高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中蘆丁

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(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中蘆丁

李晨,寧麗娜

(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

應用高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中的蘆丁,經過選擇優(yōu)化,確定以乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)為兩相溶劑系統(tǒng),以上相為固定相,下相為流動相,在主機轉速800 r/min,流速2 mL/min,檢測波長256 nm條件下進行分離制備,得到4個分離組分。對所得分離產物進行高效液相檢測,發(fā)現(xiàn)組分II為蘆丁,其純度達到96%以上,得率為10.7%。本實驗從金銀木葉中分離制備蘆丁,方法簡便,所得產物純度高,為進一步擴大金銀木的開發(fā)應用提供了理論依據(jù)。

金銀木葉,蘆丁,高速逆流色譜

金銀木(LoniceramaackiiMaxim)是忍冬科忍冬屬的落葉灌木,具有優(yōu)良的觀花、觀果價值,在我國種植十分廣泛。目前,人們已從忍冬屬植物中發(fā)現(xiàn)多種化學成分,如黃酮類、有機酸及三萜類等[1]。忍冬屬一些植物的花如金銀花具有營養(yǎng)保健作用,果實含有必需微量元素及不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分[2]。因此,對忍冬屬植物資源的開發(fā)具有廣闊的市場。金銀木全株可入藥,具有清熱解毒、殺菌消炎之功效[3]。研究發(fā)現(xiàn)金銀木含有黃酮類化合物,在不同生長期金銀木的花、葉、果中均含有蘆丁,其中尤以金銀木葉中含量為最高,其含量甚至高于傳統(tǒng)藥材金銀花葉子中蘆丁含量[4-5]。蘆丁又名蕓香甙,維生素P,屬于黃酮類物質,其化學結構如圖1。蘆丁等黃酮類物質具有抗氧化、清除自由基、降糖降脂等多種作用,在保健食品或藥品等領域應用前景廣泛[6-8]。目前,對金銀木葉總黃酮的提取工藝已有研究[9],但有關金銀木葉黃酮類物質分離制備的研究尚未見報道。

圖1 蘆丁的化學結構Fig.1 Chemical structure of rutin

高速逆流色譜(high speed counter-current chromatography HSCCC)為液液分配色譜,無需固體載體,不會發(fā)生樣品的不可逆吸附等作用,具有樣品回收完全、成本低、儀器操作簡單等優(yōu)點,近年來在天然產物、食品分離、生物制藥等領域得到了廣泛應用和關注[10-11]。宋學英等建立了從白芍粗提物中分離純化五沒食子?；咸烟堑腍SCCC方法[12],石雪萍等應用HSCCC分離制備花椒中的黃酮化合物[13],朱琳等應用HSCCC法分離苦蕎中的蘆丁和槲皮素[14]。本研究采用高速逆流色譜分離金銀木葉中的一種黃酮成分蘆丁,有利于進一步研究金銀木的藥效及其機理,以期為更好地開發(fā)金銀木的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

金銀木葉(山西大學植物學孔冬梅老師鑒定,為金銀木金銀屬,LoniceramaackiiMaxim) 采于山西大學校園內;蘆丁標準品 純度98%,上海生工生物工程股份有限公司;氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、磷酸 分析純,高效液相色譜所用的甲醇為色譜純,天津市化學試劑二廠;水 二次蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1 金銀木葉粗提物的制備 采集新鮮金銀木葉,清水沖洗干凈后,自然陰干。用中藥粉碎機粉碎,過40目篩。稱取10.000 g粉末置于具塞錐形瓶中,按液料比25∶1加入70%(v∶v)乙醇溶液,于65 ℃水浴鍋中提取1 h,12000 r/min離心20 min,取上清,重復提取三次。合并提取液后于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮,得到棕褐色粘稠浸膏。向浸膏中加入100 mL乙酸乙酯,于65 ℃水浴中超聲波提取30 min,超聲波功率為250 W,趁熱過濾,取上清,旋轉蒸發(fā)后,得到黃色粉末即為金銀木葉粗提物,4 ℃避光保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 高效液相色譜分析條件 色譜柱:大連依利特HYPERSILC18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為甲醇-0.4%磷酸(體積比50∶50),流速為1.0 mL/min,柱溫為25 ℃,檢測波長256 nm。

