飛揚(yáng)腸胃炎膠囊體外抑菌作用研究

李瑤　楊倩　周丹

[摘要] 目的 探討飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的體外抑菌效果。 方法 采用試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法，以頭孢曲松鈉為陽(yáng)性對(duì)照藥，測(cè)定飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌、白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。 結(jié)果 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)大腸埃希菌（MIC為6.25 mg/mL）、金黃色葡萄球菌（MIC為1.56 mg/mL）、糞腸球菌（MIC為25.00 mg/mL）、銅綠假單胞菌（MIC為6.25 mg/mL）、β-溶血性鏈球菌（MIC為12.50 mg/mL）的體外抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)白色念珠菌（MIC為100.00 mg/mL）的體外抑菌作用較弱。 結(jié)論 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌具有較強(qiáng)的體外抑菌作用。

[關(guān)鍵詞] 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊；試管二倍稀釋法；最小抑菌濃度；抑菌作用

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（a）-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the antimicrobial activity in vitro of Feiyang Changweiyan Capsules. Methods The tube double dilution method and agar plate method were used to determine the minimum inhibitory concentrations （MIC） and minimum bactericidal concentrations （MBC） of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa， β-hemolytic streptococcus and Candida albicans， taking Ceftriaxone as positive control drug. Results The antibacterial activity of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil （MIC was 6.25 mg/mL）， Staphylococcus aureus （MIC was 1.56 mg/mL）， Enterococcus faecalis （MIC was 25.00 mg/mL）， Pseudomonas aeruginosa （MIC was 6.25 mg/mL） and β-hemolytic streptococcus （MIC was 12.50 mg/mL） was stronger， which of Candida albicans （MIC was 100.00 mg/mL） was weaker. Conclusion Feiyang Changweiyan Capsules have stronger antimicrobial activity in vitro for Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa and β-hemolytic streptococcus.

[Key words] Feiyang Changweiyan Capsules； Tube double dilution method； Minimum inhibitory concentrations； Antimicrobial activity

飛揚(yáng)腸胃炎膠囊由飛揚(yáng)草、火炭母、救必應(yīng)三味中藥組成，具有瀉火解毒、除濕止痢的功效，臨床上用于細(xì)菌性痢疾和急、慢性腸胃炎的治療，療效顯著，副作用小[1]。飛揚(yáng)草為大戟科大戟屬植物飛揚(yáng)草（Euphorbia hirta L.）的干燥全草，主要分布于我國(guó)南方、日本、印度和亞熱帶地區(qū)[2]。據(jù)報(bào)道，飛揚(yáng)草在印度常用于女性疾病和兒童寄生蟲(chóng)感染的治療，此外，對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病、鼻炎、支氣管炎等有良好的作用[3]?，F(xiàn)代研究表明[4-6]，飛揚(yáng)草乙醇提取物對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用，正己烷提取物對(duì)小鼠醋酸丙酯引起的炎癥有治療作用?；鹛磕甘寝た浦参锘鹛磕福≒olygonum chinense L.）的藥用全草，臨床上主要用于濕熱泄瀉、痢疾、濕熱瘡疹、霉菌性陰道炎等疾病的治療[7-8]，火炭母的莖和葉提取物對(duì)細(xì)菌有抑制作用[9]。救必應(yīng)為冬青科植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥樹(shù)皮，常用于乳娥、腹瀉、痢疾的治療[10]。研究表明，救必應(yīng)的乙醇提部位和蒸餾水提取部位均有較強(qiáng)的抑菌作用[11]。雖然關(guān)于飛揚(yáng)草、火炭母、救必應(yīng)三個(gè)單味藥的抗菌抗炎作用以及其他藥理研究較多，但對(duì)此三味藥組方而成的飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的抗菌抗炎作用研究較少，所以本研究選取6種常見(jiàn)致病菌，測(cè)定飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的體外抑菌作用，為探討該藥作用機(jī)制及進(jìn)一步擴(kuò)大適應(yīng)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC29212）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、β-溶血性鏈球菌（臨床菌株）、白色念珠菌（ATCC 90028）均由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物檢驗(yàn)科提供。

1.2 藥物

飛揚(yáng)腸胃炎膠囊（陜西君碧莎制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080523）；注射用頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥，批號(hào)：SH6101）。endprint

1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基干粉（英國(guó)OXOID公司，批號(hào)：201603291）；血瓊脂培養(yǎng)基（英國(guó)OXOID公司，批號(hào)20160114B）。

