同時(shí)檢測動物性食品中6 種β—受體激動劑的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的建立

王建軍+熊雅婷+秦譽(yù)+楊恒峰+張鵬坤

摘 要：建立同時(shí)測定動物性食品中6 種β-受體激動劑（克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅）殘留的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。結(jié)果表明：6 種β-受體激動劑在豬肉樣品中的檢測限（limit of detection，LOD）分別為0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉樣品中的LOD分別為0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg；樣本的平均添加回收率為66.7%～106.4%，且批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于15%。在最優(yōu)條件下，西馬特羅的50%抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.254 μg/L，克倫特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅與西馬特羅的交叉反應(yīng)率分別為438.0%、470.0%、434.0%、561.0%和198.0%。同時(shí)，比較化學(xué)發(fā)光免疫分析方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographic-tandem mass spectrometric，LC-MS/MS）法的檢測結(jié)果，表明化學(xué)發(fā)光免疫分析方法具有較高的準(zhǔn)確度和可靠性。因此，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)動物性食品中多種β-受體激動劑藥物殘留的快速檢測，且靈敏度較高。

關(guān)鍵詞：化學(xué)發(fā)光免疫分析；動物性食品；β-受體激動劑

Simultaneous Determination of 6 β-agonists in Animal-Derived Food by Chemiluminescence Immunoassay

WANG Jianjun1， XIONG Yating2，*， QIN Yu2， YANG Hengfeng3， ZHANG Pengkun4

（1.Baoding Animal Products Quality Inspection and Monitoring Center， Baoding 071000， China； 2.Beijing WDWK Biotechnology Co. Ltd.， Beijing 100095， China； 3.Hezhou Municipal Bureau of Fishery and Veterinary Medicine， Hezhou 542800， China； 4.Fushun Animal Disease Prevention and Control Center， Fushun 113006， China）

Abstract： In this paper， a chemiluminescence immunoassay （CLIA） for simultaneously detecting 6 β-agonist drugs residues in animal-derived food was established. The limits of detection （LODs） for clenbuterol， cimaterol， bromobuterol， bambuterol， mabuterol and sibuterol in pork were 0.48， 1.96， 0.41， 0.29， 0.42 and 0.87 μg/kg， respectively， and in mutton were 0.37， 1.78， 0.43， 0.38， 0.31 and 0.96 μg/kg， respectively. Mean recoveries from spiked samples ranged from 66.7% to 106.4%， and the intra-assay and inter-assay relative standard deviation （RSD） values were less than 15%. The half maximal inhibitory concentration （IC50） of cimaterol was 0.254 μg/L under optimum conditions， and its cross-reaction rates with clenbuterol， bromobuterol， bambuterol， mabuterol and sibuterol were 438.0%， 470.0%， 434.0%， 561.0% and 198.0%， respectively. The developed immunoassay was more accurate and reliable than liquid chromatographic-tandem mass spectrometric

（LC-MS/MS）. Therefore， chemiluminescence immunoassay proved to be an effective analytical technique for monitoring β-agonist drug residues in animal-derived food owing to its high sensitivity.

Key words： chemiluminescence immunoassay； animal-derived food； β-agonist

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201710007

中圖分類號：S854.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）10-0036-05

β-受體激動劑能夠增強(qiáng)心臟收縮、擴(kuò)張骨骼肌血管和支氣管平滑肌，在獸醫(yī)和臨床上用于治療休克和支氣管痙攣，對牛、羊、豬、家禽等多種動物具有提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加瘦肉率的作用[1-4]。然而，人類長期食用有β-受體激動劑殘留的動物性食品會引起中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[5-6]。因此，各國已明確禁止在食源性動物中使用β-受體激動劑類藥物[7-9]，但是由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，目前在畜牧生產(chǎn)中使用β-受體激動劑藥物的現(xiàn)象仍有發(fā)生，因而建立高靈敏度的β-受體激動劑檢測方法對食品安全具有重要意義。

目前，β-受體激動劑的檢測方法主要包括液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass

spectrometry，GC-MS）法[12]和酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[13-14]。

LC-MS/MS儀和GC-MS儀的方法靈敏度高，常被作為定量確證方法，但是其設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、分析時(shí)間較長，無法滿足現(xiàn)場大批量樣本的檢測需求。ELISA檢測速度快、操作便捷，但是靈敏度和準(zhǔn)確度仍有待提高，只能作為初篩手段，因此尋找快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測方法是目前β-受體激動劑檢測方法的研究趨勢[15-16]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)[17-20]是借助于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高特異性而建立的一種測定方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、方法穩(wěn)定、快速、檢測范圍寬、操作簡單及自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法。高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)已被研究人員認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于免疫分析、環(huán)境生物醫(yī)藥科學(xué)和臨床化學(xué)等方面，成為藥物殘留檢測發(fā)展的一種趨勢[21-23]。

