGS2基因主要在葉片中表達(dá)。

表2 灌漿不同時(shí)期谷氨酰胺合成酶同工型基因mRNA表達(dá)量比較Table 2 Expression comparison of glutamine synthase gene mRNA in different stages of grain filling

此外，灌漿中期籽粒蛋白質(zhì)含量最高的秈稻品種馬尾占籽粒3個(gè)GS同工型基因和葉片OsGS1;2與OsGS2基因mRNA表達(dá)量均顯著或極顯著高于其他4個(gè)供試材料。蛋白質(zhì)含量差異顯著的4個(gè)品種，在灌漿中期，高蛋白親本系選1號(hào)及子代東農(nóng)1624的OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量均顯著或極顯著高于低蛋白質(zhì)親本通769及子代東農(nóng)1601，并且高蛋白子代東農(nóng)1624 mRNA表達(dá)量顯著高于高蛋白親本系選1號(hào)，而低蛋白子代東農(nóng)1601 mRNA表達(dá)量顯著低于低蛋白親本通769。說(shuō)明在籽粒灌漿過(guò)程中OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量與籽粒蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)，籽粒蛋白質(zhì)含量高品種其OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量也高，可產(chǎn)生超親變異。

2.2 供試材料GS同工型基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度比較

以5個(gè)供試材料基因組DNA為模板，利用引物P1/P2、P3/P4、P5/P6、P7/P8分別擴(kuò)增OsGS同工型基因啟動(dòng)子，獲得與預(yù)期片段大小相近條帶（見(jiàn)圖1）。由表3可知，系選1號(hào)、通769、東農(nóng)1601、東農(nóng)1624、馬尾占等5個(gè)供試材料OsGS1;1基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度均為1 977 bp，OsGS1;2基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1 812～1 814 bp，OsGS1;3基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1 547～1 548 bp，OsGS2基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1 837～1 847 bp。

圖1 OsGS1;1、OsGS1;2、OsGS1;3和OsGS2基因啟動(dòng)子序列的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of OsGS1;1、OsGS1;2、OsGS1;3 and OsGS2 promoter sequence

表3 供試材料間OsGS同工型基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度比較Table 3 Length comparison of OsGS promoter gene between the tested materials

2.3 供試材料OsGS同工型基因啟動(dòng)子序列比較

不同供試材料OsGS1;1、OsGS1;2、OsGS1;3、OsGS2基因啟動(dòng)子序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中日本晴OsGS基因啟動(dòng)子序列比對(duì)（見(jiàn)表4）。在系選1號(hào)、通769、東農(nóng)1601和東農(nóng)1624中OsGS1;1基因啟動(dòng)子序列與日本晴完全一致，但馬尾占有11個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化；系選1號(hào)、通769和東農(nóng)1601品種其OsGS1;2基因啟動(dòng)子序列與日本晴完全一致，而東農(nóng)1624和馬尾占品種的啟動(dòng)子序列分別有2個(gè)和3個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化；OsGS1;3基因啟動(dòng)子中僅馬尾占有1個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化，其他品種均無(wú)變化；在OsGS2基因啟動(dòng)子中馬尾占有5個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化，而系選1號(hào)有2個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化，通769有3個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化，東農(nóng)1601和東農(nóng)1624僅1個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生變化。用PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各材料不同基因啟動(dòng)子元件發(fā)現(xiàn)，上述個(gè)別位點(diǎn)堿基變化并未改變啟動(dòng)子調(diào)控元件功能，說(shuō)明水稻有性雜交子代OsGS基因啟動(dòng)子序列雖然發(fā)生個(gè)別位點(diǎn)堿基變化，但啟動(dòng)子調(diào)控元件功能保守性較強(qiáng)。

