富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生物學(xué)特性影響的研究

張 涵， 張騰騰， 孔 潔， 李艷茹， 張 敏， 李太元

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生物學(xué)特性影響的研究

張 涵， 張騰騰， 孔 潔， 李艷茹， 張 敏， 李太元*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

為初步研究富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生物學(xué)特性影響，選擇乳酸乳球菌、鼠乳桿菌、嗜酸乳桿菌作為受試菌種， 進(jìn)行蛋白粉對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)增殖影響試驗(yàn)、耐溫性試驗(yàn)、酸堿耐受性試驗(yàn)和膽鹽耐受性試驗(yàn)以及對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸的影響試驗(yàn)等。結(jié)果顯示：蛋白粉具有促進(jìn)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌增殖的作用，富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適濃度分別為1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉對(duì)其的最適濃度分別為3、6和9 mg/mL；蛋白粉還一定程度的提高了乳酸菌的酸堿耐受性、耐溫性和耐膽鹽性；還提高了乳酸菌的產(chǎn)酸量。

富硒乳酸蛋白粉；乳酸蛋白粉；乳酸菌；生物學(xué)特性；初步研究

硒元素是人體14大微量元素之一，已被聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)/國(guó)際原子能組織(International Atomic Energy Agency，IAEA)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)共同確認(rèn)為人體必需的一種重要微量元素[1-2]。生物體內(nèi)，硒(Selenium，Se)是谷光甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)的活性中心元素，而GPx具有清除對(duì)機(jī)體有害的自由基，防止細(xì)胞膜氧化受損的作用[3]。同時(shí)GPx能夠激發(fā)人體免疫球蛋白及抗體的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞膜和染色體，以及保護(hù)核糖核酸等大分子生理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而提高機(jī)體的免疫力[4]。我國(guó)3/4地區(qū)屬于缺硒地區(qū)，生物體內(nèi)的硒大都來(lái)源于蔬菜、水果等，但這些天然食品中硒含量普遍偏低，無(wú)法滿足成人對(duì)硒的需求，從而影響人體內(nèi)硒的含量和代謝[5]。因此，有必要在食物中強(qiáng)化硒含量，向人體補(bǔ)充硒元素。由于無(wú)機(jī)硒的毒性很強(qiáng)，吸收率又低，因而添加有機(jī)硒視為最安全最有效的手段。人工合成有機(jī)硒存在技術(shù)難度大，成本高等問(wèn)題，需通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化等方法獲取有機(jī)硒。乳酸菌是目前發(fā)酵食品生產(chǎn)中普遍使用的菌種，具有促使發(fā)酵食品營(yíng)養(yǎng)豐富，及眾多醫(yī)療保健作用，是公認(rèn)的營(yíng)養(yǎng)保健食品[6]。此外，乳酸菌具有一定的富硒能力，可以通過(guò)乳酸菌將硒元素轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，富硒乳酸菌蛋白粉具有有機(jī)硒和益生菌的雙重功效。乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌均屬于有益菌，參與合成各種維生素，抑制致病菌群的生長(zhǎng)，還可以分解有毒有害物質(zhì)等。本試驗(yàn)擬用富含富硒乳酸蛋白粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述3種乳酸菌，并研究富硒乳酸蛋白粉對(duì)這3種乳酸菌的生長(zhǎng)及部分生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步將富硒乳酸蛋白粉應(yīng)用于臨床和實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種來(lái)源

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis, ATCC：1.247 0)，鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus, ATCC：1.262 6)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus, ATCC：1.185 4)，由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2藥品與試劑

富硒乳酸蛋白粉、乳酸蛋白粉由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供；普通肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉等由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3菌種的復(fù)活

于-80 ℃冰箱里取出保存的乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌種，置于37 ℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇[7]。于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，將菌株分別置于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫，厭氧條件下靜置培養(yǎng)48 h。各取200 μL菌液分別接種于MRS固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫厭氧條件靜置培養(yǎng)48 h，置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4菌懸液的制備

于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)分別挑取上述MRS固體培養(yǎng)基上大小適宜的單菌落，接種于MRS肉湯培養(yǎng)中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)厭氧條件培養(yǎng)菌液濃度至TOD600=0.7±0.1[8]，置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉最適作用濃度的確定

將富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉分別添加到肉湯培養(yǎng)基中至終濃度分別為0、0.1%～0.9%和1%，各取1 mL上述培養(yǎng)液置于試管內(nèi)高壓滅菌。而后于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)分別添加制備的3種乳酸菌菌懸液20 μL，于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。采用倍比例稀釋法均勻涂布于MRS培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉的最適作用濃度[9]。

