內(nèi)源性大麻素誘發(fā)脊髓傷害性回路的去抑制效應(yīng)*

杜詩斌 王 群 何曉蘭 張 曉 顧 楠 袁宏杰 呂 巖

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院疼痛科，西安710032）

·論 著·

內(nèi)源性大麻素誘發(fā)脊髓傷害性回路的去抑制效應(yīng)*

杜詩斌 王 群 何曉蘭 張 曉 顧 楠 袁宏杰 呂 巖Δ

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院疼痛科，西安710032）

目的：觀察內(nèi)源性大麻素2-AG對(duì)脊髓背角淺層傷害性突觸傳遞的影響。方法：選用5～6周雄性SD大鼠，麻醉后用人工腦脊液快速灌注心臟，取出脊髓腰膨大段，制備保留后根的脊髓旁矢狀位切片。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄脊髓背角II層膠狀質(zhì)神經(jīng)元，脊髓后根電刺激誘發(fā)初級(jí)傳入和記錄神經(jīng)元之間的突觸后電位。在脊髓切片上灌流2-AG，觀察其對(duì)Aδ和C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位 (eEPSPs) 或抑制性突觸后電位(eIPSPs)的影響。結(jié)果：2-AG顯著抑制Aδ和C纖維介導(dǎo)的eIPSPs的幅度(P＜ 0.01)，而對(duì)eEPSPs無明顯影響。結(jié)論：內(nèi)源性大麻素2-AG可抑制脊髓背角淺層Aδ和C纖維介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞，發(fā)揮去抑制效應(yīng)，但對(duì)興奮性突觸傳遞影響不大，提示內(nèi)源性大麻素可能參與抑制性脊髓回路功能降低導(dǎo)致的中樞敏化過程。

內(nèi)源性大麻素；脊髓背角；去抑制；抑制性突觸后電位

神經(jīng)病理性疼痛是醫(yī)學(xué)界亟待攻克的難題，與生理性疼痛相比，病理性疼痛不僅表現(xiàn)在刺激-感覺強(qiáng)度的量變上，更表現(xiàn)在刺激-感覺模式的質(zhì)變上，病理性疼痛的發(fā)生和持續(xù)慢性化過程可能累及整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能可塑性變化[1]。因此闡明病理性疼痛的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，尋找潛在的藥物靶點(diǎn)具有重要意義。脊髓背角由初級(jí)傳入神經(jīng)纖維、中間神經(jīng)元、投射神經(jīng)元，以及上位中樞下行投射等成分共同形成了復(fù)雜的神經(jīng)環(huán)路，是傷害性信息傳遞及整合的初級(jí)中樞。在外周組織損傷后，產(chǎn)生的持續(xù)性傷害性沖動(dòng)傳遞至脊髓背角。脊髓背角是疼痛持續(xù)慢性化病理過程的重要參與者，表現(xiàn)為脊髓背角傷害性神經(jīng)元的激活和敏化[2]，抑制性中間神經(jīng)元功能降低[3]，以及膠質(zhì)細(xì)胞活性增強(qiáng)[4]。其中抑制性中間神經(jīng)元的功能在調(diào)控傷害性信息傳遞以及中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用[5]。

