超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)干果中16種真菌毒素

王玉嬌+聶繼云+閆震+李志霞+程楊+張曉男

摘 要 建立了同時(shí)檢測(cè)10種常見(jiàn)干果中16種真菌毒素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。將干果可食部分加水勻漿，以10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液為提取劑，C18為凈化劑，使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離樣品，在優(yōu)化的洗脫梯度和時(shí)間條件下，16種真菌毒素在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好分離，檢出限為0.02～1.00 μg/L； 在線性范圍 （1～200 μg/L） 內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R>0.9981，3個(gè)添加水平的平均回收率為70.48%～118.85%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 為0.3%～11.9%。本方法經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單、高效，能夠滿足不同干果基質(zhì)中多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)要求。

1 引 言

我國(guó)是干果第一生產(chǎn)大國(guó)，主產(chǎn)干果有核桃 （Walnut）、板栗 （Chinese chestnut）、榛子 （Hazelnut）、松子 （Pine nut）、杏仁 （Almond）、無(wú)花果干 （Dried fig）、桂圓干 （Dried longan）、紅棗 （Chinese jujube）、葡萄干 （Raisin） 、柿餅 （Dried persimmon） 等。干果對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)體質(zhì)、預(yù)防疾病有極好的功效[1，2]。干果生長(zhǎng)成熟期（果殼裂開(kāi)）、采后處理（去殼、清洗等）及儲(chǔ)藏過(guò)程中可能被產(chǎn)毒真菌侵染[3]。據(jù)歐盟食品和飼料快速預(yù)警體系 （The Rapid Alert System for Food and Feed， RASFF）的通報(bào)數(shù)據(jù)顯示，2008～2014年，在被通報(bào)的26種食品安全風(fēng)險(xiǎn)因素中，真菌毒素通報(bào)數(shù)量始終在前三位，而堅(jiān)果及其制品和種子類是被通報(bào)次數(shù)最多的食品種類[4，5]。在干果中檢出的真菌毒素主要有黃曲霉毒素 （Aflatoxin， AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）[6～8]、恩鐮孢菌素 （Enniatine， ENA、ENA1、ENB、ENB1）[8]、白僵菌素 （Beauvericin， BEA）[8]、交鏈孢酚 （Alternariol， AOH）[8]、交鏈孢酚單甲醚（Alternariolmonomethyl ether， AME）[7]、騰毒素（Tentoxin， TEN）[8]、赭曲霉素（Ochratoxin， OTA、OTB）[8～11]、玉米赤霉烯酮（Zearalenone， ZEA）[10～12]、T2毒素[12，13]等16種。我國(guó)食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)（GB2761 2017）對(duì)4種毒素（AFB1、OTA、T2和ZEA）作出了限量標(biāo)準(zhǔn)，但只有AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍包括干果產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定熟制堅(jiān)果及籽類中AFB1含量低于5 μg/kg，杏仁、榛子中低于15 μg/kg[14，15]。

多種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)方法包括樣品前處理和儀器分析兩大步，其中以快速（Quick）、簡(jiǎn)單（Easy）、經(jīng)濟(jì)（Cheap）、高效（Effective）、穩(wěn)定（Rugged）、安全（Safe）得名的QuEChERS前處理方法，具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、處理步驟少、可實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)凈化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于真菌毒素檢測(cè)[16，17]。本研究選擇該樣品前處理方法處理樣品。常用的儀器分析方法有氣相色譜（Gas chromatography， GC）[18]，液相色譜（Liquid chromatography， LC）[19，20]以及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 （GCMS）[21]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （LCMS）[22，23]等，其中超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry， UPLCMS/MS）能滿足多組分、高通量、快速定性和定量分析。