本研究基于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，建立同時(shí)檢測豬肉、羊肉等動物性食品中6 種β-受體激動劑（克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅）殘留的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，同時(shí)將檢測結(jié)果與LC-MS/MS法[24]進(jìn)行比較，驗(yàn)證方法的可行性，更好地滿足我國食品企業(yè)和政府職能監(jiān)管部門開展檢測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、羊肉 北京大型超市；6 種β-受體激動劑（克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 美國Sigma

公司；濃縮洗滌液（20 mmol/L的磷酸緩沖液）、魯米諾發(fā)光底物液（純度98%） 北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BILON-WX08型高速電動勻漿機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；HQ-60型恒溫振蕩器 北京方正生物科技發(fā)展有限公司；TDL-40C型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Thremo-F2型微量移液器 美國Thermo公司；Agilent 1200高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Cobas E411型全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半抗原的制備

稱取半抗原原料（本實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì)）500 mg，用5 mL叔丁胺溶解，攪拌，反應(yīng)完全后旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，進(jìn)行柱層析純化；用5 mL N，N-二甲基甲酰胺

（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解，在冰浴條件下加入90.6 mg NaH攪拌，加入396 μL 4-溴丁酸乙酯，40 ℃加熱反應(yīng)，反應(yīng)完全后將溶液置于冰水中，析出沉淀用甲醇溶解后，加入1 mol/L的NaOH進(jìn)行水解，調(diào)節(jié)pH值至6.0，將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，收集固體，即得半抗原。

1.3.2 包被原溶液的制備

將11.01 mg半抗原用1.5 mL DMF溶解，加入21.5 mg 1-（3-二甲基胺丙基）-3-乙基碳二亞胺

（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide，EDC）溶解、活化。同時(shí)取牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）50 mg溶于3.5 mL 0.1 mol/L的碳酸氫鈉溶液，將上述半抗原混合溶液逐滴加至BSA混合溶液中，冰浴攪拌24 h，裝入透析袋，在磷酸緩沖液中透析3 d，得到包被原溶液。

1.3.3 抗體工作液的制備

取10 mg BSA，用pH 7.4、0.02 mol/L PBS緩沖液溶解并定容至1 000 mL，得到抗體稀釋液；將本實(shí)驗(yàn)室制備的多克隆抗體用抗體稀釋液稀釋至1.5×105 倍，得到多克隆抗體工作液（質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL）。

1.3.4 方法操作步驟

準(zhǔn)確稱?。?.00±0.01） g均質(zhì)后的樣品，加入3 mL 0.5%的三氯乙酸，高速渦旋、離心；取1 mL中間層清液，加入40 μL 0.5 mol/L的NaOH溶液，充分混勻，制得樣品溶液，待測。

向已包被抗原的化學(xué)發(fā)光微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測樣品溶液（50 μL/孔），再加入抗體工作液（50 μL/孔），室溫反應(yīng)20 min，棄去上清液，洗滌4 次，用吸水紙拍干，每孔加入100 μL新鮮配制的發(fā)光底物液（A液和B液等體積混合），用化學(xué)發(fā)光儀檢測每孔的光子數(shù)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在PBS緩沖液中加入β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品，使其質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測。以β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以百分光子計(jì)數(shù)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制6 種β-受體激動劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品均重復(fù)測定5 次，計(jì)算50%抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），以IC50值最大的物質(zhì)為基準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)交叉反應(yīng)率計(jì)算其他5 種藥物的含量。

1.3.6 方法學(xué)評價(jià)

檢測限（limit of detection，LOD）：以LOD作為靈敏度指標(biāo)。取20 份豬肉和羊肉空白樣本進(jìn)行檢測，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到β-受體激動劑的濃度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定平均值+3 倍標(biāo)準(zhǔn)差即為該樣本的LOD[25]。

準(zhǔn)確度和精密度：選取豬肉和羊肉空白樣本，分別添加克倫特羅、溴布特羅、班布特羅和馬布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，使其添加量分別為0.5、1.0 μg/kg；添加西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品，使其添加量分別為2.0、4.0 μg/kg；添加西布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，使其添加量分別為1.0、2.0 μg/kg。每個(gè)樣品均重復(fù)測定10 次，連續(xù)測定3 d，計(jì)算平均添加回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

特異性：是指抗體與結(jié)構(gòu)不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力，常用交叉反應(yīng)率表示[26]。選擇具有類似結(jié)構(gòu)和功能的藥物，本研究按照1.3.5節(jié)所述方法測定萊克多巴胺和齊帕特羅的IC50，以西馬特羅的IC50為基準(zhǔn)，按照下式計(jì)算各藥物與西馬特羅的交叉反應(yīng)率。

