人工飼養(yǎng)條件下棕黑錦蛇腎臟形態(tài)異常的初步研究

程建鑫 姚晨昊 王珊珊 李丕鵬 陸宇燕

(沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動物研究所，遼寧省生物進化與生物多樣性重點實驗室，沈陽，110034)

人工飼養(yǎng)條件下棕黑錦蛇腎臟形態(tài)異常的初步研究

程建鑫 姚晨昊 王珊珊 李丕鵬*陸宇燕*

(沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動物研究所，遼寧省生物進化與生物多樣性重點實驗室，沈陽，110034)

在對人工養(yǎng)殖的棕黑錦蛇體質(zhì)測量的研究中發(fā)現(xiàn)一例蛇腎臟出現(xiàn)形態(tài)異常后，應(yīng)用大體解剖和組織學(xué)方法對其進行深入觀察，并檢測血液指標(biāo)的變化。腎臟異常表現(xiàn)為2個腎臟形狀和大小明顯不同，其中左腎明顯肥大，腎系數(shù)約為正常腎臟的2倍；而右腎則明顯萎縮，腎系數(shù)僅為正常腎臟的1/6。組織活檢表明，左腎實質(zhì)組織結(jié)構(gòu)基本正常，而右腎實質(zhì)變得密集，腎單位之間增生有豐富的纖維性結(jié)締組織。此外，2個腎均出現(xiàn)腎小體萎縮、堿性物質(zhì)沉積等病變。在血液學(xué)檢測中，腎病蛇的紅細(xì)胞和血栓細(xì)胞數(shù)量低于正常蛇，且有顯著性差異。19項血液生化指標(biāo)中有9項與正常蛇有明顯差異。觀察結(jié)果表明左腎的肥大可能是對右腎萎縮的補償，其組織結(jié)構(gòu)的變化也可能是一定程度上的功能反應(yīng)。血液學(xué)指標(biāo)的變化是由于這種形態(tài)異常引起的生理功能變化所致，說明這條蛇處于疾病狀態(tài)。盡管對這種腎臟異常的誘因尚不清楚，但應(yīng)對蛇的飼養(yǎng)管理、食物和營養(yǎng)狀態(tài)予以足夠重視。

棕黑錦蛇；腎臟；形態(tài)異常；疾?。伙曫B(yǎng)管理

棕黑錦蛇(Elapheschrenckii)是中國北方常見的大型蛇種，并具有較高的營養(yǎng)價值，故有著大量的市場需求，近年來野外種群數(shù)量呈急劇下降的趨勢[1-3]。為了保護野外種群，并部分滿足市場需求，本實驗室進行了棕黑錦蛇的人工養(yǎng)殖嘗試。

本實驗室在前期養(yǎng)殖中發(fā)現(xiàn)有一定數(shù)量的死亡現(xiàn)象，為了掌握棕黑錦蛇的一般生長發(fā)育規(guī)律和生理生化特征，對其進行了年周期的觀察及檢測，旨在建立棕黑錦蛇“健康檔案 ”。此項工作的完成不僅可以豐富棕黑錦蛇的相關(guān)生物學(xué)基礎(chǔ)資料，還可以為蛇病的提前診斷，預(yù)防治療奠定理論基礎(chǔ)。

腎臟是動物體內(nèi)重要的排泄器官，具有排泄機體代謝廢物、維持內(nèi)環(huán)境中水、 電解質(zhì)和酸堿平衡的作用[4-7]。對于爬行類而言，陸地環(huán)境對其體內(nèi)水分調(diào)節(jié)能力有著更高的要求，然而當(dāng)前對爬行類腎臟組織學(xué)研究的報道極為少見。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用棕黑錦蛇卵采自牡丹江，于2014年8月孵化出殼，在2015～2016年間，每月選取一定數(shù)量進食、活動正常的棕黑錦蛇進行解剖學(xué)觀察，同時進行血液指標(biāo)的檢測。健康蛇的確定：進食和活動正常，解剖未見明顯的器官病變，以其各項指標(biāo)建立棕黑錦蛇生長發(fā)育和生理生化數(shù)據(jù)庫。并將解剖中發(fā)現(xiàn)的有明顯病變的蛇進行分類，并逐步進行報道。本次報道為2016年5月進行的實驗觀察，其中7條(雌雄兼用)為健康蛇，1條蛇(雌)有腎臟病變，本文稱其為“腎病蛇”。

