龍膽瀉肝湯氯仿提取物抑制白念珠菌VVC臨床株水解酶活性

濮燕屏　王霞　馮鑫　邵菁　吳大強　汪天明　汪長中

[摘要]該研究探討龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）對白念珠菌VVC臨床株外分泌水解酶的影響。分別采用牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80）培養(yǎng)基對15株白念珠菌VVC臨床株進行分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶（PL）、脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選；牛奶平板法、蛋黃平板法、吐溫80平板法分別檢測CELX干預后， Sap，PL與Lip的活性變化；qRTPCR 檢測基因SAP1～7，10，PLB1～2，LIP3～6的表達量。結(jié)果可見，15株VVC臨床株的Sap，PL均為陽性，11株Lip陽性菌株。隨著CELX劑量的遞增，與空白對照組相比，各含藥培養(yǎng)基（牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基）上菌落的沉淀圈逐漸減小，當藥物達256 mg·L-1時，菌落沉淀圈幾乎消失，酶活力顯著減弱。qRTPCR 結(jié)果顯示，256 mg·L-1CELX時，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分別下調(diào)了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%；PLB1下調(diào)了67%；LIP3，LIP4，LIP6分別下調(diào)了51%，54%，55%。研究表明，CELX能抑制白念珠菌重要毒力因子天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶與脂肪酶的活性。

[關(guān)鍵詞]龍膽瀉肝湯氯仿提取物； 白念珠菌VVC臨床株； 分泌型天冬氨酸蛋白酶； 磷脂酶； 脂肪酶

[Abstract]To investigate the inhibitory effect and mechanism of chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX） against hydrolytic enzymes activity of Candida albicans isolated from vulvovaginal candidiasis（VVC） patients Secreted aspartyl proteinase（Sap）， phospholipase（PL） and lipase（Lip） positive strains were identified from 15 strains of C albicans with milk culture medium， egg yolk culture medium and tween80 medium， respectively Then， the activities of Sap， PL， and Lip were detected in the above media qRTPCR was used to detect the changes in gene expressions of aspartic protease（SAP17，10）， phospholipase B（PLB12） and lipase（LIP36） Secreted aspartyl proteinase and phospholipase of 15 VVC clinical strains were positive， and lipase of 11 strains were positive Compared with the blank control group， the drug CELXcontaining medium（milk medium， egg yolk culture medium， tween80 medium） experiment showed that the sedimentation of colonies decreased gradually in each culture medium with the increase of CELX dose When the concentration of CELX was 256 mg·L-1， the colony almost disappeared， which indicated the enzyme activity was significantly weakened The results of qRTPCR showed that SAP1， SAP2， SAP3， SAP4， SAP7， SAP9 and SAP10 were downregulated by 62%， 55%， 62%， 84%， 61%， 51%， 68%， respectively， except for SAP5 and SAP6； and PLB1， LIP3， LIP4， LIP6 were downregulated by 67%， 51%， 54%， 55%， respectively The findings suggested that CELX may inhibit the activities of Sap， PL， and Lip， which are important virulence factors of C albicans.

[Key words]chloroform extracts from Longdan Xiegan decoction（CELX）； Candida albicans isolated from vulvovaginal candidasis patients； secreted aspartyl proteinase（Sap）； phospholipase（PL）； lipase（Lip）

白念珠菌（Candida albicans，Ca）是一種常見的條件致病性真菌，在菌群失調(diào)或免疫力下降時可引起外陰陰道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）、鵝口瘡等黏膜感染，甚至系統(tǒng)性感染。白念珠菌的致病性與其多種毒力因子密切相關(guān)，其中分泌型天冬氨酸酶（secreted aspartyl proteinase，Sap）、磷脂酶（phospholipase，PL）、脂肪酶（lipase，Lip）等水解酶通過介導表型轉(zhuǎn)換、黏附、免疫逃逸等環(huán)節(jié)在菌體入侵宿主過程中發(fā)揮重要作用[1]。中藥復方龍膽瀉肝湯在臨床上常用于外陰陰道念珠菌?。╒VC）的治療[24]，但作用機制不詳。課題組近期研究證實，該復方的氯仿提取物對白念珠菌具有明顯的抑菌活性[5]，在此基礎上，本實驗擬進一步探討龍膽瀉肝湯氯仿提取物對白念珠菌VVC臨床株的毒力因子Sap，PL，Lip等水解酶的作用，為其治療VVC 提供實驗依據(jù)。endprint