近年來內(nèi)源性大麻素(endocannabinoids, eCBs)系統(tǒng)在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用越來越引起關(guān)注。eCBs系統(tǒng)由配體2-arachidonoylglycerol (2-AG)和 Anandamide (AEA)、受體 cannabinoid receptor 1 (CB1) 和 cannabinoid receptor 2 (CB2)、轉(zhuǎn)運(yùn)體、合成酶及水解酶等組成[6]。盡管大多數(shù)關(guān)于eCBs系統(tǒng)的研究主要集中在鎮(zhèn)痛機(jī)制中的作用[7]，但值得注意的是有報(bào)道大麻素在有些情況下并不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，有時(shí)甚至起到致痛作用，2009年Christie MJ提出了一個(gè)新的假說：eCBs可開啟疼痛閘門[8]，但一直未得到證實(shí)。CB1受體在脊髓背角廣泛表達(dá)[9]，激活CB1受體對(duì)脊髓背角傷害性突觸傳遞有何影響并不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)，在保留后根的脊髓切片中外源性灌流大麻素配體2-AG，模擬病理性狀態(tài)下內(nèi)源性大麻素含量升高，觀察其對(duì)Aδ和C纖維介導(dǎo)的興奮性或抑制性突觸后電位的影響，從而進(jìn)一步揭示其鎮(zhèn)痛或致痛機(jī)理，為更規(guī)范的臨床應(yīng)用提供理論參考。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用5～6周，體重120～180 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠。由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司），2-AG (Sigma，美國(guó))，Axopatch200B膜片鉗放大器(Axon，美國(guó))，Grass刺激器、隔離器(Grass，美國(guó))。微電極拉制儀MODEL P-97 (Sutter，美國(guó))，有芯玻璃電極TW150F-4 (WPI，美國(guó))，震動(dòng)切片機(jī)VT1200S (Leica，美國(guó))。

3.主要實(shí)驗(yàn)溶液的配制

脊 髓 切 片 液（mM）：74 Sucrose, 82 NaCl,2.4 KCl, 1.15 NaH2PO4·H2O, 0.5 CaCl2, 1.1 MgCl2,25 NaHCO3, 1.5 Ascorbate, 2.8 Pyruvate。細(xì)胞外液(mM): 123 NaCl, 1.15 NaH2PO4， 2.0 CaCl2, 1.0MgCl2,3.0 Pyruvate, 26 NaHCO3, 25 D-glucose, 2.5 KCl, 1.3 Ascorbate。記錄電極內(nèi)液 (mM): 130 Kgluconate, 10 KCl, 4 Mg-ATP, 10 phosphocreatine, 0.3 Li-GTP, 10 Hepes。

4.電生理實(shí)驗(yàn)

電生理實(shí)驗(yàn)按照呂巖[10]等的全細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)方法，給予10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠（1.5 g/kg）。待大鼠麻醉后仰臥位固定，打開胸腔從心尖部插入灌流針至升主動(dòng)脈，給予脊髓切片液快速灌流?？焖偃〕黾怪糜?℃充分氧飽和的切片液中。在體視顯微鏡下打開椎板游離脊髓，除去蛛網(wǎng)膜后，切取腰膨大處約0.6～1 cm脊髓組織，保留一根完整的后根（0.8～1.2 cm），固定于瓊脂臺(tái)上。采用振動(dòng)切片機(jī)，行保留后根的脊髓旁矢狀位切片，切片厚度400～600 μm。將脊髓切片移置于細(xì)胞孵育槽內(nèi)，孵育液為細(xì)胞灌流液并持續(xù)充有95% O2和5% CO2，孵育溫度25℃，孵育時(shí)間為1～1.5 h。將孵育好的脊髓切片移置于脊髓片記錄槽，氧飽和灌流液持續(xù)灌流，用U型蓋網(wǎng)固定切片，采用suck電極將后根吸入電極內(nèi)以便刺激。

根據(jù)呂巖等[11]報(bào)道，在此實(shí)驗(yàn)條件下Aδ的傳導(dǎo)速度為1.85±0.20 m/s，C纖維的傳導(dǎo)速度為0.26±0.01 m/s。Aδ纖維刺激強(qiáng)度為0.6～1.3 V,C纖維刺激強(qiáng)度為2-6V。本實(shí)驗(yàn)中，通過刺激偽跡到eEPSC起始部的潛伏期除以保留的后根長(zhǎng)度（0.8～1 cm），計(jì)算出神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度，再根據(jù)誘發(fā)突觸后電位所需刺激強(qiáng)度綜合判斷實(shí)驗(yàn)中所誘發(fā)的突觸后電位為Aδ纖維或C纖維介導(dǎo)。刺激頻率0.1 Hz，每個(gè)刺激時(shí)長(zhǎng)0.1ms。用紅外相差顯微鏡定位脊髓背角淺層，選取立體感較強(qiáng)，邊緣清晰的膠狀質(zhì)(Substantia Gelatinosa, SG)神經(jīng)元。用加有電極內(nèi)液的玻璃微電極（電極阻抗為5～7 MΩ）高阻封接細(xì)胞后破膜，行全細(xì)胞記錄。