1.2 方法

將蘸有適量乙醚放入盛有棕黑錦蛇的干燥器中，待其停止活動后取出，固定于解剖板上，經(jīng)泄殖腔上方縱剖其腹部至下頜部。心臟取血，利用BM21B半自動血細(xì)胞分析儀進行血細(xì)胞計數(shù)，利用上海安亭科學(xué)儀器廠(TGL-16G-C)高速臺式冷凍離心機以8 000 r/min進行離心，吸取上清超低溫保存，由沈陽艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心進行相關(guān)指標(biāo)檢測。利用哈爾濱量具廠GB/T14899—94數(shù)顯游標(biāo)卡尺對蛇體和腎臟進行測量，Mettler ToledoQ/OAFA02-2009電子天平進行稱重。取部分腎臟以10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片，厚7 μm，H-E及AB-PAS染色。奧林巴斯BX51-DP71顯微鏡觀察和照相，利用Image-Pro Express 6.0軟件進行測量，實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，相關(guān)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。設(shè)置P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

1.3 相關(guān)計算方法

豐滿度=軀體重(除去內(nèi)臟后的胴體重，g)/體長(mm)；

腎臟相對長度=腎臟長(mm)/體長(mm)；

腎系數(shù)=腎臟重(g)/軀體重(g)。

2 結(jié)果

2.1 大體解剖與生物學(xué)量度

健康棕黑錦蛇腎臟(圖1)顏色為暗紅色，長條狀。腎臟位于脊椎兩側(cè)，一般右側(cè)腎臟略高于左側(cè)，但左、右腎大小相近。腎臟表面可見大小基本一致的小結(jié)節(jié)連續(xù)排列，腎臟內(nèi)側(cè)有伴行的輸尿管。

腎病蛇(圖2)剖開腹腔后，可見左側(cè)腎臟明顯較健康蛇粗壯，顏色與健康蛇腎臟相似，在近腎臟的縱軸附近可見含有大量乳白色沉積物輸尿管。右側(cè)腎臟明顯萎縮，外觀顏色較左腎淺，腎臟不同區(qū)段粗細(xì)不一，小結(jié)節(jié)間聯(lián)系不甚緊密。

由表1中數(shù)據(jù)可知，腎病蛇的體長和軀體重均略大于健康棕黑錦蛇，因此腎病蛇的豐滿度大于正常蛇，前者是后者的117.24%，但無顯著性差異。健康蛇的左、右腎臟4組數(shù)據(jù)中僅在腎的長寬比值上具有極顯著性差異(P<0.01)，而在腎的相對長度、腎重和腎系數(shù)等3個數(shù)值上均呈右腎略大于左腎，但無顯著性差異。腎病蛇僅在腎臟相對長度數(shù)值上表現(xiàn)為左、右腎較為接近，并與健康蛇腎臟的相對長度值的下限接近；腎病蛇的腎臟長寬比值右腎是左腎的715.31%，更是健康蛇左、右腎的808.63%和556.49%；腎病蛇的左腎重量及腎系數(shù)均近乎是右腎的 10倍之多，但其左右腎的總重量僅略大與健康蛇腎臟左、右腎的總重量(健康蛇腎總重量為5.24 g，腎病蛇腎總重量為5.696 g)，而左、右腎的總腎系數(shù)與健康蛇腎臟總腎系數(shù)幾乎一致。

表1 棕黑錦蛇病變腎臟相關(guān)生物學(xué)量度

Tab.1 Biological measure of Elaphe schrenckii’s injured kidney

注：大寫字母表示極顯著差異性(P<0.01)

Note：Majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

2.2 腎臟組織學(xué)及相關(guān)測量

2.2.1 健康蛇腎臟

由圖3可觀察構(gòu)成腎單位的各組成成分在切片中排列有序而緊密。腎小體呈圓形或近圓形(圖4c)，多單獨分布，偶有 2～4 個聚集在一起。腎小球表面細(xì)胞界限清晰，胞核中可見清晰的核仁。腎小囊腔界限清晰，在 AB-PAS 染色中其壁層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，底面可見有薄層桃紅色的基膜。近曲小管管壁由單層立方上皮細(xì)胞圍成(圖3 a)，細(xì)胞排列較緊密，胞質(zhì)嗜酸性較強，胞質(zhì)中可見較多的細(xì)小顆粒樣物質(zhì)，游離面有局部深染；胞核圓形，近細(xì)胞基底面分布，核仁清晰。在 AB-PAS 染色中可見近曲小管細(xì)胞的核上區(qū)有大量藍(lán)色云霧狀物質(zhì)分布。遠(yuǎn)曲小管管壁由柱狀上皮細(xì)胞圍成(圖3 b)，胞質(zhì)嗜酸性，細(xì)胞游離面可見明顯的刷狀緣，胞核圓形，核仁明顯，多分布于細(xì)胞近中部。在 AB-PAS染色中，管壁細(xì)胞有淡染和深染的區(qū)分，細(xì)胞游離緣深染(圖4 d)。在近曲小管和遠(yuǎn)曲小管管壁細(xì)胞的基底面均有少量的呈長梭形的類肌細(xì)胞，其胞核清晰可見。