如今食品安全備受關(guān)注，而相關(guān)研究報(bào)道涵蓋的干果基質(zhì)和真菌毒素種類不全面，主要集中在核桃[6，9，12]、無(wú)花果干[9，12]、杏仁[10，11]中的黃曲霉毒素[6，9，11，12]、赭曲霉毒素[11～13]。如白春林等[6]對(duì)湖北省市售堅(jiān)果及籽類中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2進(jìn)行了檢測(cè)分析，Trucksess等[9]對(duì)葡萄干、無(wú)花果中的AFB1、OTA進(jìn)行了檢測(cè)分析。現(xiàn)有的多種真菌毒素檢測(cè)方法適用的基質(zhì)一般為1～ 5種[10，11]，液相梯度洗脫時(shí)間在8 min以上[7，10，13]，如文獻(xiàn)[13]和[29]中建立的檢測(cè)方法分別在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)10種毒素和11種毒素的同時(shí)檢測(cè)。本研究以我國(guó)主產(chǎn)的10種干果為基質(zhì)，通過(guò)對(duì)比4種提取劑的提取效果。選擇并優(yōu)化凈化劑用量和液相梯度洗脫條件，建立了干果中16種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLCMS/MS Xevo TQ， 美國(guó)Waters公司）； CF16RXII立式大容量高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）； MilliQDirecet 8全自動(dòng)超純水機(jī)（美國(guó) Millipore 公司）； ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國(guó) Waters 公司）； 九陽(yáng)料理機(jī)（JYLC20， 中國(guó)九陽(yáng)有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸和檸檬酸（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； C18（50 μm， 6 nm）、 PSA （40 μm， 100 g） （美國(guó)Varian 公司）； 無(wú)水MgSO4 （優(yōu)級(jí)純，天津市津科精細(xì)化工研究所）； NaCl （優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 尼龍有機(jī)濾膜 （Nylon，美國(guó)FINE Scientific公司）； 黃曲霉毒素 （AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉素 （OTA、OTB）、玉米赤霉烯酮、T2毒素、恩鐮孢菌素 （ENA、ENA1、ENB、ENB1）、白僵菌素、交鏈孢酚、交鏈孢酚單甲醚和騰毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，新加坡Pribolab公司）。endprint

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品，ENA、ENA1、ENB、ENB1和BEA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，其余毒素標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解，分別定容至5 mL，均配成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液； 準(zhǔn)確吸取16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各適量，以乙腈定容，得到10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，

用10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液和空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)液逐級(jí)稀釋成200、 100、 50、 20、 10、 5.0、 2.0和1.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 樣品前處理

取10種干果的可食部分100 g，按表1所示加水量勻漿處理； 準(zhǔn)確稱取一定量勻漿（表1）于50 mL離心管中，加入10 mL提取液，劇烈振蕩3 min； 加入NaCl（1 g）和無(wú)水MgSO4（4 g），劇烈振蕩1 min； 9000 r/min 離心5 min。吸取5 mL上清液于10 mL離心管，加入200 mg C18，渦旋1 min，靜置40 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，待測(cè)。

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

以核桃空白基質(zhì)為代表，添加100 μg/L的16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，靜置1 h，按2.3節(jié)所述方法進(jìn)行前處理。

2.5 UPLCMS/MS條件

色譜條件： ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱； 柱溫： 40℃； 流動(dòng)相A為乙腈，B為含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液； 梯度洗脫程序： 0.0～1.0 min，5%A； 1.0～3.2 min，5%～50% A； 3.2～5.4 min，50%～95% A； 5.4～7.7 min，95% A； 7.7～8.0 min，95%～5% A。流速： 0.4 mL/min； 進(jìn)樣體積： 5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)： 電噴霧離子源（ESI）； 掃描方式： 正負(fù)同時(shí)掃描； 毛細(xì)管電壓： 0.5 kV； 檢測(cè)方式： 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）； 離子源溫度： 150℃； 去溶劑氣溫度： 400℃； 去溶劑氣： 氮?dú)猓?00 L/h； 錐孔氣： 氮?dú)猓?0 L/h。其它參數(shù)見(jiàn)表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取劑的選擇

如圖1所示，參考文獻(xiàn)[23]，通過(guò)添加回收實(shí)驗(yàn)對(duì)比了0.1%甲酸乙腈溶液（a，酸性）、乙腈（b，中性）、乙腈水甲酸（79∶20∶1，V/V）混合溶液（c，酸性極性）和 10 mmol/L

圖1 16種真菌毒素經(jīng)4種提取劑提取的回收率

Fig.1 Recoveries of 16 kinds of mycotoxins by four kinds of extracting agents

1： AFB1， 2： AFG1， 3： AFB2， 4： AFG2， 5： OTB， 6： OTA， 7： T2， 8： ENB， 9： ENB1， 10： ENA， 11： BEA， 12： AOH， 13： ZEA， 14： AME， 15： TEN， 16： ENA1. a， 0.1% formic acid （FA）acetonitrile （ACN）； b， ACN； c， ACNwaterTA （79∶20∶1， V/V）； d， 10 mmol/L citric acid in ACN.