在電流鉗模式下，鉗制膜電位在-45mV左右，記錄15條后根刺激誘發(fā)的Aδ或C纖維介導(dǎo)的抑制性突觸后電位(Aδ-eIPSPs或C-eIPSPs)；或鉗制膜電位在-70 mV, 記錄15條后根刺激誘發(fā)的Aδ或C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位(Aδ-eEPSPs或C-eEPSPs), 取平均值作為基礎(chǔ)值。灌流2-AG (40 μM)8 min達(dá)到有效平衡濃度后，記錄15條同樣刺激誘發(fā)的抑制性或興奮性突觸后電位，取平均值作為實(shí)驗(yàn)組。充分洗脫后可恢復(fù)接近對(duì)照，證明細(xì)胞狀態(tài)良好，數(shù)據(jù)可靠。信號(hào)收集采用Axopatch200B膜片鉗放大器和pCLAMP10記錄軟件。

5.統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，兩組間的計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 2-AG顯著抑制Aδ纖維介導(dǎo)的抑制性突觸后電位

形成穩(wěn)定記錄后，鉗制膜電位在-45 mV左右，判定后根刺激誘發(fā)出的突觸反應(yīng)為Aδ纖維介導(dǎo)的Aδ-eIPSPs后，取基礎(chǔ)值作為對(duì)照。灌流2-AG（40 μM）8 min可明顯抑制Aδ-eIPSPs的幅度，洗脫20 min后Aδ-eIPSPs波幅恢復(fù)接近對(duì)照（見圖1AB）。其幅度絕對(duì)值由灌流前的12.0±4.8 mV降低至5.3±2.8 mV，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01,n= 4, 見圖1C）。

圖1 2-AG對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的抑制性突觸后電位幅度的影響A分別為灌流前、灌流中、洗脫后誘發(fā)的抑制性突觸后電位；B為三個(gè)不同階段平均綜合曲線；C為抑制性突觸后電位幅度的絕對(duì)值大小。Fig.1 Effects of 2-AG on the amplitude of Aδ fi ber mediated eIPSPs A: Superfusion of 2-AG (40μM) signi fi cantly suppressed the amplitude of Aδ fi ber mediated eIPSPs. B: Every trace was an average of 15 consecutive eIPSPs. C: The histogram showed the absolute value of eIPSPs amplitude. **P ＜ 0.01compared with control.

2. 2-AG顯著抑制C纖維介導(dǎo)的抑制性突觸后電位

形成穩(wěn)定記錄后，鉗制膜電位在-45 mV左右，判斷后根刺激誘發(fā)出的突觸后反應(yīng)為C纖維介導(dǎo)的C-eIPSPs后，取基礎(chǔ)值作為對(duì)照，灌流2-AG（40 μM）8 min可明顯抑制其幅度，洗脫20 min后恢復(fù)接近對(duì)照（見圖2AB）。其幅度絕對(duì)值由灌流前的13.5±3.6 mV降低至5.7±2.1 mV,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01,n= 4，見圖 2C）。

3. 2-AG對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位無明顯影響

形成穩(wěn)定記錄后，鉗制膜電位在-70 mV，確定記錄到的興奮性突觸后電位為Aδ纖維介導(dǎo)后，取基礎(chǔ)值作為對(duì)照。灌流2-AG（40 μM）8 min對(duì)Aδ介導(dǎo)的興奮性突觸后電位無明顯影響,繼續(xù)增加濃度（100 μM）對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的eEPSPs影響不明顯（見圖3AB）。在2-AG濃度為100 μM時(shí)，Aδ纖維介導(dǎo)的eEPSPs的幅度值由灌流前的15.0±2.2 mV至灌流后的14.8±2.9 mV,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05,n= 4,見圖3C）。

