冷凍南極磷蝦(Euphausia superba)肌肉的 理化性質(zhì)及蛋白的加工特性

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(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所低溫工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

冷凍南極磷蝦(Euphausiasuperba)肌肉的 理化性質(zhì)及蛋白的加工特性

徐蓓蓓1,胡玲萍1,姜曉明1,尹利昂1,薛勇1,薛長(zhǎng)湖1,*,楊俊玲2

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2.中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所低溫工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

本文以冷凍南極磷蝦為原料,對(duì)肌肉的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)的加工特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,磷蝦蛋白氨基酸組成均衡,必需氨基酸總量達(dá)到485.9 mg/g蛋白;肌原纖維蛋白由于在凍藏期間發(fā)生降解,只占凍藏后蛋白質(zhì)的20%左右;蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主;蛋白與脂質(zhì)的結(jié)合呈緊密的規(guī)律性分布。蛋白的加工特性(結(jié)構(gòu)性質(zhì)、溶解性、乳化性和起泡性等)研究表明,與大豆分離蛋白相對(duì)比,南極磷蝦蛋白的乳化活性較高而起泡性較低且在0.6 mol/L的鹽溶液中溶解性較好;與鮮蝦能形成粘彈性的凝膠性能相對(duì)比,冷凍磷蝦蛋白則失去凝膠性能。內(nèi)源蛋白酶具有類胰蛋白酶屬性,在45 ℃,pH8.0時(shí),活性最高;內(nèi)源脂肪酶屬于低溫酶,在5～50 ℃范圍內(nèi)具有較高的酶活。建立了冷凍南極磷蝦作為合格工業(yè)原料的參考標(biāo)準(zhǔn),即TVB-N≤30 mg N/100 g,堿溶性蛋白≤5.00%,FFA≤5.00%脂質(zhì),LPC≤4.00%脂質(zhì)。本文的研究為南極磷蝦蛋白質(zhì)的利用提供了基礎(chǔ)性數(shù)據(jù),對(duì)南極磷蝦的高值化利用具有理論和實(shí)踐上的借鑒意義。

南極磷蝦,蛋白,加工特性,理化性質(zhì),TVB-N,Folin-酚法

南極磷蝦肌肉鮮樣含有粗蛋白16.31%,粗脂肪1.30%,粗灰分2.76%,無氮浸出物4.94%,水分74.69%[1]。南極磷蝦蛋白質(zhì)含有全部的人體必需氨基酸,整只南極磷蝦中必需氨基酸占總氨基酸的比例達(dá)到40.2%[2];氨基酸總量(TAA)和必需氨基酸總量(EAA)分別是57.21%和25.88%,構(gòu)成比例符合FAO/WHO的標(biāo)準(zhǔn)[1,3]。南極磷蝦肌肉中賴氨酸的含量很高,占總氨基酸的比例達(dá)到8.93%,這對(duì)于以谷物食品為主的膳食者來說,可以彌補(bǔ)谷物食品中賴氨酸的不足,從而提高人體對(duì)蛋白質(zhì)的利用率[4]。南極磷蝦蛋白質(zhì)的生物效價(jià)高于其它肉類蛋白質(zhì)和牛乳蛋白質(zhì)(如酪蛋白)[5];動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,南極磷蝦蛋白可供人體食用,無安全性問題[6]。

南極磷蝦是目前人類所發(fā)現(xiàn)的生物中含蛋白質(zhì)量最高的一種,為了滿足日益增長(zhǎng)的蛋白質(zhì)需求,充分利用南極磷蝦開發(fā)蛋白類食品是一項(xiàng)重要任務(wù)。針對(duì)這一現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)對(duì)冷凍南極磷蝦肌肉的理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)的加工特性展開了研究,以期對(duì)南極磷蝦以及南極磷蝦蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

冷凍南極磷蝦(E.superba,捕撈于南極FAO 48.1海域,2014年6月,2014年7月,2014年8月,2015年1月,2015年2月,2015年3月六個(gè)批次) 中國水產(chǎn)有限公司提供;TP酶測(cè)試盒、蛋白測(cè)定試劑盒、甘油三酯和膽固醇測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;Tritox X-100、福林-酚乙液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)Solarbio;磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12 H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·7H2O)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯仿、異丙醇、苯甲酰-L-精氨酰-對(duì)硝基苯胺(BApNA)、對(duì)硝基苯酚(p-NP)、4-硝基苯丁酸酯(p-NPB)等 上海國藥集團(tuán);所用試劑 均為分析純。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;WFZ UV2100型紫外可見分光光度計(jì) 龍尼柯儀器有限公司;Biochrom 30 Ltd型氨基酸自動(dòng)分析儀 英國Biochrom公司;PF-1型氟電極、PHS-3C型精密酸度計(jì) 上海雷磁精密儀器有限公司;Nicolet 6700 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司;NETZSCH DSC 200PC 差示熱掃描儀 德國NETZSCH公司;BRUKER AV500核磁共振波譜儀 德國布魯克公司;T860自動(dòng)電位滴定儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;5973型質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司;Leica Tcs Sp2型激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冷凍南極磷蝦的基本成分分析 由于南極磷蝦生長(zhǎng)海域和自身成分經(jīng)常伴隨季節(jié)變化,本實(shí)驗(yàn)選取了6個(gè)不同生產(chǎn)日期的磷蝦為樣品,測(cè)定各自的基本成分,取其平均值。

