超高壓提取核桃分心木總黃酮工藝及動力學(xué)模型研究

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(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010; 2.鹽亭縣金土地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,四川綿陽 621010)

超高壓提取核桃分心木總黃酮工藝及動力學(xué)模型研究

何薇1,嚴(yán)成1,*,熊雪媛1,唐周剛2

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010; 2.鹽亭縣金土地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,四川綿陽 621010)

以核桃分心木為原料,利用響應(yīng)面法對常溫下超高壓提取核桃分心木中總黃酮的工藝條件進行優(yōu)化并建立動力學(xué)模型。以乙醇體積分數(shù)、壓力、保壓時間、料液比為主要因素,采用Box-Behnken實驗設(shè)計,研究各因素及交互作用對總黃酮提取得率的影響;同時根據(jù)Fick第一擴散定律建立超高壓提取分心木總黃酮的動力學(xué)方程。結(jié)果表明,響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為:乙醇體積分數(shù)62%、壓力385 MPa、保壓時間9 min,料液比1∶25 (g/mL),此條件下,總黃酮的實際提取得率為12.31%,與模型預(yù)測值基本相符;動力學(xué)模型的預(yù)測值與實際值相關(guān)性良好,決定系數(shù)R2=0.9875。與傳統(tǒng)提取方法相比,超高壓提取在提高黃酮提取得率的同時能顯著縮短提取時間、降低能耗。

核桃分心木,總黃酮,超高壓提取,響應(yīng)面分析,動力學(xué)模型

核桃分心木(walnut diaphragm)也稱作胡桃夾、胡桃衣[1],具有利尿清熱,安神助眠,健脾固腎,澀精等功效[2],中國是世界核桃生產(chǎn)大國[3],分心木資源蘊含量巨大。目前有關(guān)分心木的研究主要集中在化學(xué)成分及生物活性等方面[4-5],趙煥新等[6]利用GC/MS法測定出分心木中含有多糖、黃酮、生物堿、有機酸、甾類、皂苷等多種化學(xué)成分。其中分心木黃酮類化合物的研究日益引起人們的重視,可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品行業(yè),有望在預(yù)防和治療腫瘤、心血管疾病等方面取得進展[7]。但有關(guān)分心木黃酮類化合物提取的研究較少,且多采用超聲波法研究核桃分心木中總黃酮的提取[8-9],超聲波法提取時間長,提取效率不高,主要依靠熱力破壞細胞結(jié)構(gòu),易使提取過程中產(chǎn)生其它生化反應(yīng)[10];超高壓提取[11]可大大縮短提取時間、減少雜質(zhì)的溶出,而且超高壓提取在常溫下進行,避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化以及生理活性的降低[12]。本實驗選用國家級優(yōu)良單株核桃新品種“綿核1號”為原料,以乙醇體積分數(shù)、壓力、保壓時間、料液比為主要因素,研究超高壓處理對分心木總黃酮提取得率的影響并建立超高壓動力學(xué)模型進行佐證,為進一步研究、利用分心木黃酮類化合物提供有價值的參考。

1 材料與儀器

1.1材料與儀器

“綿核1號”核桃分心木 2016年9月采收于四川綿陽。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(分析純) 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等 均為分析純試劑。

電熱恒溫干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;多功能粉碎機 浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司;UV-3150紫外-可見光分光光度計 日本島津公司;電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;臺式離心機 天津廣豐科技有限公司;HPP.L2-800/1超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司;D2-280/2SE小型真空封裝機 東莞市益健包裝機械有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 核桃分心木預(yù)處理 核桃分心木經(jīng)挑選去雜質(zhì)、洗凈,55 ℃恒溫干燥箱干燥6 h,粉碎過80目篩。稱取1.00 g分心木樣品于透明聚乙烯袋中,加入乙醇溶液,封口混勻,放入超高壓容器加壓腔內(nèi),于不同條件下進行高壓處理。卸壓后,將萃取液于4000 r/min離心15 min,收集上清液定容,待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和最大吸收波長的確定 參照文獻[13]中的方法并作相應(yīng)修改。準(zhǔn)確稱取烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg,65%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移并定容至50 mL容量瓶中,搖勻,即得0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液;精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL上述儲備液于10 mL容量瓶中,加入0.3 mL 5% NaNO2,搖勻,放置6 min;分別加入0.3 mL 10% Al(NO3)3,搖勻放置6 min后再加入4 mL 4% NaOH 溶液,混勻,用乙醇定容至刻度,放置15 min。以相應(yīng)試劑作空白參比,在200～700 nm波長范圍內(nèi)進行掃描,掃描結(jié)果在510 nm處有最大吸收峰。以質(zhì)量濃度(C,mg/m L)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線擬合得方程:A=10.794C+0.0218,R2=0.9995。