1.6富硒乳酸菌蛋白粉對(duì)乳酸菌耐膽鹽能力的影響

配置含有最適濃度的富硒乳酸蛋白粉(標(biāo)記為F)和對(duì)照組乳酸蛋白粉(標(biāo)記為R)的MRS肉湯培養(yǎng)基，再設(shè)空白對(duì)照組MRS肉湯(標(biāo)記為L(zhǎng))，下同。并且分別添加膽至終濃度分別為0和0.1%～0.5%，高壓滅菌。于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，分別添加乳酸菌菌懸液20 μL，37 ℃，厭氧培養(yǎng)48 h后。采用倍比例稀釋法均勻涂布于MRS培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉對(duì)3種乳酸菌耐膽鹽能力的影響。

1.7富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌耐酸堿能力的影響

配置含有最適濃度的富硒乳酸蛋白粉及膽鹽濃度的培養(yǎng)基，調(diào)整其pH值分別為2、4、6、7、9、10，高壓滅菌。于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，分別添加乳酸菌菌懸液20 μL。37 ℃，厭氧條件培養(yǎng)48 h后，采用倍比例稀釋法均勻涂布于MRS培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌耐酸堿能力的影響。

1.8富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌的溫度耐受性的影響

配置含有最適濃度的富硒乳酸蛋白粉、膽鹽和最適pH值的培養(yǎng)基，高壓滅菌，于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，分別添加乳酸菌菌懸液20 μL。分別置于40、60和80 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)，均分別處理10、20和30 min。37 ℃，厭氧條件培養(yǎng)48 h后，采用倍比例稀釋法均勻涂布于MRS培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌溫度耐受性的影響。

1.9富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)能力的影響

配置以上條件均為最適的MRS培養(yǎng)基，高壓滅菌，于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，分別添加乳酸菌菌懸液0.5 mL。在37 ℃下厭氧培養(yǎng)，每隔3 h取1 mL菌懸液，共培養(yǎng)48 h。采用倍比例稀釋法均勻涂布于MRS培養(yǎng)皿，每個(gè)梯度重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。分析富硒乳酸菌蛋白粉和乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)能力的影響。

1.10富硒乳酸菌蛋白粉對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸的影響

配置以上條件均為最適的MRS培養(yǎng)基，高壓滅菌，于無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，分別添加乳酸菌菌懸液0.5 mL。在37 ℃下厭氧培養(yǎng)，每隔3 h取1 mL菌懸液，共培養(yǎng)48 h。分別測(cè)定pH值，分析富硒乳酸菌蛋白粉和乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1富硒乳酸蛋白粉濃度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明(圖1，a～b)，富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適濃度分別為1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適濃度分別為3、6和9 mg/mL。富硒乳酸蛋白粉在最適濃度下對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。

圖1a 富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌的影響

圖1b 乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌的影響

2.2富硒乳酸菌蛋白粉對(duì)乳酸菌耐膽鹽能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受能力，并且富硒乳酸蛋白粉比乳酸蛋白粉的影響力大；富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了鼠乳桿菌的膽鹽耐受能力，并且乳酸蛋白粉比富硒乳酸蛋白粉的影響力大(圖2)。

圖2 蛋白粉對(duì)乳酸菌耐膽鹽能力的影響

2.3富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌耐酸堿能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的酸堿耐受力，在pH值為6、7時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)情況最為良好(圖3)。

圖3 蛋白粉對(duì)乳酸菌耐酸堿能力的影響

2.4富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌溫度耐受性的影響

試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸蛋白粉增強(qiáng)了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的溫度耐受能力。對(duì)于鼠乳桿菌，乳酸蛋白粉組溫度耐受能力的提高幅度大于富硒乳酸蛋白粉組(圖4)。

圖4 富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌溫度耐受性的影響

2.5富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同時(shí)間段內(nèi)，蛋白粉對(duì)乳酸菌的作用效果不同。富硒乳酸蛋白粉縮短了乳酸乳球菌的適應(yīng)期(從0～12 h到0～6 h)，增加了乳酸乳球菌的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(從12～30 h到6～33 h)；富硒乳酸蛋白粉也縮短了鼠乳桿菌的適應(yīng)期(從0 ～9 h到0～6 h)，增加了鼠乳桿菌的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(從9～33 h到6～36 h)；富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了嗜酸乳桿菌的適應(yīng)期(從0～6 h到0～9 h)，縮短了嗜酸乳桿菌的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期(從6～36 h到9～33 h)(圖5)。

圖5 富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)能力的影響

2.6富硒乳酸菌蛋白粉對(duì)3種乳酸菌產(chǎn)酸的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，pH值逐漸下降。對(duì)于鼠乳桿菌，富硒乳酸蛋白粉組產(chǎn)酸的能力大于乳酸蛋白粉組;對(duì)于乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌，乳酸蛋白粉組產(chǎn)酸能力大于富硒乳酸蛋白粉(圖6～8)。