圖1 冷凍南極磷蝦蝦塊圖片F(xiàn)ig.1 Photograph of frozen Antarctic krill block

水分含量:采用直接干燥法測(cè)定,參照國標(biāo)GB/T 5009.3-2010[7];蛋白質(zhì)含量:采用凱氏定氮法測(cè)定,參照國標(biāo)GB/T 5009.5-2010[8];總脂含量:采用氯仿/甲醇抽提法,參照Folch的方法[9],提取的總脂-18 ℃于貯存,用于甘油酯、磷脂、蝦青素等含量的測(cè)定及分析;灰分含量:參照國標(biāo)GB/T 5009.4-2010[10];氟含量:采用高溫灰化-氟離子選擇電極法測(cè)定,參照李紅艷[11]的方法,并加以修改,以0.1 mol/L HClO4為氟的提取試劑;氨基酸組成:參照國標(biāo)GB/T 5009.124-2003[12]和Adeyeye[13]的方法,樣品在6 mol/L HCl溶液中于110 ℃條件下消化24 h后上機(jī)測(cè)。

1.2.2 蝦肉組成蛋白質(zhì)的種類及含量 冷凍磷蝦手動(dòng)剝殼采肉,參考Kanehisa等[14]的方法并進(jìn)行部分改進(jìn)。精確稱取20 g蝦肉與10倍體積的磷酸鹽緩沖液A(I=0.05,15.5 mmol/L Na2HPO4·12 H2O,3.38 mmol/L KH2PO4,pH7.5)混合;8000 r/min分散3 min;分散液于4 ℃下離心(5000 r/min,15 min);在所得沉淀中加入與上述相同數(shù)量的磷酸鹽緩沖液A,重復(fù)上述操作。將兩次離心后的上清液合并,得到上清a和沉淀a;向上清a中加入TCA,使TCA終濃度達(dá)到5%;離心,得到上清b(含氮非蛋白化合物)和沉淀b(肌漿蛋白);向沉淀a加入10倍體積的磷酸鹽緩沖液B(0.5 mol/L KCl,15.5 mmol/L Na2HPO4·12H2O,3.38 mmol/L KH2PO4,pH7.5)混勻,離心;沉淀中再加入緩沖液B,重復(fù)一次,將兩側(cè)離心后的上清液混合,得到上清c(肌原纖維蛋白)和沉淀c;將沉淀c用0.1 mol/L的NaOH過夜攪拌10 h,然后離心,得到上清d(堿溶性蛋白)和沉淀d(肌基質(zhì)蛋白)。

所提取蛋白質(zhì)的定量方法:肌原纖維蛋白c和堿溶性蛋白d采用Folin-酚法[15],肌漿蛋白b和肌基質(zhì)蛋白d采用凱氏定氮法[14]。

1.2.3 南極磷蝦蛋白的SDS-PAGE分析 參照Laemmli的電泳方法[16]。電泳條件:分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%。電泳電壓為濃縮膠80 V,分離膠100 V,同時(shí)以阿拉斯加鱈魚(Theragra chalcogramma)魚糜對(duì)應(yīng)的兩種蛋白組分作為對(duì)照進(jìn)行分析。

1.2.4 南極磷蝦蛋白的雙向二維電泳分析 參照O’Farrell的雙向二維電泳方法[17],提取和純化冷凍南極磷蝦蛋白,采用雙向二維電泳(2-DE)分析其分布特征。條件:一向等電聚焦電泳(IEF):pH3～10;二向垂直電泳(SDS-PAGE):15～170 kDa;染色:銀染。以 ImageMaster 2D platinum 5.0 進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 南極磷蝦蛋白等電點(diǎn)(pI)的測(cè)定 以0.1 mol/L的檸檬酸(C6H8O7·H2O)溶液和0.2 mol/L的磷酸二氫鈉(NaH2PO4·7H2O)溶液配制pH4.0～4.9的緩沖溶液。

將蝦肉充分?jǐn)厮榛靹?各取0.5 g蝦肉于離心管,加入2 mL不同pH的緩沖溶液,20000 g離心30 min(4 ℃),離心物分3層:上層脂質(zhì),中層水相和下層沉淀,中間層水相的蛋白含量用Folin-酚法測(cè)定,蛋白含量最低的離心管對(duì)應(yīng)的pH即pI。