4. 2-AG對(duì)C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位無明顯影響

形成穩(wěn)定記錄后，鉗制膜電位在-70 mV，記錄到C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位，取基礎(chǔ)值作為對(duì)照，灌流2-AG（40 μM）8 min對(duì)C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位無明顯影響，繼續(xù)增加濃度（100 μM）對(duì)C纖維介導(dǎo)的eEPSPs影響不明顯（見圖4A, B）。在濃度為100 μM時(shí)，C纖維介導(dǎo)的eEPSPs幅度值由灌流前的14.2±2.5 mV至灌流后的13.1±2.0 mV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05,n=4, 見圖 4C）。

討 論

外周傷害性信息主要由Aδ和C纖維傳導(dǎo)，經(jīng)脊髓背角中間神經(jīng)元信息整合后再上傳至高位中樞[12]。脊髓背角中間神經(jīng)元既有興奮性也有抑制性神經(jīng)元，抑制性中間神經(jīng)元功能降低是神經(jīng)病理性疼痛的中樞敏化機(jī)制之一[13]。而抑制性神經(jīng)元功能降低的原因尚不清楚。近年來，eCBs系統(tǒng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性研究的熱點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)大麻素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的調(diào)控作用，包括痛覺、學(xué)習(xí)和記憶、帕金森疾病、藥物成癮等的調(diào)節(jié)作用[14]。內(nèi)源性大麻素CB1受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要位于谷氨酸能和 GABA 能神經(jīng)元突觸末梢，突觸后膜合成和釋放的eCBs通過激活突觸前膜上的 CB1受體，從而影響谷氨酸能和 GABA 能神經(jīng)元的突觸釋放功能[15]。

圖3 2-AG對(duì)Aδ纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位幅度的影響A分別為灌流前、灌流40 μM 2-AG、灌流100 μM2-AG后誘發(fā)的興奮性突觸后電位； B為三個(gè)不同階段平均綜合曲線； C為興奮性突觸后電位幅度值。Fig.3 Effects of2-AG on the amplitude of Aδ fi ber mediated eEPSPs A: Superfusion of 2-AG (40～100 μM) had little effect on the amplitude of Aδ fi ber mediated eEPSPs. B: Every trace was an average of 15 consecutive eEPSPs. C: The histogram showed the value of eEPSPs amplitude. P ＞ 0.05 compared with control.

本研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓切片中直接灌流2-AG，發(fā)現(xiàn)其可抑制傷害性纖維介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，而對(duì)興奮性傳遞無明顯影響，整體效應(yīng)表現(xiàn)為抑制性回路的功能降低，表明脊髓水平的內(nèi)源性大麻素含量升高可能參與脊髓傷害性回路的去抑制過程，提示eCBs可能介導(dǎo)了脊髓背角的敏化狀態(tài)。研究表明，外周神經(jīng)損傷以后，在形成神經(jīng)病理性疼痛的過程中，脊髓內(nèi)的eCBs水平明顯升高[16]，提示eCBs參與了這一病理過程，這為我們的觀點(diǎn)提供了有力支持。雖然本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的去抑制現(xiàn)象為短時(shí)程的突觸可塑性變化，但我們推測(cè)在病理狀態(tài)下，脊髓背角內(nèi)源性大麻素的含量是始終維持在高水平狀態(tài)，即去抑制效應(yīng)持續(xù)存在，從而介導(dǎo)了痛覺敏化。有報(bào)道稱，在脊髓背角抑制性中間神經(jīng)元上敲除CB1受體以后，給與辣椒素所誘發(fā)的痛覺過敏明顯緩解[17]，提示eCBs的受體CB1介導(dǎo)了熱痛覺過敏；最近有報(bào)道在燒灼痛模型鼠上給與CB1受體拮抗劑可以減輕灼傷后的痛覺過敏[18]，這些研究都是建立在不同的痛模型鼠上，發(fā)現(xiàn)干擾CB1受體減輕了痛覺過敏，均暗示CB1受體介導(dǎo)了痛覺過敏的發(fā)生，和我們的發(fā)現(xiàn)激活CB1受體減少了抑制性遞質(zhì)的釋放從而介導(dǎo)了脊髓背角的敏化狀態(tài)高度吻合。本研究是在正常大鼠脊髓切片上外源性應(yīng)用大麻素配體2-AG，模擬內(nèi)源性大麻素升高狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)其可介導(dǎo)去抑制效應(yīng)，而去抑制效應(yīng)本身就是神經(jīng)病理性疼痛的重要基礎(chǔ)[19]。若對(duì)于已經(jīng)形成的病理性狀態(tài)，再應(yīng)用大麻素，其效果和機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)2-AG應(yīng)用濃度是建立在探索性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)10～100 μM的濃度均可誘發(fā)去抑制效應(yīng)，故為了減少細(xì)胞毒性提高實(shí)驗(yàn)有效性，采用中等水平濃度，但應(yīng)用濃度并不一定和病理狀態(tài)下脊髓背角的實(shí)際濃度相吻合，這也是本實(shí)驗(yàn)的局限所在。