2.4 供試材料OsGS同工型基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)比較

本試驗(yàn)通過(guò)比較不同材料中4種OsGS同工型基因ATG上游約2 000 bp序列中順式作用元件差異，歸納不同OsGS同工型基因啟動(dòng)子中重要順式作用元件數(shù)目，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，在4個(gè)GS同工型基因啟動(dòng)子中均含有TATA-box、CAAT-box、光響應(yīng)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、水楊酸響應(yīng)元件和胚乳表達(dá)相關(guān)元件、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件等核心元件，且供試品種間核心元件數(shù)目無(wú)差異，但不同基因啟動(dòng)子所含重要作用元件在數(shù)目上存在差異。4個(gè)同工型基因啟動(dòng)子含多個(gè)光響應(yīng)元件，其中OsGS1;2和OsGS1;3基因啟動(dòng)子分別含有4個(gè)和3個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)，而OsGS1;1和OsGS2基因啟動(dòng)子僅含1個(gè)；OsGS1;1、OsGS1;2和OsGS1;3基因啟動(dòng)子均含有水楊酸響應(yīng)元件；OsGS1;1、OsGS1;2、OsGS1;3和OsGS2基因啟動(dòng)子均含有胚乳表達(dá)相關(guān)元件和茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件，其中OsGS1;3基因啟動(dòng)子中含有5個(gè)與胚乳表達(dá)相關(guān)順式調(diào)控元件，包括2個(gè)GCN4 motif和 3 個(gè) Skn-1_motif， 而 OsGS1;1 含 有3個(gè)Skn-1_motif及1個(gè)GCN4 motif，OsGS1;2只含有3個(gè)Skn-1_motif，在OsGS2基因啟動(dòng)子中含有9個(gè)胚乳表達(dá)相關(guān)順式調(diào)控元件（1個(gè)GCN4 motif和8個(gè)Skn-1_motif），1個(gè)醇溶蛋白響應(yīng)元件，OsGS1;1和OsGS1;2基因中分別僅含有3個(gè)和4個(gè)胚乳表達(dá)相關(guān)元件，無(wú)醇溶蛋白響應(yīng)元件；OsGS1;2和OsGS1;3基因啟動(dòng)子均含有赤霉素響應(yīng)元件，OsGS1;1、OsGS1;3和OsGS2基因啟動(dòng)子均含有脫落酸響應(yīng)元件。OsGS1;1和OsGS1;2基因啟動(dòng)子含有晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)元件CAAATCCATC，OsGS1;2和OsGS1;3基因啟動(dòng)子含有高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件TTTCTTCTCT，OsGS1;2基因啟動(dòng)子含有特異性元件GATAATGATG，OsGS2基因啟動(dòng)子還含有乙烯響應(yīng)元件ATTTCAAA和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件AACGAC及葉形態(tài)發(fā)展調(diào)控元件CAAT(G/C)ATTG。說(shuō)明GS同工型基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)不完全一致，不同基因啟動(dòng)子在調(diào)控元件數(shù)量差異顯著，但不同品種間GS同工型基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)一致， GS同工型基因表達(dá)與多種環(huán)境因素有關(guān)。

表4 供試材料OsGS同工型基因啟動(dòng)子序列比較Table 4 Sequence comparison of OsGS promoter gene between the tested materials

表5 GS同工型基因啟動(dòng)子順式作用元件統(tǒng)計(jì)Table 5 Listing of the cis-trans elements on the promoters of glutamine synthetase genes in rice

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

OsGS同工型基因表達(dá)存在組織特異性，不同組織中OsGS基因表達(dá)水平之間差異顯著，且OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量與氮素利用效率和籽粒蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)。Tabuchi等研究發(fā)現(xiàn)，OsGS1;1在根和小穗等組織中均表達(dá)，OsGS1;2和OsGS1;3則主要在根和小穗中表達(dá)[11]。董芙榮等研究發(fā)現(xiàn)，OsGln1.1基因在穗和根系中均表達(dá)，且氮高效型品種OsGln1.1基因表達(dá)量高于氮低效型品種；OsGln1.2基因在葉片和根系中均表達(dá)，葉片中OsGln1.2基因表達(dá)量在氮高效型品種與氮低效型品種間差異不大，氮高效型品種OsGln1.2基因在根系中表達(dá)量高于氮低效型品種；OsGln2基因僅在莖稈中表達(dá)，氮高效型品種表達(dá)量高于氮低效型品種[12]。徐振華等發(fā)現(xiàn)，籽粒蛋白質(zhì)含量不同的親本及超親變異系子代在籽粒灌漿過(guò)程中OsGS1.3和OsGS2基因mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，mRNA表達(dá)量在灌漿過(guò)程中逐漸增加，至抽穗后15～20 d達(dá)到最高值后逐漸下降，OsGS1.3和OsGS2基因mRNA表達(dá)量與籽粒蛋白質(zhì)含量關(guān)系密切[13]。本試驗(yàn)結(jié)果與前人基本一致，在籽粒灌漿過(guò)程中OsGS同工型基因表達(dá)存在組織特異性，OsGS1;1和OsGS1;2基因在籽粒和葉片中均表達(dá)，OsGS1;3基因僅籽粒中表達(dá)，OsGS2基因僅葉片中表達(dá)；OsGS同工型基因在不同組織中表達(dá)水平差異顯著；氮素利用效率和籽粒蛋白質(zhì)含量不同品種OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量也存在差異，籽粒蛋白質(zhì)含量較高品種OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量較高。因此，調(diào)控OsGS同工型基因mRNA在水稻中表達(dá)有望干擾氮代謝及氮素積累，提高氮素利用效率，改善稻米品質(zhì)。