1.2.6 冷凍南極磷蝦脂質(zhì)的基本組成分析 甘油三酯和膽固醇含量測(cè)定:采用試劑盒測(cè)定。將總脂用氯仿溶解,定容,取一定體積的氯仿溶液,氮?dú)獯蹈?按照試劑盒使用說明測(cè)定總脂中甘油三酯和膽固醇的含量。

磷脂含量測(cè)定:采用核磁共振法(31P NMR)。以三氯甲烷∶氘代甲醇(2∶1)溶劑為溶劑,磷酸三苯酯(TPP)為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行核磁共振分析。

游離脂肪酸含量測(cè)定:采用自動(dòng)電位滴定法。取0.5 g左右蝦油,用石油醚-乙醇(2∶1)混合溶劑充分溶解,以0.1 mol/L NaOH溶液為滴定試劑進(jìn)行電位滴定。

蝦青素含量測(cè)定:取1.2.1中所提總脂以LC/MS進(jìn)行蝦青素含量的測(cè)定[18]。

1.2.7 南極磷蝦肌肉的共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 參照Donato等[19]的方法。將羅丹明B加入到少量試樣中,以熒光標(biāo)記蛋白質(zhì),振蕩5 min,把多余的熒光劑洗去。取適量的樣品均勻涂抹于載玻片,緩慢按壓蓋玻片以防氣泡產(chǎn)生。以共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)斷層掃描得到穩(wěn)定的共聚焦圖片,發(fā)射波長(zhǎng)543 nm,避光操作。

1.2.8 南極磷蝦肌肉的紅外光譜分析 將南極磷蝦肌肉凍干樣品與光譜純KBr混合壓片,以傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜測(cè)試。條件:掃描范圍4000～400 cm-1;掃描數(shù)64;分辨率4 cm-1;測(cè)試溫度25 ℃。

1.2.9 南極磷蝦肌肉的差示掃描量熱(DSC)分析 參數(shù)設(shè)定:氮?dú)獗Ｗo(hù),溫度條件0～120 ℃,升溫速率5 ℃/min,保護(hù)氣流速為60～70 mL/min,吹掃氣20～30 mL/min。

1.3冷凍南極磷蝦蛋白的加工特性分析

1.3.1 溶解性、鹽析性和起泡性質(zhì)

1.3.1.1 溶解性 在不同pH溶液中的溶解情況:取10 g冷凍南極磷蝦粉碎勻漿,加入1∶1的不同pH(1～12)的磷酸鹽緩沖溶液,用高速分散機(jī)進(jìn)行分散,分散后進(jìn)行離心(4500 r/min,10 min)。取離心的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定(Folin-酚法)。

在不同離子強(qiáng)度溶液中的溶解情況:取10 g冷凍南極磷蝦粉碎勻漿,加入1∶1的不同離子強(qiáng)度(0.1～0.6 mol/L)的NaCl溶液,操作同前。

1.3.1.2 鹽析性 取一定質(zhì)量的蝦肉,加入去離子水,分散、離心,加入不同濃度硫酸銨溶液(20%～65%)使磷蝦蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀,測(cè)定使磷蝦可溶性蛋白質(zhì)析出的硫酸銨的最高鹽濃度。

1.3.1.3 起泡性 配制1%的南極磷蝦蛋白溶液100 mL,記錄起始溶液體積為V0,用高速均質(zhì)機(jī)以12000 r/min均質(zhì)1 min,測(cè)量蛋白溶液和泡沫的總體積,計(jì)為V1[20],

起泡性(%)=[(V1-V0)/V0]×100

式(1)

均質(zhì)停止30 min后,再次測(cè)量蛋白溶液和泡沫的總體積,計(jì)為V2,

起泡穩(wěn)定性(%)=[(V2-V0)/(V1-V0)]×100

式(2)

1.3.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì) 以Ca2+-ATPase活性為代表,分析南極磷蝦蛋白在凍藏一定時(shí)間后和等電點(diǎn)處沉淀蛋白的結(jié)構(gòu)屬性。

取冷凍磷蝦,冰水解凍5 min,手動(dòng)脫殼得到磷蝦肌肉。取部分磷蝦肌肉,加入3倍質(zhì)量的冰水,均質(zhì),調(diào)節(jié)至pH4.5,靜置15 min,離心(5000 r/min,10 min,4 ℃),沉淀即為等電點(diǎn)沉淀蛋白。將磷蝦肌肉和沉淀蛋白按照試劑盒說明書進(jìn)行其Ca2+-ATPase活性的測(cè)定。取冷凍磷蝦,冰水解凍后用清水沖洗15 min,瀝干水分,重復(fù)兩次后,手動(dòng)脫殼得到蝦糜,其性能測(cè)定同上。

凝膠性能:為驗(yàn)證冷凍南極磷蝦肌肉的凝膠性能與其新鮮度的相關(guān)性,在磷蝦捕撈作業(yè)船上和陸上實(shí)驗(yàn)室分別以鮮捕磷蝦和冷凍磷蝦為原料,按以下流程進(jìn)行凝膠實(shí)驗(yàn):