1.3.7 樣品測定

為評價(jià)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的準(zhǔn)確性，將檢測結(jié)果與采用LC-MS/MS測得的結(jié)果進(jìn)行對比。

LC條件：C18色譜柱，流動相為0.1%甲酸-乙腈（95∶5，V/V），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。MS條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）正離子模式（ESI+），溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，脫溶劑氣流速900 L/min，錐空氣流速

50 L/min，毛細(xì)管電壓2.8 kV，多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitorin，MRM）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

本研究設(shè)計(jì)的半抗原結(jié)構(gòu)最大限度地保留了6 種β-受體激動劑的共同免疫活性基團(tuán)，檢測時(shí)，待測樣本溶液中的β-受體激動劑與化學(xué)發(fā)光板上的包被原競爭一抗，然后與酶標(biāo)二抗進(jìn)一步結(jié)合，加入魯米諾化學(xué)發(fā)光底物液，發(fā)光強(qiáng)度與待測樣本溶液中β-受體激動劑的含量呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出待測樣本溶液中β-受體激動劑的殘留量[27]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

6 種β-受體激動劑藥物中，西馬特羅的IC50最大，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.267 0lnx+0.732 9（R2=0.998 8），IC50=0.254 μg/L，線性范圍為0.072～1.800 μg/L。

2.3 檢測限

由表1可知，克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅在豬肉中的LOD分別為0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉中的LOD分別為0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

由表2可知，克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅在豬肉、羊肉樣品中的平均添加回收率為66.7%～106.4%；批內(nèi)、批間RSD均小于15%，說明化學(xué)發(fā)光免疫分析法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.5 交叉反應(yīng)率

以西馬特羅的IC50為基準(zhǔn)計(jì)算交叉反應(yīng)率，由表3可知，克倫特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅、西布特羅均與西馬特羅有較高的交叉反應(yīng)率；萊克多巴胺、齊帕特羅與西馬特羅的交叉反應(yīng)率極低，說明本方法特異性強(qiáng)，符合檢測需求。

2.6 2 種方法的對比

LC-MS/MS法的實(shí)際檢測結(jié)果如圖1所示。

LC-MS/MS法對克倫特羅、溴布特羅、馬布特羅和西馬特羅的LOD均為0.5 μg/kg[27-28]。由表4可知，

LC-MS/MS法檢測得到具體β-受體激動劑藥物的含量，其檢出總量與化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的結(jié)果基本一致。2 組檢測結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析的結(jié)果表明，

P=0.558>0.05，說明2 種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異，進(jìn)一步證實(shí)了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的測定準(zhǔn)確性。此外，與LC-MS/MS法相比，化學(xué)發(fā)光免疫分析法操作便捷、準(zhǔn)確度高，便于在現(xiàn)場大批量樣本檢測中推廣。

3 討 論

目前，關(guān)于動物性食品中β-受體激動劑高通量、多殘留量的檢測研究報(bào)道較少[28-30]，且檢測藥物單一。本研究通過人工合成抗原，基于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，同時(shí)檢測豬肉和羊肉樣品中6 種β-受體激動劑藥物殘留。結(jié)果表明，克倫特羅、西馬特羅、溴布特羅、班布特羅、馬布特羅和西布特羅在豬肉樣品中的LOD分別為0.48、1.96、0.41、0.29、0.42、0.87 μg/kg，在羊肉樣品中的LOD分別為0.37、1.78、0.43、0.38、0.31、0.96 μg/kg，樣本的平均添加回收率在66.7%～106.4%之間，批內(nèi)、批間RSD均小于15%；交叉反應(yīng)率計(jì)算結(jié)果表明本方法對

β-受體激動劑類藥物的特異性良好。與王碩[31]、李細(xì)芬[32]

等的克倫特羅單一藥物化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法相比，本研究覆蓋的藥物種類更全面。

本研究所建立化學(xué)發(fā)光免疫分析法的LOD、準(zhǔn)確度和精密度均符合我國殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與LC-MS/MS法無顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)了本方法的實(shí)用性。且本方法操作步驟簡單，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣本檢測，無需大量化學(xué)試劑，減少了人力、物力和財(cái)力的浪費(fèi)，有效降低檢測成本，適用于基層食品安全檢測單位及肉制品加工生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行日常監(jiān)管工作。

綜上所述，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)能夠用于快速同時(shí)檢測動物源性食品中多種β-受體激動劑類藥物的殘留，且靈敏度高、成本較低、檢測時(shí)間更短，具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性，能夠?yàn)槭称分蝎F藥殘留的高通量、快速檢測提供有力的技術(shù)支持。

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