2.2.2 腎病蛇腎臟

左腎組織學(xué)結(jié)構(gòu)基本正常，大部分區(qū)域腎小體和腎小管排列有序，在邊緣區(qū)可見排列松散現(xiàn)象(圖5～7)。腎小球呈現(xiàn)出明顯的萎縮現(xiàn)象，且在其中出現(xiàn)大小不一的空泡(圖5 e)，為細(xì)胞水樣變性所致；一些腎小球嚴(yán)重萎縮，并在其邊緣有較大的空泡存在，在其明顯擴張的腎小囊腔中有大量嗜堿性沉積物(圖8 f)；一些腎小球雖然無明顯萎縮，但在腎小球和腎小囊內(nèi)出現(xiàn)大量的嗜堿性沉積物(圖9 g)。腎小管基本完整，僅個別有破裂現(xiàn)象及細(xì)胞基底部與基膜脫離(圖10 h)，也有個別腎小管管壁細(xì)胞基膜呈現(xiàn)明顯增厚。在管壁細(xì)胞核周(圖10 i)或核下有明顯的水樣變性(圖10 j)，也有個別管壁細(xì)胞分離的現(xiàn)象(圖11 k)。在腎臟間質(zhì)的小血管中也有大量嗜堿性沉積物的出現(xiàn)，但未見細(xì)胞成分，卻有空泡存在(圖11 l)。

圖1 健康棕黑錦蛇腎臟解剖圖；圖2 腎病棕黑錦蛇腎臟解剖圖；圖3 健康棕黑錦蛇腎臟顯微結(jié)構(gòu)，H.E染色；圖4 健康棕黑錦蛇腎臟顯微結(jié)構(gòu)，AB-PAS染色；圖5～7 腎病棕黑錦蛇左腎臟顯微結(jié)構(gòu)，H.E染色；圖8～11 腎病棕黑錦蛇左腎臟顯微結(jié)構(gòu)，AB-PAS染色；圖12～13 腎病棕黑錦蛇右腎臟顯微結(jié)構(gòu)，H.E染色；圖14～15 腎病棕黑錦蛇腎臟右腎顯微結(jié)構(gòu)，AB-PAS染色；a.健康蛇近曲小管；b.健康蛇遠(yuǎn)曲小管；c.健康蛇腎小體；d.細(xì)胞游離緣深染；e.腎小球萎縮及細(xì)胞水樣變性；f.嗜堿性沉積物；g.嗜堿性沉積物；h.細(xì)胞破裂；i.細(xì)胞核周水樣變性；j.細(xì)胞核下水樣變性；k.管壁細(xì)胞分離；l.血管空泡；m.腎小球細(xì)胞水樣變性；n.細(xì)胞水樣變性；o.膠原纖維和平滑肌包裹的“小葉”；p.嗜堿性沉積物；q.細(xì)胞界限模糊；r.管腔喪失；s.嗜堿性沉積物重重包繞；t.嗜堿性沉積物重重包繞Fig.1 The kidney anatomy of healthy Elaphe schrenckiis；Fig.2 The kidney anatomy of illness Elaphes chrenckiis；Fig.3 The kidney microstructure of healthy Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.4 The kidney microstructure of healthy Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；Fig.5-7 The left kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.8-11 The left kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；Fig.12-13 The right kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，H.E dye；Fig.14-15 The right kidney microstructure of illness Elaphe schrenckiis，AB-PAS dye；a.Proximal convoluted tubule of healthy snake；b.Distal convoluted tubules of healthy snake；c.Renal corpuscle of healthy snake；d.The free edge hyperchromatic cells；e.Glomeruli shrink and cell hydropic degeneration；f.Basophilic deposits；g.Basophilic deposits；h.Cell rupture；i.The nucleus weeks hydropic degeneration；j.The nucleus of hydropic degeneration；k.The wall cell separation；l.Vascular cavity；m.Glomerular cell hydropic degeneration；n.Cell hydropic degeneration；o.Collagenous fiber and smooth muscle parcel orgenization structure；p.Basophilic deposits；q.The cell is blurred；r.Late lumen loss；s.Basophilic deposits circumvolutio；t.Basophilic deposits circumvolutio