新鮮/冷凍磷蝦→手動(dòng)去殼→研碎→加2倍水,充分?jǐn)嚢琛^濾脫水→空擂→鹽擂(3%食鹽)→成型。

1.3.3 表面性質(zhì) 以乳化活性為代表對(duì)南極磷蝦蛋白在凍藏一定時(shí)間后的表面屬性。

采用濁度法進(jìn)行乳化活性的測(cè)定[21],配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL蛋白溶液,記為P,調(diào)節(jié)溶液的pH至7. 0。取25 mL該溶液加入10 mL大豆油,室溫條件下在10000 r/min下乳化1 min,用移液槍迅速從底部吸取0. 1 mL乳化液,用20 mL 0. 1%(m/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液定容,渦流混合后搖勻,以0.1% SDS溶液為空白參比。用分光光度測(cè)定溶液在500 nm時(shí)的吸光度,計(jì)為A1,靜置10 min后,再次按上述方法測(cè)定吸光度,計(jì)為A2。

乳化活性=[(2×2. 303×A1×N)/(P×l×(1-φ)×103)]×100

式(3)

N為稀釋倍數(shù),L為光學(xué)路徑1 cm,φ為乳化液中油的體積分?jǐn)?shù)

乳化穩(wěn)定性=[A1/(A2-A1)]×t

式(4)

t為靜置時(shí)間(10 min)

1.4南極磷蝦自溶酶相對(duì)酶活力的測(cè)定

1.4.1 粗酶液的制備 收集冷凍南極磷蝦蝦頭,加入2倍質(zhì)量的Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH7.5,4 ℃),高速勻漿后,勻漿液離心(10000 r/min,4 ℃,30 min),收集上清液,得南極磷蝦粗酶液[22]。將粗酶液放于-20 ℃保存,用于測(cè)定脂肪酶和蛋白酶相對(duì)酶活的變化。

1.4.2 不同溫度條件下相對(duì)酶活的變化 參考王琨[23]測(cè)定胰蛋白酶活性的方法,以苯甲酰-L精氨酰-對(duì)硝基苯胺(BApNA)為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,對(duì)不同溫度條件(20～55 ℃)下蛋白酶的相對(duì)活力進(jìn)行測(cè)定;脂肪酶活力的測(cè)定[24],以對(duì)硝基苯酚丁酸酯(p-NPB)為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,對(duì)不同溫度條件(5～70 ℃)下的脂肪酶的相對(duì)酶活進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 不同pH條件下相對(duì)酶活的變化 以37 ℃為最佳反應(yīng)溫度,以BApNA為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,對(duì)不同pH(3～11)下的蛋白酶活進(jìn)行測(cè)定;以p-NPB為底物,以吸光值最高的pH所對(duì)應(yīng)的酶活力為100%,對(duì)不同pH(pH3～11)下的脂肪酶活進(jìn)行測(cè)定。

1.5冷凍南極磷蝦蛋白質(zhì)品質(zhì)分析

以冷凍整蝦TVB-N含量水平和堿溶性蛋白的含量水平來評(píng)價(jià)冷凍南極磷蝦蛋白質(zhì)的品質(zhì)。

堿溶性蛋白含量的測(cè)定:Folin-酚法[15]。

TVB-N含量的測(cè)定:取勻漿后的凍蝦蝦漿約4 g置于50 mL離心管,加入40 mL 7% 的高氯酸溶液,間歇振蕩,浸漬30 min后離心、過濾。取10 mL濾液于消化管中,加入10 mL 1% MgO混懸液,以自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾滴定。

1.6數(shù)據(jù)處理

表1 冷凍南極磷蝦整蝦的基本組成Table 1 Basic composition of the whole frozen Antarctic krill

注：同列上標(biāo)不同字母表示差異顯著(p<0.05)；表3、表5、表7同。2結(jié)果與討論

2.1冷凍南極磷蝦基本組成分析

南極磷蝦整蝦含有77.9%～83.1%的水分、0.4%～3.6%的脂質(zhì)、11.9%～15.4%的蛋白質(zhì)[24],由表1可以看出,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)與報(bào)道內(nèi)容較為一致。單從組成成分上,這6個(gè)不同月份批次的磷蝦間有小幅波動(dòng),這與磷蝦生長(zhǎng)的水域以及捕撈的季節(jié)不同有關(guān),2014年6、7、8月磷蝦的總脂水平稍高于2015年1、2、3月的磷蝦,且灰分含量則略微低于后者;就氟含量來看,2014年捕撈的磷蝦的均低于2015年的磷蝦,這可能與磷蝦在不同季節(jié)時(shí)外骨骼的代謝特點(diǎn)有關(guān)。