1材料

11菌株15株白念珠菌VVC臨床株由合肥市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科陶瑞雪主任惠贈，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基確定為白念珠菌，純化后保存在沙氏固體培養(yǎng)基上。

12藥物與儀器龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）的制備按參考文獻方法進行[5]。ABI7000熒光定量PCR儀（美國生物應用系統(tǒng)公司）。

13培養(yǎng)基的配制牛奶培養(yǎng)基：稱取葡萄糖20 g，酵母粉2 g，KH2PO4 5 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌后冷卻至45 ℃，加入10 g無菌脫脂奶粉，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

蛋黃培養(yǎng)基：稱取葡萄糖30 g，蛋白胨10 g，NaCl 575 g，CaCl2 055 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，調(diào)整pH至55～60，高壓滅菌，冷卻至45 ℃左右加入無菌蛋黃80 mL，充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

酯酶培養(yǎng)基：稱取蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2 055 g，瓊脂15 g加入蒸餾水1 000 mL，高壓滅菌后冷卻至45 ℃，加入

5 mL聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80），充分混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿，4 ℃保存，備用。

2方法

21分泌型天冬氨酸酶（Sap）陽性菌株的篩選[6]微量移液器分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于已配好的牛奶培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)5 d。觀察菌落周圍有無沉淀圈，拍照，并用游標卡尺測量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實驗重復3次。

22磷脂酶（PL）陽性菌株的篩選[6]分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于蛋黃培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。觀察菌落周圍有無沉淀圈，有沉淀圈者為陽性菌株，測量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實驗重復3次。

23脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選[6]分別吸取15株VVC臨床株的菌懸液5 μL滴加于吐溫80培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)5 d。測量培養(yǎng)基上各菌落直徑和沉淀圈直徑，實驗重復3次。

24結(jié)果判定[6]Pz為菌落直徑與總直徑（菌落直徑+菌落周圍沉淀圈直徑）的比值[5]，各類水解酶的活性大小可采用Pz來表示：Pz為1表示無酶活力，090～099表示弱酶活力，080～089表示中度酶活力，070～079表示強酶活力，069以下表示極強酶活力。菌株的Pz為3次實驗測定值的平均值。通過比較各類水解酶的活性大小，從15株VVC臨床株篩選出分泌型天冬氨酸酶、磷脂酶、脂肪酶活性均較強的臨床株（CA09）進行下一步實驗。

25平板法檢測陽性菌株CA09的3種水解酶活性[6]分別在配制牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基的過程中加入不同劑量的CELX藥液，使得各培養(yǎng)基中CELX的終濃度分別為64，128，256 mg·L-1。微量移液器吸取CA09臨床株的菌懸液5 μL分別滴加于含藥的牛奶培養(yǎng)基、蛋黃培養(yǎng)基、吐溫80培養(yǎng)基表面，同時設置空白對照組，37 ℃培養(yǎng)5 d。測量各培養(yǎng)基上的菌落直徑和沉淀圈直徑，計算Pz，結(jié)果判定同24項。

26qRTPCR法檢測陽性菌株CA09的3種水解酶相關(guān)基因表達水平根據(jù)NCBI基因庫查得所需基因序列，并用Primer Premier 50 軟件設計所需引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物，各引物序列見表1。遵照TIANGEN公司FastQuant RT試劑盒（含gDNase）說明書的反應條件將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

3結(jié)果

31分泌型天冬氨酸酶（Sap）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株Sap均為陽性，且Pz均小于069，顯示酶活性均極強。見圖1與表2。

32磷脂酶（PL）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株P(guān)L均為陽性，酶活性強度不一，其中有