精密配制20、40、60、80、100、120 μg/mL蘆丁標準溶液,分別取10 μL進樣,以濃度x (μg/mL)為橫坐標,峰面積Y(A)為縱坐標繪制標準曲線,計算回歸方程。

取一定量金銀木葉提取物,用甲醇溶解,0.22 μm針頭過濾器過濾后,進行HPLC分析。

1.2.3 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇 參考高速逆流色譜分離黃酮類化合物的相關報道及蘆丁的性質選擇兩相體系[15],如乙酸乙酯、正己烷、甲醇、正丁醇和水等,按照一定比例混合配制溶劑體系(見表1),通過高效液相色譜測定蘆丁在不同體系中的分配系數(shù)K,篩選K值在0.5～2.0的溶劑系統(tǒng)用于高速逆流色譜[16]。

分配系數(shù)的測定[17]:分別取10.0 mL上相和下相溶液于分液漏斗中,加入10 mg金銀木葉粗提物,充分劇烈振搖,靜置至分配平衡后,分別各取4.0 mL上相和下相溶液減壓旋干后用1 mL甲醇溶解,過0.22 μm濾膜,按照方法1.2.2用HPLC測定蘆丁在兩相中的峰面積,并按照公式K=Su/Sd計算分配系數(shù)K。其中,Su和Sd分別為蘆丁在上相和下相溶劑中的HPLC峰面積。

1.2.4 高速逆流色譜法分離制備金銀木葉中黃酮化合物蘆丁 配制乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)兩相溶劑系統(tǒng),于分液漏斗中充分振搖后在室溫下靜置12 h。分離上相和下相,分別進行超聲脫氣30 min,冷卻。以10 mL/min的流速將上相泵入主機。待HSCCC分離管中充滿上相后,再以2 mL/min的流速泵入下相,同時調整主機轉速為800 r/min。待流動相流出后,兩相在分離管中已達到動態(tài)平衡。開啟AKTA prime檢測系統(tǒng),設置檢測波長為254 nm,采集數(shù)據(jù),待基線平穩(wěn)后,上樣。取樣品100 mg,用等量上下相液體(各5 mL)溶解,由進樣閥上樣,記錄色譜圖,收集各分離組分。

2 結果與討論

2.1蘆丁標準品及金銀木葉粗提物HPLC譜圖

圖2(A)為蘆丁標準品的HPLC色譜圖,圖2(B)為金銀木葉粗提物的HPLC色譜圖。由圖2(A)可知,蘆丁的保留時間為5.44 min。按照1.2.2方法,計算得到蘆丁的線性回歸方程為Y=1474.2x-126.35,R2=0.9997。從圖2(B)可見,金銀木葉粗提物中的主要成分為蘆丁,而且按照本實驗的HPLC條件進行檢測,蘆丁與其它組分得到了較好的分離。

圖2 蘆丁標準品(A)和金銀木葉粗提物(B)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of rutin(A) and the extract of Lonicera maackii Maxim leaves(B)

2.2HSCCC分配系數(shù)的測定

HSCCC能否達到好的分離效果,兩相溶劑系統(tǒng)的選擇至關重要。一個好的溶劑系統(tǒng)應該具備以下三個條件,即分配系數(shù)在0.5～2.0,兩相溶劑系統(tǒng)能較快分層,分層時間小于30 s,同時固定相要有高的保留率。根據(jù)蘆丁的結構特點和文獻報道,本研究選擇了7種不同的溶劑體系,采用高效液相色譜測定了蘆丁在不同體系中的分配系數(shù),各溶劑體系及相應分配系數(shù)K值見表1。

表1 樣品在不同溶劑體系中的分配系數(shù)KTable 1 Partition coefficients(K)of the extract of Lonicera maackii Maxim leaves in different two phase solvent systems