由表2可知,南極磷蝦肌肉蛋白質(zhì)有平衡合理的氨基酸組成,總必需氨基酸含量達(dá)到485.9 mg/g蛋白,超過FAO/WHO/UNU對(duì)成人及嬰兒食品中必需氨基酸的含量要求(277(292.6) mg/g蛋白),其中Lys含量為88.3 mg/g蛋白,標(biāo)志著南極磷蝦蛋白是一種營養(yǎng)極其豐富的蛋白質(zhì)。

表2 南極磷蝦肌肉蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of protein from Antarctic krill muscle

注：Lys,賴氨酸;Trp,色氨酸;Phe,苯丙氨酸;Tyr,酪氨酸;Met,甲硫氨酸;Cys,半胱氨酸;Thr,蘇氨酸;Ile,異亮氨酸;Leu,亮氨酸;Val,纈氨酸;His,組氨酸;Glu,谷氨酸;Asp,天冬氨酸;Ala,丙氨酸;Arg,精氨酸;Ser,絲氨酸;Gly,甘氨酸;Pro,脯氨酸;T-EAA,總必需氨基酸;T-NEAA,總非必需氨基酸;-,FAO/WHO/UNU(2007)中無具體參考數(shù)值。

2.2南極磷蝦肌肉蛋白質(zhì)的種類及含量

表3 南極磷蝦肌肉蛋白質(zhì)的構(gòu)成Table 3 Protein composition of Antarctic krill muscle

表4 南極磷蝦脂質(zhì)的組成及含量Table 4 Antarctic krill lipid compositions and contents

注：占總脂的百分比。

由表3可以看出,冷凍南極磷蝦的肌漿蛋白占蛋白的比例為33.74%,因其溶于I<0.05的溶液中,增加了南極磷蝦加工中蛋白質(zhì)回收的難度和成本;肌原纖維蛋白在很大程度上決定蛋白質(zhì)的功能特性,Suzuki[5]測(cè)定新鮮蝦肉中,水溶及鹽溶蛋白各占5.0%、9.4%,鹽溶性蛋白占二者的比例為65%。表3數(shù)據(jù)顯示,冷凍磷蝦肌原纖維蛋白只占蛋白質(zhì)的20%左右,遠(yuǎn)低于魚類肌原纖維蛋白50%～70%的比例[26],這應(yīng)該是冷凍磷蝦在加工中難以形成彈性凝膠的主要原因之一;堿溶性蛋白(alkali-soluble protein),是一種于貯藏過程產(chǎn)生,不溶于水和高離子強(qiáng)度的溶液,但在堿性條件下可溶出的蛋白質(zhì),一般認(rèn)為是蛋白質(zhì)受環(huán)境影響的降解產(chǎn)物[24]?？梢?南極磷蝦蛋白質(zhì)在捕撈、凍結(jié)、貯藏和運(yùn)輸過程中的降解比較嚴(yán)重。

2.3南極磷蝦蛋白的SDS-PAGE分析

由圖2可知,冷凍南極磷蝦水、鹽溶性蛋白的組成,包含肌球蛋白重鏈(MHC,210 kDa)、肌球蛋白輕鏈(MLC,17～23 kDa)、肌動(dòng)蛋白(Actin,43 kDa)和原肌球蛋白(TM,38 kDa),以及一條不明條帶組成(70～100 kDa)組成。該不明條帶可能是肌原纖維蛋白降解的產(chǎn)物,南極磷蝦體內(nèi)含豐富的內(nèi)源酶,其中的蛋白酶在某些條件下可降解磷蝦肌原纖維蛋白,Sun等[27]研究發(fā)現(xiàn)在自溶過程中,肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白更易受到蛋白酶作用。磷蝦MHC的條帶較弱,MHC是肌球蛋白性質(zhì)的決定性組分,很大程度上決定了蝦肉蛋白的凝膠能力的強(qiáng)弱。

圖2 南極磷蝦蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE profile of protein isolate from Antarctic krill muscle注:1：分子量標(biāo)準(zhǔn)品;2：南極磷蝦鹽溶性蛋白; 3：南極磷蝦水溶性蛋白。

2.4南極磷蝦蛋白的雙向二維電泳分析

據(jù)圖3分析,蛋白斑點(diǎn)集中于pH4～5,說明其蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)可能在pH4～5。蛋白的組成方面,肌球蛋白輕鏈(17～23 kDa)、肌動(dòng)蛋白(43 kDa)和原肌球蛋白(38 kDa)比較顯著,而作為肌原纖維蛋白主要組成的肌球蛋白重鏈(210 kDa)很弱。

圖3 南極磷蝦蛋白的雙向二維電泳圖譜Fig.3 2-DE spectrum of Antarctic krill muscle protein

2.5南極磷蝦蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

由圖4可知,南極磷蝦蛋白在pH4.0～4.9范圍內(nèi)的溶解性呈“U”型,溶解蛋白濃度先降低后升高,在pH4.5處最低,因此推斷pH4.5為南極磷蝦蛋白的等電點(diǎn),這與王靈昭等[28]測(cè)定的南極磷蝦等電點(diǎn)pH4.6相符合。