右腎組織學(xué)結(jié)構(gòu)在部分區(qū)域仍能辨認(rèn)，但結(jié)構(gòu)界限不甚清晰。腎小球大多數(shù)呈萎縮或者個別膨大，其間也存在大量水樣病變現(xiàn)象(圖12 m，圖13 n)。而腎小管管徑呈明顯縮小，尤其是近曲小管，管壁出現(xiàn)塌陷，破裂和融合現(xiàn)象；管壁細(xì)胞內(nèi)普遍出現(xiàn)水樣病變。在右腎切片中可見大部分區(qū)域均出現(xiàn)了大量由間質(zhì)(膠原纖維和平滑肌)包裹的“小葉”(圖14 o)，其內(nèi)有一定數(shù)量的基膜增厚而形成的“管狀結(jié)構(gòu)”，并可以辨別一系列的變化趨勢(圖15 p-t)：由于基膜增厚將腎小管包裹其中，管腔內(nèi)有嗜堿性物質(zhì)沉積；細(xì)胞界限模糊，管腔喪失；“管狀結(jié)構(gòu)”中胞核排列雜亂，并有逐漸收縮的現(xiàn)象；“管狀結(jié)構(gòu)”外周聚集大量嗜堿性沉積物將其重重包繞。

2.3 腎單位相關(guān)結(jié)構(gòu)測量

由表2可見，腎病蛇腎臟左、右腎的腎小體面積均小于健康蛇腎臟的腎小體面積，分別是健康蛇腎臟的87.37%和59.44%，其中左腎腎小體與健康蛇腎臟之間無顯著性差異，右腎與正常及左腎間均呈極顯著性差異。

腎病蛇左、右腎的腎小球面積均小于健康蛇腎，左腎腎小球面積僅為健康蛇腎臟的59.45%，與之呈顯著性差異；右腎腎小球面積僅為健康蛇腎臟的34.07%、左腎的57.3%，與兩者間均呈極顯著性差異。

腎病蛇左、右腎的腎小囊面積均大于健康蛇腎臟，分別是健康蛇腎小囊的169.93%和132.6%，與健康蛇分別呈極顯著性差異和顯著性差異，腎病蛇的左、右腎腎小囊面積呈顯著性差異。

近曲小管：腎病蛇腎臟左、右腎近曲小管外徑和上皮細(xì)胞高均明顯低于健康蛇，且與其腎近曲小管外徑和近曲小管上皮細(xì)胞高之間分別呈極顯著性差異及顯著性差異；而腎病蛇腎臟的左腎近曲小管外徑和上皮細(xì)胞高數(shù)值均較右腎的大，左、右腎近曲小管管徑呈極顯著性差異，上皮細(xì)胞高呈顯著性差異。

表2 腎單位相關(guān)結(jié)構(gòu)測量

Tab.2 Measurement of structures related with nephron

注：小寫字母表示顯著差異(P<0.05)；大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)

Note：Lowercase indicate significant correlations between data(P<0.05)；majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

遠(yuǎn)曲小管：腎病蛇左右腎的遠(yuǎn)曲小管管外徑和上皮細(xì)胞高度數(shù)值極為接近，均無顯著性差異；而與健康蛇腎臟比較在遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞高度上基本一致，無顯著性差異；腎病蛇腎臟的遠(yuǎn)曲小管管僅為健康蛇腎臟的56.98%左右，兩者之間呈極顯著性差異。

2.4 血細(xì)胞

由表3可見，在6個指標(biāo)中腎病棕黑錦蛇在紅細(xì)胞和血栓細(xì)胞數(shù)量上，明顯低于健康蛇，且2個指標(biāo)與健康蛇之間均呈極顯著性差異。而在白細(xì)胞總數(shù)，淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和中間細(xì)胞數(shù)上兩者數(shù)值均近似。

表3 血細(xì)胞分類計數(shù)

Tab.3 Blood corpuscle classification of counting

注：小寫字母表示顯著差異(P<0.05)；大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)

Note：Lowercase indicate significant correlations between data(P<0.05)；majuscule indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

2.5 血清生化指標(biāo)

由于腎病蛇只有1條蛇，不滿足統(tǒng)計分析的要求。故本實驗設(shè)置相應(yīng)生化指標(biāo)中腎病蛇/健康蛇的比值大于150%或小于50%為問題指標(biāo)(以*標(biāo)記問題指標(biāo))。共檢測的19個血清指標(biāo)(表4)，其中9項為問題指標(biāo)。血清無機鹽離子含量的7個指標(biāo)中(第1組)，雖腎病蛇均低于健康蛇，但僅鈣磷乘積為問題指標(biāo)。與肝臟功能相關(guān)的6個指標(biāo)(第2組)中總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素均表現(xiàn)為腎病蛇低于健康蛇，其中直接膽紅素為問題指標(biāo)，而總膽汁酸、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均為腎病蛇高