1.2.3 核桃分心木黃酮類化合物含量的測定 將離心得到的提取液定容至50 mL,準(zhǔn)確吸取0.1～10 mL容量瓶中,按1.2.2項下測定吸光值的方法進行操作,根據(jù)下列公式計算分心木中總黃酮提取得率:

式中:C是提取液中黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V0是樣品提取液定容總體積(mL);V1是量取提取液樣品測定定容的體積(mL);V2是測定用樣液體積(mL);m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實驗 分別以乙醇體積分數(shù)(20%、35%、50%、65%、80%、95%)、壓力(100、200、300、400、500、600 MPa)、保壓時間(5、10、15、20、25、30 min)、液料比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)進行單因素實驗,在固定單因素條件為乙醇體積分數(shù)65%、壓力為300 MPa、保壓時間為10 min、液料比為1∶25下分別考察各因素對黃酮提取得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計 以核桃分心木總黃酮化合物提取得率為指標(biāo),建立4因素3水平Box-Behnken中心組合實驗,因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 應(yīng)用統(tǒng)計軟件Origin8.5、Design-Expert 8.0.6.1、SAS 9.4進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的選擇

將對照品和樣品溶液按“1.2.2”中方法處理,結(jié)果表明對照品和樣品均在510 nm處有最大吸收,因此選510 nm為測定核桃分心木中黃酮類化合物吸光值的檢測波長。

圖1 核桃分心木樣品及對照品的紫外-可見光掃描圖譜Fig.1 Absorption spectrum of walnut diaphragm samples and standard samples

2.2單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對核桃分心木總黃酮提取得率的影響 由圖2可知,在提取過程中乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取得率影響較大,隨乙醇體積分數(shù)增大總黃酮提取得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。乙醇體積分數(shù)達到65%時,提取得率達到最高值,為10.277%這是因為一定范圍內(nèi)隨著乙醇體積分數(shù)增大,黃酮苷元類化合物的溶解性增加,脂溶性黃酮類化合物的溶解性也隨之增加[14]。當(dāng)乙醇體積分數(shù)大于65%后,提取得率降低,則可能是由于其它醇溶性雜質(zhì)、色素等溶出量增加,抑制了黃酮類物質(zhì)的溶解[15]。故選體積分數(shù)為65%的乙醇為最佳提取溶劑。

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield rate of total flavonoids

2.2.2 超高壓壓力對分心木總黃酮提取得率的影響 圖3表明,在100～300 MPa壓力范圍內(nèi),總黃酮提取得率隨壓力的升高而提高,在300 MPa時提取得率最大為11.049%。由多方面原因引起,一方面超高壓提取過程先對樣品加壓,升高壓力增加了提取溶劑向固體組織的滲透速率,且隨著壓力升高,細胞壁和細胞膜被破壞的數(shù)量增加,提取溶劑和組織接觸面積增大,使得有效成分的溶解更加完全;二是增大壓力使細胞組織內(nèi)外壓力差增大,卸壓時提供的反向壓力差也增大,在有效成分向組織外擴散過程中,提供了足夠大的動力,使有效成分快速擴散到組織外[16]。當(dāng)壓力大于300 MPa后,提取得率反而呈下降趨勢。這是因為當(dāng)壓力達到300 MPa時,細胞的細胞壁和細胞膜已充分被破壞,再提高壓力,反使過多雜質(zhì)釋放出來,而且壓力過大某些有效成分也易被破壞[17]。故超高壓壓力在300 MPa時,有利于分心木中總黃酮的提取。

圖3 壓力對總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of different pressures on the yield of total flavonoids

2.2.3 保壓時間對分心木總黃酮提取得率的影響 由圖4可以得知,總黃酮提取得率隨保壓時間的延長先增加后呈緩慢下降趨勢,當(dāng)保壓時間延長至10 min時,提取得率達到10.26%,再增加保壓時間,總黃酮提取得率呈下降趨勢。可見超高壓法提取活性成分過程快速,這是因為在高壓情況下,有效成分很快擴散到溶劑中從而達到平衡[16]。因此擬確定最佳保壓時間為10 min。

圖4 保壓時間對總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of UHP times on the yield of total flavonoids