圖4 南極磷蝦蛋白在不同pH(4.0～4.9)下溶解性的變化Fig.4 Changes in solubility of krill muscle protein at different pH values(4.0～4.9)

2.6南極磷蝦脂質(zhì)的基本組成

南極磷蝦脂質(zhì)的平均組成見表4,由表4可知,南極磷蝦脂質(zhì)富含磷脂(41.37%),磷脂型脂質(zhì)被認(rèn)為在人體內(nèi)的吸收效率和安全性更高[29]。水產(chǎn)品磷脂有富含EPA和DHA的特點(diǎn),樓喬明等[30]報(bào)道的南極磷蝦中EPA和DHA占脂肪酸總量的40.64%,高于一般海洋蝦類。蝦青素含量較其他蝦類較高(占總脂的0.15%),且動(dòng)物源的蝦青素更容易被人體吸收利用,而南極磷蝦資源豐富。因此,從磷蝦中提取蝦青素具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益。

2.7南極磷蝦肌肉的共聚焦激光掃描圖分析

圖5 南極磷蝦肌肉的共聚焦激光掃描圖Fig.5 Confocal laser scanning map of Antarctic krill muscle

南極磷蝦肌肉的共聚焦激光掃描圖見圖5,可以清晰的看出,經(jīng)羅丹明B染色的南極磷蝦蛋白與暗色的條帶狀物質(zhì)均勻交叉分布,暗色的條帶狀物質(zhì)推斷為南極磷蝦的脂質(zhì)成分,由此可以分析南極磷蝦蛋白與脂質(zhì)結(jié)合非常緊密,呈現(xiàn)規(guī)律性的分布,這一特征將有利于南極磷蝦體內(nèi)磷脂存在形式的揭示。

2.8南極磷蝦肌肉的紅外光譜分析

南極磷蝦肌肉的紅外光譜吸收見圖6,酰胺Ⅰ帶(主要為C=O伸縮振動(dòng))的特征吸收峰與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系,即1650～1660、1600～1640、1660～1695 cm-1和1640～1650 cm-1分別為α螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲[31]。由圖6可以看出,南極磷蝦肌肉的酰胺Ⅰ帶特征峰出現(xiàn)在1650 cm-1附近,因此,南極磷蝦蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

圖6 南極磷蝦肌肉的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of Antarctic krill muscle

2.9南極磷蝦肌肉的DSC分析

南極磷蝦肌肉的DSC曲線如圖7所示。樣品表現(xiàn)出兩個(gè)熱相變溫度:26.3 ℃和110.3 ℃。前一個(gè)對(duì)應(yīng)著肌球蛋白的變性和交聯(lián),后一個(gè)對(duì)應(yīng)著肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的變性和交聯(lián)。相關(guān)研究認(rèn)為,熱相變溫度可以反映出氫鍵的斷裂和蛋白之間的疏水聚集[32]。因此可以看出,南極磷蝦蛋白的肌球蛋白的變性溫度較低(26.3 ℃),說明其肌原纖維蛋白易受外界作用而失去活性。

圖7 南極磷蝦肌肉的差示熱量掃描分析Fig.7 Differential scanning calorimetry thermograms of Antarctic krill muscle

圖8 南極磷蝦蛋白在不同pH溶液中的溶解曲線Fig.8 Dissolving curve of Antarctic krill protein in varying pH values

2.10冷凍南極磷蝦蛋白的加工特性分析

2.10.1 水合性質(zhì)

2.10.1.1 溶解性 由圖8可以看出,南極磷蝦蛋白的溶出,在不同pH條件下(pH1～12)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),最低和最高的溶出分別出現(xiàn)在pH4和pH11附近,這與堿溶酸沉法制備南極磷蝦分離蛋白中的溶出規(guī)律相一致,該溶出曲線對(duì)研究冷凍南極磷蝦蛋白的加工利用有重要作用。

南極磷蝦蛋白在不同離子強(qiáng)度條件下的溶出情況見圖9,隨著離子強(qiáng)度的提高,蛋白溶出量先線性增加,中間增加緩慢,后直線上升,這是因?yàn)?南極磷蝦蛋白含有高比例的肌漿蛋白(33.74%),肌漿蛋白很快溶解在0.1 mol/L NaCl溶液中,而直到鹽濃度在0.4 mol/L以上時(shí),肌原纖維蛋白才開始溶出,因此在溶出曲線上呈現(xiàn)出先上升后緩慢上升然后急速上升的趨勢(shì);由張輝[33]論文數(shù)據(jù)可知,隨著離子強(qiáng)度的增加,大豆分離蛋白表現(xiàn)出顯著的鹽析效應(yīng),溶解性曲線表現(xiàn)出的鹽析現(xiàn)象開始于低鹽濃度(