啟動(dòng)子為結(jié)構(gòu)基因5'UTR上游DNA序列，其區(qū)域中各種特征元件序列和結(jié)構(gòu)變異可影響基因表達(dá)水平變化。李俊等發(fā)現(xiàn)，不同材料Zm-NAS1基因啟動(dòng)子中多處單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可引起表達(dá)水平差異，而Zm-NAS2基因啟動(dòng)子在不同材料中序列較為保守[14]。王昊龍等發(fā)現(xiàn)10個(gè)抗性淀粉含量不同小麥品種（系）SBEⅡa基因編碼區(qū)上游2 896 bp序列相似性為99.92%，推測(cè)SBEⅡa基因啟動(dòng)子序列及結(jié)構(gòu)變化可能并非造成SBEⅡa基因表達(dá)差異主要原因[15]。孫曉紅等研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸變異引起順式作用元件種類和數(shù)量差異，引起基因表達(dá)量變化[16]。本研究與前人試驗(yàn)結(jié)果一致，籽粒蛋白質(zhì)含量不同的品種OsGS同工型基因啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度存在差異，有性雜交子代OsGS基因啟動(dòng)子序列與親本存在個(gè)別堿基差異，但不同品種OsGS同工型基因啟動(dòng)子調(diào)控元件數(shù)量和功能無(wú)變化。因此，本試驗(yàn)不同供試材料OsGS同工型基因mRNA表達(dá)量差異并非由啟動(dòng)子序列差異引起。另外，本研究分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)OsGS同工型基因啟動(dòng)子均含MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程中可能起重要作用，有待進(jìn)一步研究。

路靜等研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)通常至少需要兩種順式元件，且不同調(diào)控元件種類、數(shù)量、順序及距離可能影響轉(zhuǎn)錄起始與轉(zhuǎn)錄程度[17]。Wu等研究發(fā)現(xiàn)，不同水稻材料中編碼谷蛋白OsGluB基因啟動(dòng)子中均含有調(diào)控谷蛋白基因在胚乳中特異性表達(dá)GCN4-motif順式元件[18]。Yoshihara等研究發(fā)現(xiàn)，水稻中OsGluB基因啟動(dòng)子上游AACA和GCN4等兩個(gè)順式作用元件協(xié)同調(diào)控水稻谷蛋白基因特異性表達(dá)，當(dāng)GCN4單獨(dú)存在時(shí)只能增強(qiáng)啟動(dòng)子活性[19]。牟少亮等推測(cè)水稻Xa1基因啟動(dòng)子對(duì)MeJA具有強(qiáng)烈應(yīng)答特性與啟動(dòng)子區(qū)2個(gè)MeJA應(yīng)答元件(CGTCA-motif)有關(guān)[20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)相同品種中不同OsGS同工型基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)不完全一致，在調(diào)控元件數(shù)量上存在差異，猜測(cè)不同OsGS同工型基因表達(dá)差異與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。因此，通過(guò)基因敲除等手段針對(duì)性地改變不同結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)不同結(jié)構(gòu)基因表達(dá)情況，是遺傳改良目標(biāo)性狀重要途徑。

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Comparative analysis on gene expression and promoter sequence in rice glutamine synthetase/

JIN Zhengxun,LI Dan,LI Mingyue,TONG Laga,PAN Dong,ZHANG Yulei,WANG Haiwei,HAN Yunfei,ZHANG Zhongchen
(School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin,150030,China)

The experiment selected five rice cultivars with significant different in grain protein content to analyze gene expression and promoter sequence of glutamine synthetase(GS)and its structural features in grain and leaf at filling stage.The results showed that gene expression was significantly different in OsGSisoform among different cultivars.There was a lot of expression ofOsGS1;1 andOsGS1;2 in grain and leaf,OsGS1;3 only in grain andOsGS2 only in leaf to different extent.Gene expression of glutamine synthetase(GS)in grain and leaf exhibited one-peak-curve variation at filling stage,increased to the peak and then decreased quickly.In addition,OsGSexpression level was higher in high protein content cultivar than that in low protein content cultivar.Promoter sequence inOsGSgenes was more conservative,above 99%similarity in rice cultivars with significantly different protein contents.Base variation was found inOsGSpromoter sequence in progenies from cultivar crossing,but was not involved in core elements.OsGSgene expression level was slightly regulated by its promoter.In the number of regulation elements and its function,the promoter ofOsGSgene had strong conservative property and was less likely to have genetic variation in structure and function.The change ofOsGSgene mRNA expression was few affected by the regulation of OsGSgene promoter.

rice;transgressive variant;glutamine synthetase genes;transcription expression;promoter sequence

S816

A

1005-9369（2017）10-0001-10

金正勛,李丹,李明月,等.水稻谷氨酰胺合成酶同工型基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)關(guān)系分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(10)：1-10.

Jin Zhengxun,Li Dan,Li Mingyue,et al.Comparative analysis on gene expression and promoter sequence in rice glutamine synthetase[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(10)：1-10.(in Chinese with English abstract)

2017-04-12

科技部“十三五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD23B05-11)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)資助項(xiàng)目，黑龍江省糧食產(chǎn)能提升協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目

金正勛（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗具z傳育種及生物技術(shù)。E-mail：zxjin326@hotmail.com