根據(jù)表1的數(shù)據(jù)可以看出,1號溶劑正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5,v∶v)分層時間大于30 s,溶劑系統(tǒng)2、3、4的分配系數(shù)均小于0.5。因此,以上四種溶劑系統(tǒng)不適合用于高速逆流色譜。溶劑5、6、7的K值符合要求,但5號溶劑氯仿-甲醇-水(4∶3∶2,v∶v)上機后固定相流失較為嚴重,另外,氯仿毒性也較大,不宜用作實驗溶劑。6、7號溶劑系統(tǒng)毒性較小,然而,6號溶劑的K值略微顯小,7號溶劑系統(tǒng)的親水性增強,K值增大,因此選用7號溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v)進行高速逆流色譜分離制備金銀木葉的黃酮單體蘆丁。

2.3HSCCC分離結果

采用溶劑系統(tǒng)乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v),按照1.2.4的方法進行高速逆流色譜分離金銀木葉粗提物,得到4個分離組分,見圖3。

圖3 金銀木葉粗提物的高速逆流色譜圖Fig.3 HSCCC chromatogram of the crude extract from Lonicera maackii Maxim leaves注:溶劑系統(tǒng):乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v); 固定相:上相;流動相:下相;流速:2.0 mL/min; 轉速:800 r/min;檢測波長:254 nm。

收集圖3中的各組分進行紫外-可見光譜掃描。其中,峰II樣品(洗脫體積150 mL)與標準蘆丁的特征吸收峰一致,結果見圖4。將各組分將按照1.2.2的HPLC條件進行分析,發(fā)現(xiàn)峰Ⅱ為單一組分,結果如圖5所示。將其HPLC譜圖與對照品蘆丁的HPLC譜圖比較,二者保留時間一致,表明該組分為蘆丁,經峰面積歸一法測得其純度為96.1%,經計算得知在本實驗條件下蘆丁得率為10.7%。

圖4 峰Ⅱ組分的紫外可見吸收圖譜Fig.4 Absorption spectra of effluent fraction Ⅱ

圖5 峰Ⅱ組分的HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatogram of effluent fraction Ⅱ

3 結論

本文應用高速逆流色譜法首次從金銀木葉粗提物中一步分離制備了黃酮化合物蘆丁。選用的兩相溶劑體系為乙酸乙酯-正丁醇-水(5∶2∶5,v∶v),上相為固定相,下相為流動相,在轉速800 r/min、流速2 mL/min的條件下,150 min時收集得到蘆丁。經HPLC測定,蘆丁純度為96.1%。本實驗所用的高速逆流色譜法為液液層析,無需色譜柱,也不會發(fā)生色譜柱污染等問題,所需耗材僅為溶劑體系,較制備型HPLC方法相比,HSCCC具有制備量大、成本低廉等優(yōu)點[18]。本文建立了從金銀木葉中分離純化蘆丁的HSCCC方法,為進一步研究金銀木的功效、提高金銀木的綜合利用奠定了一定的理論基礎。

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IsolationandpreparationofrutinfromLoniceramaackiiMaximleavesbyhighspeedcountercurrentchromatography

LIChen,NINGLi-na

(School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

High-speed counter-current chromatography(HSCCC)was developed for separation and purification of rutin from crude extract ofLoniceramaackiiMaxim leaves. 10.7 mg of rutin was separated from 100 mg of the crude extract. The separation was performed using a two-phase solvent system composed of ethyl acetate-n-butanol-water(5∶2∶5,v∶v),in which the upper phase as stationary phase and the lower phase was used as the mobile phase,at a flow rate of 2.0 mL/min. The rotation speed and detection wavelength were set at 800 r/min and 256 nm,respectively. Four peaks were displayed on HSCCC chromatogram. The collected fractions were analyzed by HPLC and peak II contained the target compound of rutin,with a purity over 96% and a yield of 10.7%. This paper provided an easier method to purify rutin from crude extract ofLoniceramaackiiMaxim leaves. It can provide reference basis for full use ofLoniceramaackiiMaxim.

LoniceramaackiiMaxim leaves;rutin;high-speed counter-current chromatography(HSCCC)

2017-04-14

李晨(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：蛋白質與酶工程，E-mail:lichen@sxu.edu.cn。

山西省青年科學基金(2015021047)；山西省高?？萍紕?chuàng)新項目(2016116)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)21-0237-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.047