圖9 南極磷蝦蛋白在不同離子強(qiáng)度溶液中的溶解曲線Fig.9 Dissolving curve of Antarctic krill protein in varying ionic strength

表5 南極磷蝦蛋白的起泡性和乳化性Table 5 Foaming and emulsification properties of Antarctic krill protein

表6 不同磷蝦產(chǎn)品中蛋白的Ca2+-ATPase活性Table 6 ATPase activity of the protein in different krill products

2.10.1.2 鹽析性 從圖10可以看出,隨著硫酸銨飽和度的不斷增加,沉淀中的蛋白質(zhì)含量不斷增加,硫酸銨飽和濃度達(dá)到50%時(shí),可沉淀大部分的水溶性蛋白質(zhì),當(dāng)飽和度繼續(xù)增加時(shí),沉淀中的水溶性蛋白質(zhì)含量反而降低。因此實(shí)際應(yīng)用中,可采用<65%的硫酸銨飽和度沉淀水溶性蛋白質(zhì)。

圖10 南極磷蝦蛋白的鹽析曲線Fig.10 Salting-out curve of Antarctic krill protein

2.10.1.3 起泡性與乳化性 從表5中可以看出,南極磷蝦起泡性的平均值為3.91%,起泡性低于大豆分離蛋白,而其泡沫穩(wěn)定性平均值為56.77%,與大豆蛋白的泡沫穩(wěn)定性差別不大。南極磷蝦蛋白的溶解性比較好,在一定條件下能促進(jìn)蛋白的起泡性,但起泡性不利于南極磷蝦蛋白質(zhì)的加工利用,在實(shí)際加工中可以綜合鹽分、脂質(zhì)等影響因素加以控制。磷蝦蛋白的乳化活性(EAI)為15.67 m2/g,高于大豆分離蛋白的9.21 m2/g,這是因?yàn)槔鋬隽孜r蛋白易與脂質(zhì),尤其是雙親性的磷脂發(fā)生乳化作用。乳化穩(wěn)定性(ESI)為26.37 min,與大豆分離蛋白(32.72 min)相近。

2.10.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì) 由表6可知,冷凍磷蝦蝦肉蛋白和等電處理后的蛋白的Ca2+-ATPase活性平均值分別為0.038、0.021 μmol Pi/mg prot/min,低于新鮮南極磷蝦肉蛋白的Ca2+-ATPase活性(0.158 μmol Pi/mg prot/min)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,新鮮捕撈的磷蝦在去除水溶性蛋白、加鹽擂潰后,能形成具備一定粘彈性的凝膠,而與此對(duì)應(yīng)的冷凍南極磷蝦制備的蝦腸,雖然可以借助外力成型,但不能形成彈性凝膠。這表明南極磷蝦肌原纖維蛋白經(jīng)冷凍貯存后,發(fā)生了嚴(yán)重的變性,失去了形成彈性凝膠的能力,這與較低的Ca2+-ATPase活性存在著重要關(guān)聯(lián)。

2.11冷凍南極磷蝦自溶酶相對(duì)酶活的測(cè)定

南極磷蝦引起自溶的酶系主要是蛋白酶和脂肪酶,Osnes等[34]提出磷蝦自溶酶中起著決定性作用是類胰蛋白酶,其活性約占磷蝦內(nèi)源酶活性的40%,整體自溶酶活性在中性至弱堿性條件下最強(qiáng)。因此,實(shí)驗(yàn)主要探究了這兩種酶系在不同溫度和pH條件下相對(duì)活性的變化。如圖11所示,蛋白酶系在45 ℃、pH為8.0時(shí)具有最高相對(duì)活性,但在pH6.0～11.0范圍內(nèi)具有較高的相對(duì)酶活,體現(xiàn)了胰蛋白酶的相似性質(zhì);在40 ℃、pH為8.0時(shí),脂肪酶系具有最高相對(duì)活性,且在5～50 ℃范圍內(nèi)具有較高的相對(duì)酶活,屬于低溫酶,但其活性易受pH的影響;南極磷蝦自溶的最佳反應(yīng) pH為8.0 左右,有文獻(xiàn)推測(cè)其脂肪酶的適低溫的特性可能與其生活環(huán)境相關(guān)。

2.12冷凍南極磷蝦的品質(zhì)評(píng)價(jià)

冷凍南極磷蝦作為一種潛在的大宗原料,有必要針對(duì)其品質(zhì)建立參考標(biāo)準(zhǔn),為原料的質(zhì)量控制提供依據(jù)。6個(gè)不同批次的冷凍南極磷蝦蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)(TVB-N、堿溶性蛋白含量)和脂質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)(FFA、LPC含量)見表7。