A，B培養(yǎng)皿中均為Sap活性極強的陽性菌株。

3株為強酶活力，12株為極強酶活力。見圖2與表2。

A，B培養(yǎng)皿中不同PL活性的陽性菌株。

33脂肪酶（Lip）陽性菌株的篩選15株白念珠菌VVC臨床株Lip活性強度不均一，其中有4株Lip陰性，3株呈強酶活力，8株呈極強酶活力，見圖3與表2。

A，B，C培養(yǎng)皿中不同Lip活性的菌株。

34CELX對陽性菌株CA09的Sap活力的影響在CELX干預下，隨著用藥濃度的遞增，白念珠菌VVC臨床株CA09的SAP酶分解牛奶培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的能力逐漸受到抑制，培養(yǎng)基中形成的沉淀圈逐漸減小，當CELX為256 mg·L-1時，幾乎無法觀察到菌株形成的沉淀圈，見圖4。

35CELX對陽性菌株CA09的PL活力的影響與空白對照組相比，隨著CELX劑量的增加，蛋黃培養(yǎng)基中菌落的沉淀圈逐漸減小，64 mg·L-1和128 mg·L-1CELX的沉淀圈變化不明顯，256 mg·L-1CELX的沉淀圈顯著減小，幾乎消失，見圖5。

A空白對照組；B 64 mg·L -1CELX；C128 mg·L -1CELX；D256 mg·L -1CELX（圖5，6同）。

36CELX對陽性菌株CA09的Lip活力的影響與空白對照組相比，隨著CELX劑量的遞增，吐溫80培養(yǎng)基中菌落的沉淀圈逐漸減。CELX為64 mg·L-1時，沉淀圈變化不明顯；128 mg·L-1時，沉淀圈較空白組顯著減??；

256 mg·L-1時，菌落沉淀圈幾乎消失，見圖6。

37CELX對陽性菌株CA09的SAP基因表達水平的影響與空白對照組相比，SAP基因均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。CELX在128 mg·L-1時，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7分別下調(diào)了55%，59%，69%，57%；256 mg·L-1時，除SAP5，SAP6外，SAP1，SAP2，SAP3，SAP4，SAP7，SAP9，SAP10分別下調(diào)了62%，55%，62%，84%，61%，51%，68%，見圖7。endprint

38CELX對陽性菌株CA09的PLB基因表達水平的影響與空白對照組相比，基因 PLB1，PLB2均有所下調(diào)。CELX在128 mg·L-1時，PLB1下調(diào)了55%；256 mg·L-1時PLB1下調(diào)了67%，見圖8。

39CELX對陽性菌株CA09的LIP基因表達水平的影響與空白對照組相比，基因LIP5在不同濃度的CELX干預下均有所下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學意義。128 mg·L-1CELX干預后，僅有LIP4下調(diào)了53%；CELX為256 mg·L-1時，LIP3，LIP4，LIP6分別下調(diào)了51%，54%，55%，見圖9。

4討論

龍膽瀉肝湯出自《醫(yī)方集解》，方中龍膽草大苦

大寒，瀉火除濕；黃芩、梔子亦苦寒，瀉肝膽濕熱；木通、澤瀉、車前子清利肝經(jīng)濕熱；生地黃、當歸養(yǎng)血滋陰；柴胡疏暢肝膽之氣，引諸藥入肝膽經(jīng)；甘草調(diào)和諸藥。方中諸藥合用，共奏瀉肝膽實火，清下焦?jié)駸?。中醫(yī)認為，外陰陰道念珠菌?。╒VC）的“帶下”、“陰癢”等表現(xiàn)多屬肝經(jīng)濕熱內(nèi)蘊，屬龍膽瀉肝湯主治范圍[7]。故龍膽瀉肝湯為歷代醫(yī)家治療外陰陰道念珠菌病時所廣為采用，但龍膽瀉肝湯治療VVC的作用機制尚不明確。