1.4 儀器與設(shè)備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋），Centrifuge 5418R小型冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），BSC-1360ⅡB2生物安全柜（HDL公司），微量加樣器（吉爾森公司），BSA224S賽多利斯分析天平（德國(guó)賽多利斯公司），HF212UV CO2培養(yǎng)箱（上海力康），麥?zhǔn)媳葷醿x（法國(guó)梅里埃）。

1.5 供試品藥液的配制

稱取10 g飛揚(yáng)腸胃炎膠囊內(nèi)容物，加適量蒸餾水（16倍）回流提取90 min，抽慮，濾液蒸干得樣品1。稱取10 g飛揚(yáng)腸胃炎膠囊內(nèi)容物，加適量75%乙醇（16倍）回流提取90 min，抽慮，濾液蒸干得樣品2。

分別稱取3.0 g樣品1和樣品2，加入15 mL無(wú)菌生理鹽水，待完全溶解后，12 000 r/min，r = 7.7 cm，離心10 min，吸取上清液過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，即得濃度為200 mg/mL的樣品1和樣品2原藥液。

精密稱取對(duì)照藥2.56 mg注射用頭孢曲松鈉干粉，加10 mL無(wú)菌生理鹽水溶解，即得濃度為256 mg/L的原藥液。

1.6 菌液的制備

用無(wú)菌接種環(huán)將凍存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌、白色念珠菌以三段劃線法接種于無(wú)菌血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)35℃恒溫培養(yǎng)24 h后，采用麥?zhǔn)媳葷岱?，用生理鹽水校正各菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（即1.5×108 CFU/mL）待用。

1.7 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2007標(biāo)準(zhǔn)，采用試管二倍稀釋法測(cè)定藥物MIC[12-13]。每個(gè)菌種的抑菌實(shí)驗(yàn)取滅菌試管2排，每排11管，每管加入1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別在第1管中加入1 mL樣品1原液和樣品2原液，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，連續(xù)倍比稀釋至第9管，到第9管時(shí)棄去1 mL，此時(shí)各管藥物濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.781 25、0.390 625 mg/mL，此外，在β-溶血性鏈球菌的兩排試管中分別加入無(wú)菌脫纖羊血100 μL。然后每管中分別加入調(diào)整好的各菌株稀釋液10 μL，使每管最終菌液濃度為105 CFU/mL。因真菌比細(xì)菌大，故真菌最終濃度約為104 CFU/mL。第10管為無(wú)菌陰性對(duì)照，第11管為無(wú)藥陽(yáng)性對(duì)照。同樣取12只滅菌試管排成一排，每管加入1 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯，在第1管中加入對(duì)照品原液1 mL混勻，其余操作同上，各管藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L，第11管為無(wú)菌陰性對(duì)照，第12管為無(wú)藥陽(yáng)性對(duì)照。樣品1、樣品2和陽(yáng)性藥物MIC測(cè)定分別重復(fù)3次，以3次數(shù)值相同為最終結(jié)果。

因中藥本身顏色較深以及人的視覺(jué)差異，需采用瓊脂平板法轉(zhuǎn)板來(lái)確定其MBC值，以提高對(duì)藥物抑菌作用判定的準(zhǔn)確性。在判定完藥物對(duì)應(yīng)菌的MIC值后，從MIC值所對(duì)應(yīng)藥物濃度及以上的試管中分別用無(wú)菌接種環(huán)取10 μL培養(yǎng)物，采用平板劃線法將培養(yǎng)物接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察平板上是否有菌落生長(zhǎng)，以不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋濃度為飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)該菌的MBC。

2 結(jié)果

2.1 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊不同溶劑提取物及注射用頭孢曲松鈉對(duì)6種菌的效力

陰性對(duì)照組中無(wú)菌的液體培養(yǎng)基和平板均無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照組試管有菌生長(zhǎng)，出現(xiàn)渾濁，同時(shí)劃平板培養(yǎng)的菌落生長(zhǎng)良好，且本研究所測(cè)得的注射用頭孢曲松鈉值與CLSI的參考值以及文獻(xiàn)報(bào)道注射用頭孢曲松鈉MIC值[14]進(jìn)行對(duì)比，可知，本研究結(jié)果有效。見(jiàn)表1。