如表7所示,不同批次的冷凍南極磷蝦的蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)和脂質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)之間有所變化差異,2015年的三個(gè)批次磷蝦的TVB-N、堿溶性蛋白含量FFA、LPC含量均高于2014年的三個(gè)批次,2014年8月的南極磷蝦各指標(biāo)含量均最低,新鮮度最好。根據(jù)南極磷蝦6批樣品的品質(zhì)分析,建立了冷凍南極磷蝦作為合格工業(yè)原料的參考標(biāo)準(zhǔn),即TVB-N≤30 mg N/100 g,堿溶性蛋白≤5.00%,FFA≤5.00%脂質(zhì),LPC≤4.00%脂質(zhì)。

圖11 冷凍南極磷蝦自溶酶的相對(duì)活性Fig.11 Relative activity of autoenzyme from frozen Antarctic krill注:a、b:不同溫度、pH對(duì)脂肪酶活的影響;c、d:不同溫度、pH對(duì)蛋白酶活的影響。

表7 冷凍南極磷蝦的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Table 7 Quality evaluation index of frozen Antarctic krill

注：平均值1,2014年3個(gè)批次的平均值;平均值2,2015年3個(gè)批次的平均值;平均值3,全部6個(gè)批次的平均值。

3 結(jié)論

南極磷蝦蛋白質(zhì)有均衡的氨基酸組成,且必需氨基酸總量達(dá)到485.9 mg/g,滿足人體對(duì)必需氨基酸的攝入量,可考慮作為人類膳食的蛋白原料。南極磷蝦蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及溶解性的研究結(jié)果表明堿溶酸沉法可作為蛋白提取的有效方法。南極磷蝦形成彈性凝膠的能力,與Ca2+-ATPase活性存在重要關(guān)聯(lián)。磷蝦蛋白的乳化活性優(yōu)于大豆分離蛋白,可考慮其作為乳化劑的成分以及乳化產(chǎn)品中的添加物。內(nèi)源酶系及蛋白的組成與結(jié)構(gòu)的研究分析對(duì)于磷蝦的儲(chǔ)藏和利用具有重要意義。南極磷蝦6批樣品的品質(zhì)分析結(jié)果可作為冷凍磷蝦工業(yè)原料是否合格的質(zhì)量參考標(biāo)準(zhǔn),為南極磷蝦的工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

總之,南極磷蝦蛋白的加工特性的研究,可對(duì)南極磷蝦蛋白及其制品的加工利用提供重要的理論依據(jù)和方向參考,以使磷蝦蛋白資源得到更科學(xué)、合理的利用。

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PhysicochemicalpropertiesandprocessingcharacteristicsofAntarctickrill(Euphausiasuperba)muscle

XUBei-bei1,HULing-ping1,JIANGXiao-ming1,YINLi-ang1,XUEYong1,XUEChang-hu1,*,YANGJun-ling2

(1.College of Food Science and Technology,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2.Key Laboratory of Cryogenics,Technical Institute of Physics and Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)

The physical and chemical properties of the muscle and the processing characteristics of the protein were studied with frozen Antarctic krill as raw material. Antarctic krill protein has a balanced amino acid composition and the total amount of essential amino acids reached 485.9 mg/g protein. The content of myofibrillar protein account for only about 20% of the frozen protein due to the degradation during the freezing period. The secondary structure of the protein was mainly composed ofα-helix and irregular curl,the bind of protein and lipid was closely distributed regularly. Studies on the processing properties(structural properties,solubility,emulsifying properties,foaming properties and so on)of the protein showed that Antarctic krill protein has higher emulsifying activity,lower foaming activity and better solubility in 0.6 mol/L salt solution,compared with soy isolate protein,frozen krill protein is lost gel performance compared with the ability of forming viscoelastic gel properties of shrimp. Endogenous protease have tryptase properties and possess the highest activity,at 45 ℃,pH8.0. Endogenous lipase belongs to low temperature enzyme,which has relatively high activity in the range of 5～50 ℃. The reference standard of frozen Antarctic krill as industrial raw materials has been established,namely TVB-N≤30 mg N/100 g,alkali-soluble protein≤5.00%,FFA≤5.00% lipid,LPC≤4.00% lipid. The study of this paper provides the basic data for the utilization of Antarctic krill protein,which is of theoretical and practical significance for the high value utilization of Antarctic krill.

Antarctic krill;protein;processing characteristics;physicochemical properties;TVB-N;Folin-phenol

2017-03-29

徐蓓蓓(1992-),女,碩士研究生,研究方向:食品化學(xué)與營養(yǎng)支持,E-mail:xubeibei2017@163.com。

*

薛長(zhǎng)湖(1964-),男,博士,教授,研究方向:水產(chǎn)品加工,E-mail:xuech@ouc.edu.cn。

山東省科技重大專項(xiàng) 海洋食品現(xiàn)代加工與產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量控制體系研究(2015ZDZX05003);國家自然科學(xué)基金 魚肉蛋白/多糖復(fù)合凝膠過程及高溫?zé)岱€(wěn)定性機(jī)理與調(diào)控(31571865);“中國科學(xué)院低溫工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”開放課題資助。

TS254.4

A

1002-0306(2017)21-0056-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.012