2.2.4 料液比對總黃酮提取得率的影響 從圖5可知,當(dāng)料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)范圍內(nèi)時,總黃酮提取得率隨料液比的增加逐漸升高,這是因為增加溶劑量降低了原料顆粒周圍的濃度,使細胞壁內(nèi)外兩側(cè)濃度梯度增大,黃酮化合物擴散速率提高,有利于有效成分的溶出;料液比為1∶25 (g/mL)時，總黃酮提取得率達到11.698%，若繼續(xù)增大料液比，提取率反而降低。從提取效果和減少溶劑用量等方面綜合考慮,用量不宜過大,1∶25 (g/mL)為最佳料液比。

圖5 料液比對總黃酮提取得率的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on the yield of total flavonoids

2.3響應(yīng)面實驗

2.3.1 響應(yīng)面實驗方案設(shè)計結(jié)果及方差分析 根據(jù)單因素實驗,響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

注：**.差異極顯著(p<0.01);*.差異顯著(p<0.05)。

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2的數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析,得到提取條件與分心木總黃酮提取得率間的二次多項式:

Y=12.10-0.68A+0.25B+0.089C+0.39D+0.32AB-1.01AC+0.49AD-0.057BC-0.44BD+0.11CD-1.70A2+0.031B2-0.073C2-0.43D2

式中,Y為核桃分心木總黃酮提取得率的預(yù)測值;A、B、C、D分別代表乙醇體積分數(shù)、壓力、保壓時間、料液比的編碼值,為了說明模型的合理性,對回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表3。

由表3可知,總黃酮提取得率實驗設(shè)計模型整體呈極顯著水平(p<0.0001),能夠正確反映核桃分心木中總黃酮提取得率與乙醇體積分數(shù)、壓力、保壓時間及料液比之間的關(guān)系;失擬項不顯著(p=0.0781),說明實驗無失擬因素存在;一次項A、B、D和二次項A2、D2對黃酮提取得率的影響均達到了極顯著水平(p<0.01),交互項AB、AC、AD、BD達到了極顯著水平(p<0.01)。該模型的決定系數(shù)R2為0.9908,表明此模型可以解釋99.08%響應(yīng)值的變化,即樣本數(shù)據(jù)對模型回歸方程的擬合度較高,該模型的選擇是合理的。各因素對提取得率影響大小順序依次為:乙醇體積分數(shù)>料液比>壓力>保壓時間。

圖6 兩因素交互作用對總黃酮提取得率的影響Fig.6 Response surface plots of variable parameters on the extraction yield of total flavonids

2.3.2 兩因素間的交互作用分析 分別固定回歸模型中任意兩個因素在零水平,可得到另外兩個因素的雙因素模型。等高線圖沿某一因素軸方向曲線密度越大,形狀趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大,反映在響應(yīng)面上則是曲面坡度越陡峭,說明交互作用越明顯[12]。

由表3可知,AB、AC、AD、BD交互作用極顯著,其響應(yīng)曲面圖如圖6所示,由圖中各響應(yīng)面的陡峭程度可知,乙醇體積分數(shù)對核桃分心木總黃酮提取得率的影響最大,其次依次是料液比、壓力和保壓時間,這一結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。固定壓力和液料比在零水平,乙醇體積分數(shù)和保壓時間交互作用最顯著(圖6c),其次依次是乙醇體積分數(shù)與料液比(圖6b)、壓力和料液比(圖6d)、壓力和乙醇體積分數(shù)和壓力(圖6a)。

2.3.3 最佳工藝條件預(yù)測及驗證實驗 經(jīng)軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化后,得出最佳提取條件為:乙醇體積分數(shù)62.38%,提取壓力386.66 MPa,保壓時間9.42 min,料液比為1∶25.01 (g/mL);此條件下核桃分心木總黃酮提取率最大,達到12.35%,考慮實際操作情況,將最佳工藝調(diào)整為:乙醇體積分數(shù)62%,提取壓力385 MPa,保壓時間9 min,料液比1∶25 (g/mL),此條件下進行驗證,總黃酮平均提取得率為12.31%,其相對誤差為 0.32%,說明該模型可以較好地反映分心木總黃酮提取的實際情況,故用Box-Behnken響應(yīng)面法對分心木總黃酮提取條件進行優(yōu)化是可行的。

2.4超高壓提取分心木總黃酮的動力學(xué)模型

2.4.1 動力學(xué)模型的建立 超高壓提取過程分3個步驟進行,一是溶劑向溶質(zhì)組織內(nèi)部滲透,二是溶質(zhì)溶解并擴散到固液界面,三是溶質(zhì)從固液界面向溶劑擴散[]。

由Fick第一擴散定律可得[19]:

式(1)