研究表明，VVC的致病機制與白念珠菌的侵襲力密切相關(guān)[89]。除菌絲及侵襲素（如ssa1，als3）外，分泌型天冬氨酶（Sap）、磷脂酶（PL）和脂肪酶（Lip）等水解酶是促進白念珠菌侵襲宿主的重要毒力因子。其中天冬氨酸酶（Sap）的有關(guān)研究最為多見，Sap家族由10個基因（SAP1～SAP10）編碼，具有較強的蛋白水解活性，能水解多種宿主蛋白，如角蛋白、膠原蛋白和波形蛋白等細胞外基質(zhì)蛋白以及細胞間黏連蛋白等，從而破壞宿主的防御機制，有助于白念珠菌對宿主組織的侵襲[1011]。Pericolini E等[12]發(fā)現(xiàn)，將Sap注射進小鼠陰道內(nèi)，引起的炎癥反應與菌體感染效果一樣，且使用抗Sap抗體與蛋白酶抑制劑Pepstatin A治療，能明顯抑制Sap所引起的炎癥反應，證明Sap在VVC中的重要性。除Sap外，磷脂酶（PL）通過影響宿主細胞脂類代謝而發(fā)揮重要作用，根據(jù)水解磷脂鍵的不同，PL可分為PLA，PLB，PLC，PLD 4型，其中PLB水解細胞膜中的磷脂，從而引起宿主細胞膜的通透性增高，白念珠菌透過受損的細胞膜侵入宿主細胞[1314]。此外，脂肪酶（Lip）催化甘油三酯的水解和合成，是白念珠菌另一個重要的毒力因子[1516]。

鑒于現(xiàn)有的抗真菌藥物均以真菌的結(jié)構(gòu)（如細胞壁、細胞膜等）為靶標而未見有以毒力因子外分泌酶為靶標的抗菌機制，故本實驗未采取陽性藥對照。實驗通過特異性培養(yǎng)基篩選出同時滿足Sap，PL，Lip活力均很強的陽性菌株CA09。其中Sap的活性檢測采用牛奶培養(yǎng)基法，以脫脂奶粉作為唯一氮源，白念珠菌分泌的Sap對其水解的效果可直接通過培養(yǎng)基中的沉淀圈觀測。白念珠菌分泌的PL可以將培養(yǎng)基中的蛋黃分解為脂肪酸，培養(yǎng)基中添加的鈣成分能與之結(jié)合，在菌落周圍形成肉眼可見的白色沉淀圈，沉淀圈的大小與酶的活力成正相關(guān)。

龍膽瀉肝湯氯仿提取物（CELX）對所選菌株3類水解酶的實驗結(jié)果顯示，當CELX為256 mg·L-1時，Sap活力明顯減弱，PL，Lip活力也被顯著抑制，推測CELX能降低外分泌酶的活性而抑制白念珠菌對宿主組織的侵襲力。此外，還進一步通過實時熒光定量PCR法檢測了CELX對Sap，PL，Lip相關(guān)基因表達的影響。

本實驗中，當CELX為128 mg·L-1時，SAP1，SAP3，SAP4，SAP7基因出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，且均具有顯著性差異；當CELX為256 mg·L-1時，SAP4下調(diào)最顯著，達到84%。在編碼PL的2個基因PLB1，PLB2中，CELX對PLB1的作用比對PLB2的作用更明顯。128 mg·L-1的CELX使PLB1下調(diào)了55%，256 mg·L-1時PLB1下調(diào)了67%。對于LIP，除基因LIP5下調(diào)差異無統(tǒng)計學意義外，LIP3，LIP4，LIP6在256 mg·L-1CELX作用下均呈現(xiàn)明顯下調(diào)，分別下調(diào)了51%，54%，55%。綜上，CELX對水解酶Sap，PL，Lip活力的抑制可能與其對該3種酶在基因水平上的下調(diào)相關(guān)。

目前，常規(guī)的抗真菌藥物作用的靶點均在菌體結(jié)構(gòu)性組成本身，如棘白菌素類作用于細胞壁，唑類或兩性霉素B作用于細胞膜，5氟胞嘧啶作用于核酸等。這些藥物長期作用下，由于選擇壓力，菌株易產(chǎn)生耐藥性，且抗真菌藥物的毒副作用均較大。選擇對菌體本身影響不大而以其產(chǎn)生的毒力因子（如本文中白念珠菌的3種外分泌酶Sap，PL，Lip）為靶標的藥物已成為近年來抗菌藥物研發(fā)的新策略，因不直接針對病原體，故一般不會引起耐藥突變株的產(chǎn)生，也不會導致菌群失調(diào)[1718]。由于本研究中的供試藥為中藥復方，其作用的有效成分或詳細作用機制尚有待于進一步研究。

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[責任編輯張寧寧]endprint