圖6 蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)酸的影響

圖7 蛋白粉對(duì)鼠乳桿菌產(chǎn)酸的影響

圖8 蛋白粉對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響

3 討論

微生物蛋白作為乳酸菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在乳酸菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中起著重要的作用。Xia等[10]研究結(jié)果表明，保加利亞乳酸桿菌在一定質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉溶液中可以富集大量的硒，并且菌體本身能夠很好的生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)通過(guò)設(shè)置0、0.1%～0.9%和1%等10個(gè)濃度梯度，來(lái)確定富硒乳酸蛋白粉對(duì)3種乳酸菌的影響，并且同時(shí)確定其對(duì)3種乳酸菌的最適作用濃度。結(jié)果表明，富硒乳酸菌蛋白粉對(duì)3種乳酸菌的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適濃度分別為1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適濃度分別為3、6和9 mg/mL。

鞏利昌等[11]報(bào)道，膽鹽隨膽汁排至小腸，導(dǎo)致腸道內(nèi)的膽鹽含量增加，抑制了腸內(nèi)微生物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)設(shè)置在0、0.1%～0.5%的膽鹽濃度下，來(lái)確定蛋白粉對(duì)3種乳酸菌的影響。結(jié)果表明，蛋白粉提高了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的耐膽鹽能力。Smet I D等報(bào)道，膽鹽是以分子的形式通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，然后在細(xì)胞質(zhì)中釋放氫離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸性增強(qiáng)，從而引起細(xì)菌死亡。細(xì)菌可以利用ATP所生成的H+—三磷酸腺苷來(lái)驅(qū)逐細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過(guò)多的H+，從而減輕膽鹽的毒害作用[13]。

田會(huì)芹等[12]報(bào)道，pH值的改變會(huì)引起細(xì)胞膜電荷變化，進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)設(shè)置在pH值分別為2、4、6、7、9、10條件下，來(lái)確定蛋白粉對(duì)3種乳酸菌的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白粉均增加了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的酸堿耐受性。

乳酸菌的最高耐受加熱溫度為35～40 ℃。當(dāng)外界溫度過(guò)高時(shí)，就會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。因此，本試驗(yàn)設(shè)置在40、60和80 ℃條件下，并分別處理10、20和30 min，來(lái)確定蛋白粉對(duì)這3種乳酸菌酸堿耐受性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸蛋白粉增強(qiáng)了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的溫度耐受能力。但對(duì)于鼠乳桿菌，乳酸蛋白粉組溫度耐受能力的提高幅度要大于富硒乳酸蛋白粉組的提高幅度。

根據(jù)Gasson M J等人的研究結(jié)果[13]，乳酸菌的生長(zhǎng)時(shí)間為24～48 h。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)每3 h測(cè)1次含菌量，一直測(cè)到乳酸菌的生長(zhǎng)時(shí)間為48 h，同時(shí)確定蛋白粉對(duì)這3種乳酸菌生長(zhǎng)能力的影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌和鼠乳桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但是對(duì)于嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用。

乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo)是它的產(chǎn)酸功能，酸可使胃內(nèi)蛋白原激活，同時(shí)酸具有強(qiáng)的殺菌作用[14]。因此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)測(cè)乳酸菌的產(chǎn)酸量，每隔3 h測(cè)1次，共培養(yǎng)48 h，同時(shí)確定蛋白粉對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸量的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力。

4 結(jié)論

富硒乳酸蛋白粉對(duì)乳酸乳球菌、鼠乳桿菌和嗜酸乳桿菌均有增菌作用，富硒乳酸蛋白粉對(duì)其最適濃度分別為1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉對(duì)其的最適濃度分別為3、6和9 mg/mL；富硒乳酸蛋白粉還一定程度的提高了乳酸菌的酸堿耐受性、溫度耐受性和膽鹽耐受性；還提高了乳酸菌的產(chǎn)酸量。

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Studyonbiologicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaaffectedbyseleniumenrichedlacticacidprotein

ZHANG Han, ZHANG Tengteng, KONG Jie, LI Yanru， ZHANG Min, LI Taiyuan*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

To study preliminarily the influence of selenium enriched lactic acid protein powder on the biological characteristics of lactic acid bacteria,Lactococcuslactis,LactococcusmurinusandLactobacillusacidophilus, were chosen as test strains. The protein powder growth inhibition test, temperature resistance test, pH tolerance test and bile salt tolerance test and production test were carried out in the study. The results showed that the protein powder could promote the proliferation onL.lactis,L.murinusandL.acidophilus. The optimum concentrations of element Se enriched Lactobacillus protein onL.lactis,L.murinusandL.acidophiluswere 1,3 and 4 mg/mL. The optimal concentrations of lactic acid protein powder were 3 mg/mL、6 mg/mL and 9 mg/mL. The protein powder could improve the lactic acid bacteria pH tolerance, temperature tolerance and bile salt resistance, and improve the acid production of lactic acid bacteria.

selenium enriched lactic acid protein powder; lactic acid protein powder; lactic acid bacteria; biological characteristics; preliminary study

2017-05-20

張涵(1993—)，女，吉林通化人，在讀碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物和免疫學(xué)。李太元為通信作者，

E-mail:tyli@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0062-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.011

R285.5

A