在提取過程中,分心木總黃酮濃度逐漸降低,而溶液中總黃酮濃度逐漸升高。因此,總黃酮的濃度梯度不斷減小,即:

式(2)

超高壓提取中,擴散系數(shù)與物質(zhì)濃度及擴散的壓力有關(guān)[20],可表示為:

D=D0CnPm(n,m>0)

式(3)

式中:為固有擴散系數(shù),與擴散體系的物質(zhì)特性及溫度等有關(guān)的常數(shù)。

將式(2)、(3)代入式(1)中,假定分心木總黃酮的物質(zhì)的量在反應(yīng)初始階段為0,t時刻為cV,V為溶液體積,由積分可得:

式(4)

設(shè)核桃分心木粉粒數(shù)目為ω,顆粒度為σ,質(zhì)量為G,密度為ρ,則

S=κωσ2

式(5)

G=κ′ωρσ3

式(6)

式(7)

設(shè)液料比為M,R為分心木粉充分潤濕時所需的溶劑體積與質(zhì)量之比,經(jīng)實驗測定R=1.28。

式(8)

將式(7),(8)代入式(4)中得:

表4 相同條件下實測值與預(yù)測值的比較Table 4 Comparison between experimental and predicted values at same condition

式(9)

C=αγ(M-R)δPβ

式(10)

以響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)為樣本,采用SAS 9.4軟件進行回歸分析可得:

C=1.1704t0.0041(M-1.21)-4.5135P0.1875

式(11)

R2=0.9472

式(11)為超高壓提取核桃分心木總黃酮的動力學(xué)方程。

2.4.2 動力學(xué)模型的驗證 設(shè)計均勻?qū)嶒瀸δＰ瓦M行驗證,并分析相關(guān)性。

經(jīng)分析所得,動力學(xué)模型的預(yù)測值與實際值之間相關(guān)性良好,決定系數(shù)R2=0.9875,由此說明該模型能較好的描述分心木總黃酮提取得率與乙醇體積分數(shù)、壓力、保壓時間及液料比的變化關(guān)系。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對核桃分心木中總黃酮的提取條件進行優(yōu)化,建立了分心木總黃酮提取的回歸模型,優(yōu)化得到超高壓提取分心木總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分數(shù)62%,壓力385 MPa,保壓時間9 min,液料比1∶25 (g/mL),此條件下黃酮類化合物平均提取得率為12.31%,與模型預(yù)測值相近;以Fick第一擴散定律為基礎(chǔ)建立了超高壓提取分心木總黃酮的動力學(xué)方程,該動力學(xué)模型的預(yù)測值與實際測量基本相符,進一步驗證該模型的可靠性。綜上,響應(yīng)面法優(yōu)化提取核桃分心木中總黃酮的工藝是可行的。

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Studyontechnologyandkineticmodelforultrahighpressureextractionoftotalflavonoidsfromwalnutdiaphragm

HEWei1,YANCheng1,*,XIONGXue-yuan1,TANGZhou-gang2

(1.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Yanting Golden Land of Agriculture and Forestry Development Co.,Ltd.,Mianyang 621010,China)

Based on walnut diaphragm as the raw material,processing conditions for the ultrahigh pressure extraction of total flavonoids from walnut diaphragm using response surface methodology(RSM)were optimized. Meanwhile,a kinetics model was developed. The major factors included alcohol concentration,pressure,pressure holding time and solid-liquid ratio,Box-Benhnken experimental design was utilized to investigated the influence of different factors and their interactions on the extraction rate of total flavonoids. Also,kinetic equation of extracting total flavonoids under ultrahigh pressure was developed according to Fick’s first law of diffusion. The results indicated that 62%,385 MPa,9 min,and 1∶25 were the optimum extraction parameters for ethanol concentration,extraction pressure,pressure holding time and solid-liquid ratio,respectively. Under such conditions,the actual extraction rate of total flavonoids was 12.31%,which was consistent with the predicted values. The predicted value of kinetic model was well correlated with the actual value,and the coefficient of determinationR2was 0.9875. Compared with the traditional heating method,the ultrahigh pressure extraction process can significantly increase the extraction rate and shorten the extraction time.

walnut diaphragm;total flavonoids;ultrahigh pressure extraction;response surface methodology(RSM);kinetic model

2017-05-08

何薇(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品精深加工，E-mail:vivianweie@163.com。

*

嚴(yán)成(1963-) ，男，碩士，教授，研究方向: 食品化學(xué)與功能性食品，E-mail:ycx824511@163.com。

四川省科技廳重點項目(2016NZYZF0073)。

TS209

B

1002-0306(2017)21-0186-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.037