2.2 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)6種常見(jiàn)菌的MIC

飛揚(yáng)腸胃炎膠囊水提取物對(duì)大腸埃希菌和β-溶血性鏈球菌的抑菌作用更好，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊醇提取物對(duì)大腸埃希菌和β-溶血性鏈球菌的抑制作用比水提取物稍弱，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊水提物和醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的抑菌效力相當(dāng)。見(jiàn)表2。

2.3 飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)6種常見(jiàn)菌的MBC

飛揚(yáng)腸胃炎膠囊水提物對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌的抑菌作用相當(dāng)，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊醇提物對(duì)大腸埃希菌的殺菌作用稍弱于水提物。對(duì)比飛揚(yáng)腸胃炎膠囊不同提取物的MIC值和MBC值可知，MBC值比MIC值濃度高2～4個(gè)梯度。見(jiàn)表3。

綜合分析以上結(jié)果，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌及糞腸球菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)白色念珠菌的抑菌作用較弱。

3 討論

飛揚(yáng)腸胃炎膠囊由飛揚(yáng)草、火炭母、救必應(yīng)三味中藥組方而成，其中君藥飛揚(yáng)草可清熱解毒利濕，祛除腸道濕熱邪氣，臣藥火炭母可增強(qiáng)飛揚(yáng)草的解毒利濕功效，佐使藥輔助飛揚(yáng)草和火炭母利濕解毒之功，止痛功效可改善腹痛癥狀。

人體作為一個(gè)生命整體，其局部微生態(tài)是人生命環(huán)境的一部分，微生物群之間是有聯(lián)系的，有學(xué)者認(rèn)為人體的腸道和陰道的微生態(tài)平衡存在著相互調(diào)節(jié)的作用[14]。婦科炎癥和腸胃炎的發(fā)生與陰道微生物群和腸道微生物群的紊亂有關(guān)[15-18]，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊又有應(yīng)用于女性疾病治療的歷史，結(jié)合飛揚(yáng)腸胃炎膠囊組方中三味藥物良好的抑菌作用，本研究選擇了引起婦科炎癥的6種常見(jiàn)致病菌，進(jìn)行飛揚(yáng)腸胃炎膠囊的體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)初步確定飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)婦科炎癥常見(jiàn)菌的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌及糞腸球菌抑制作用較強(qiáng)，對(duì)白色念珠菌抑制作用較弱。根據(jù)體外研究結(jié)果，筆者下一步會(huì)繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探討飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)婦科炎癥的治療作用，為擴(kuò)大飛揚(yáng)腸胃炎膠囊適應(yīng)證研究提供理論依據(jù)。endprint

由于中草藥提取液本身顏色較深，且中藥制劑的一大特點(diǎn)是“藥輔合一”，即選擇制劑處方中的某些藥味既作為藥物又作為輔料，減少其他輔料的用量[19]，這就使得中成藥溶解后會(huì)出現(xiàn)顏色較深且渾濁的現(xiàn)象，影響體外抑菌實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的判斷。

本研究對(duì)藥物進(jìn)行前期處理，按照藥物原制備工藝，分別選擇蒸餾水和75%乙醇對(duì)飛揚(yáng)腸胃炎膠囊進(jìn)行重新提取，得到澄清度較高的原藥液，再結(jié)合瓊脂平板法測(cè)定MBC，提高了飛揚(yáng)腸胃炎膠囊體外抑菌效果判斷的準(zhǔn)確性。本研究中采用重新提取除去輔料并結(jié)合平板法能減少中藥顏色對(duì)結(jié)果判斷造成的影響，得出的結(jié)果可靠，因此，此方法可以為以后中藥類制劑的體外抑菌實(shí)驗(yàn)方法提供參考。實(shí)驗(yàn)中選擇注射用頭孢曲松鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥，因?yàn)楝F(xiàn)有國(guó)內(nèi)測(cè)定中藥類MIC值并沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的MIC值參考，也沒(méi)有統(tǒng)一的MIC實(shí)驗(yàn)室測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，選擇注射用頭孢曲松鈉注射液作為陽(yáng)性對(duì)照藥，測(cè)定的MIC值與美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)及文獻(xiàn)報(bào)道注射用頭孢曲松鈉MIC值[20]進(jìn)行對(duì)比，可確定本研究操作方法和條件符合要求，測(cè)出的MIC值有參考價(jià)值。

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（收稿日期：2017-06-04 本文編輯：張瑜杰）endprint