檸檬酸乙腈溶液（d，酸性）4種提取劑的提取效果。其中c組回收率在120.75%～183.75%之間，不能滿足檢測(cè)要求； 其余3組回收率在76.15%～124.30%之間，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS（STATISTICAL ANALYSIS SYSTEM）分析， b組和d組回收率方差呈現(xiàn)顯著差異，且前者方差大于后者，說(shuō)明10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液提取的16種真菌毒素回收率更接近100%，因此棄用乙腈； 而a組和d組回收率方差無(wú)明顯差異，考慮到檸檬酸比甲酸更經(jīng)濟(jì)環(huán)保，因此選取10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液作為本研究方法的提取劑。

3.2 凈化劑選擇及用量

參考EN 15662[25]中的凈化方法，首先考察PSA和C18對(duì)16種真菌毒素的吸附情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。OTB、OTA和AOH在3個(gè)PSA用量（低20 mg/mL、中50 mg/mL、高100 mg/mL）下的回收率都低于51.30%，表明PSA對(duì)OTB、OTA和AOH有強(qiáng)烈吸附； 而3個(gè)C18用量（低10 mg/mL、中30 mg/mL、高50 mg/mL）下16種真菌毒素平均回收率分別為90.58%、80.07%、76.43%，但C18用量為50 mg/mL時(shí)，BEA、ENA、ENA1、ENB和ENB1的回收率低于53.45%。采用50、100、150、200、300和450 mg C18添加量梯度做添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算樣品基質(zhì)溶液的基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME（ME = B/A×100%，B為目標(biāo)化合物在空白基質(zhì)中的響應(yīng)值，A為目標(biāo)化合物在提取液中的響應(yīng)值））[26]，通過(guò)回收率和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)凈化效果[26]。由圖3A可見(jiàn)，C18添加量為150、200、300和450 mg時(shí)，16種毒素的回收率在75.60%～111.8%之間； C18添加量為200 mg時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)在57.55%～116.44%之間（圖3B），利用SAS軟件分析200 mg C18添加量與其它3種添加量（150、300和450 mg）的基質(zhì)效應(yīng)方差差異性，結(jié)果200 mg添加量的基質(zhì)效應(yīng)方差小于其它3種添加量且差異極顯著，因此選擇添加200 mg的C18進(jìn)行凈化。但葡萄干、紅棗、柿餅等基質(zhì)中的色素不能被去除，有待進(jìn)一步優(yōu)化。

3.3 梯度洗脫時(shí)間和條件優(yōu)化

以乙腈（A）和含0.5%甲酸的10 mmol/L乙酸銨溶液（B）為流動(dòng)相，分別在8、10和15 min內(nèi)對(duì)16種真菌毒素總離子流進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)16種真菌毒素在8 min內(nèi)完全出峰。考察了3個(gè)梯度洗脫條件（表3）的效果，結(jié)果在2.5節(jié)所述梯度洗脫條件（表3a）下，16種真菌毒素（濃度200 μg/L）峰形最佳且分離良好（圖4）； 文獻(xiàn)[13]和文獻(xiàn)[28]中建立的檢測(cè)方法分別在10 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)10種毒素和11種毒素，文獻(xiàn)[29]建立的方法在7 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)14種毒素[13，27，29]，而本方法在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了16種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)，與之前報(bào)道的同類方法相比，在更短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了更多真菌毒素同時(shí)檢測(cè)。endprint

3.4 線性范圍及檢出限

在2.5節(jié)所述條件下測(cè)定16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，以峰面積對(duì)各真菌毒素進(jìn)行線性回歸分析，以核桃空白基質(zhì)樣品為基質(zhì)，參考文獻(xiàn)[30]利用低濃度添加回收（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.00、2.00和5.00 μg/L）得出方法檢出限和定量限。16種真菌毒素在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)大于0.9981，檢出限為0.02～1.00 μg/L，定量限為0.10～5.00 μg/L（表4），ENB、ENB1、ENA、ENA1、BEA的檢出限與文獻(xiàn)[8]一致，線性相關(guān)系數(shù)比文獻(xiàn)[8]略高，而黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）、赭曲霉毒素A、T2毒素和ZEA的檢出限比文獻(xiàn)[29]高，線性范圍窄于該文獻(xiàn)，但本研究同時(shí)檢測(cè)的真菌毒素種類更多，適用的基質(zhì)也更廣泛。

3.5 回收率和精密度

用10種干果空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，對(duì)線性范圍為1～20 μg/L的真菌毒素添加2、10和20 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)線性范圍在為5～200 μg/L的真菌毒素添加10、20和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。16種真菌毒素的平均回收率在70.48%～118.85%之間，RSD范圍為0.3%～11.9%，能夠滿足10種干果基質(zhì)中16種真菌毒素同時(shí)檢測(cè)的需要，且以核桃基質(zhì)為代表建立的前處理方法適用于其它9種基質(zhì)。

3.6 實(shí)際樣品分析

利用本方法對(duì)市售10種干果共30份樣品（每種干果3份樣品）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，17份（核桃2份，板栗2份，榛子1份，松子2份，杏仁1份，無(wú)花果3份，桂圓2份，紅棗2份，柿餅2份）樣品被檢出含有真菌毒素。16種真菌毒素除了T2和BEA其它均有檢出，其余14種真菌毒素檢出值為黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）