圖4 2-AG對(duì)C纖維介導(dǎo)的興奮性突觸后電位幅度的影響A分別為灌流前、灌流40 μM 2-AG、灌流100 μM2-AG誘發(fā)的興奮性突觸后電位；B為三個(gè)不同階段平均綜合曲線；C為興奮性突觸后電位幅度值。Fig.4 Effects of2-AG on the amplitude of C fi ber mediated eEPSPs A: Superfusion of 2-AG (40～100 μM) had little effect on the amplitude of C fiber mediated eEPSPs. B: Every trace was an average of 15 consecutive eEPSPs. C: The histogram showed the value of eEPSPs amplitude. P ＞ 0.05 compared with control.

我們推測(cè)，外周神經(jīng)損傷以后，由于炎癥反應(yīng)或其他機(jī)制，激活了內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，突觸后神經(jīng)元大麻素合成增加，作用于突觸前抑制性神經(jīng)元CB1受體，使抑制性神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少，促進(jìn)了脊髓背角痛覺敏化的形成。鑒于神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H僅研究了內(nèi)源性大麻素配體2-AG可減少脊髓背角抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但這種作用是不是神經(jīng)病理性疼痛中樞敏化的基礎(chǔ)仍需要深入研究。

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ENDOCANNABINOID INDUCES SYNAPTIC DISINHIBITION IN SPINAL NOCICEPTIVE CIRCUITS OF RATS*

DU Shi-Bin, WANG Qun, HE Xiao-Lan, ZHANG Xiao, GU Nan, YUAN Hong-Jie, LU YanΔ
(Department of Pain Medicine, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)

Objective: To determine the effects of endocannabinoid 2-AG on synaptic transmission of nociceptive circuits in spinal super fi cial dorsal horn of rats. Methods: 5～6 weeks old male Sprague-Dawley rats were anaesthetized and killed by heart perfusion of artificial cerebrospinal fluid. The lumbosacral enlargement of the spinal cord was quickly removed and cut into sagittal spinal slices with a single dorsal root attached. Whole-cell patch-clamp recordings were made in super fi cial spinal dorsal horn neurons (lamina I and II). Dorsal root electric stimulation was used to evoke the excitatory postsynaptic potentials (eEPSPs)or inhibitory postsynaptic potentials (eIPSPs) in neurons recorded. 2-AG was bath perfused onto spinal cord slices to observe the changes of amplitude of eIPSPs or eEPSPs. Results: Application of 2-AG in spinal cord slices markedly suppressed the amplitude of Aδ and C fi ber mediated eIPSPs (P＜ 0.05), but had little effect on Aδ and C fiber mediated eEPSPs. Conclusion: Endocannabinoid 2-AG may induce disinhibition of spinal nociceptive circuits through attenuating the inhibitory synaptic transmission in super fi cial spinal dorsal horn, suggesting that Endocannabinoid 2-AG is involved in the impairment of spinal inhibitory circuits and contributed to the development of central sensitization.

Endocannabinoids; Spinal dorsal horn; Disinhibition; IPSPs

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.02.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（31530090, 81471139）

△通訊作者 yanlu001@fmmu.edu.cn