表4 棕黑錦蛇部分生化指標(biāo)

Tab.4 The index of part biochemistry in Elaphe schrenckii

于健康蛇，且3項均為問題指標(biāo)。與腎功能相關(guān)(第3組)的肌酐、尿素氮和尿酸等3項指標(biāo)中腎病蛇均低于健康蛇，其中尿酸為問題指標(biāo)，而肌酐含量接近問題指標(biāo)的臨界值。其他3項(第4組)乳酸脫氫酶、α-羥丁酸脫氫酶和堿性磷酸酶均為問題指標(biāo)。

3 討論

由于爬行類出現(xiàn)了羊膜卵，使其真正實現(xiàn)了陸棲生活，并以不同的方式適應(yīng)著各類生境。而作為調(diào)節(jié)體內(nèi)水分代謝的重要器官腎臟在其生存和繁殖中具有重要作用和意義[8-15]。蛇類腎臟疾病也有不少報道[16-18]，但未見有關(guān)腎萎縮的研究報道。在醫(yī)學(xué)研究中，利用生化指標(biāo)的檢測以及CT成像技術(shù)可以對腎萎縮進行良好的診斷[19]。而對一般動物腎萎縮僅見對貓腎萎縮的診療，且診療手段僅為觸診，檢驗指標(biāo)顯示血液尿素氮和血清肌酐水平升高，紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積正常或減少，血磷不同程度升高，總蛋白和血鉀呈不同程度減少[20-22]。

本研究中的腎病棕黑錦蛇表現(xiàn)出了明顯的代償性，即右腎嚴(yán)重萎縮，而左腎明顯肥大。雖然左腎大部分區(qū)域腎臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單位—腎單位結(jié)構(gòu)正常，但已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的結(jié)構(gòu)損傷的跡象，包括腎小球的萎縮、腎小管管徑的降低、細(xì)胞內(nèi)的水樣變性和腎小體中大量的嗜堿性物質(zhì)的沉積，均反映了腎單位結(jié)構(gòu)和功能有所損傷的趨勢。是否提示了在爬行動物一側(cè)腎臟的代償能力有限，需要雙側(cè)腎臟功能的健全，而解決這個問題還需要更多的積累資料。

對血細(xì)胞分類計數(shù)的結(jié)果與陳東溟等研究結(jié)果相同[23]，均表現(xiàn)為紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少，但棕黑錦蛇的血栓細(xì)胞(相當(dāng)于血小板)也明顯降低。另外，一般哺乳動物罹患腎萎縮的病例均顯示腎功能指標(biāo)中的肌酐、尿素氮和尿酸呈增高的現(xiàn)象，而棕黑錦蛇卻表現(xiàn)出降低的趨勢，這個現(xiàn)象是否與兩種動物代謝終產(chǎn)物不同所致的差異，有待于進一步研究。

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Morphological Abnormality of Kidney in Artificial Breeding Amur Rat Snake(Elapheschrenckii)

Cheng Jianxin Yao Chenhao Wang Shanshan Li Pipeng*Lu Yuyan*

(Institute of Herpetology and Key Lab.Of Biodiversity and Evolution of Liaoning Province，Shenyang Normal University，Shenyang，110034，China)

During the physiometry of captive bred Amur rat snake(Elapheschrenckii)，we found a case of morphological abnormality in the kidney.Further examination was conducted by gross anatomical and histological methods and analyzed with hematological and blood biochemistry data.The kidneys of this snake were obviously different in shape and size.Compared to the normal kidney，the left kidney was much enlarged and the renal coefficient was nearly 2 times that of the normal kidney，the right one was atrophic and the renal coefficient was only 1/6 of the normal kidney.By histological examination，the general structure of the left renal parenchyma was normal and that of the right renal parenchyma was dense and nephron filled with fibroid connective tissue． The renal corpuscles were atrophic and deposited with alkaline substance in the right and left kidneys． Comparing to the normal snakes，the number of red blood cells and thrombocytes were lower and 9 of 19 blood biochemical indices differed significantly from those of normal snakes． The results indicated that the left kidney hypertrophy was compensation of the right kidney atrophy and its histological changes were a limited functional response． This kidney abnormality caused the hematological changes and the snake was in disease status． Although the cause of such appearance was not determined，more attention should be paid to husbandry practices，diet and nutrition．

Elapheschrenckii；Kidney；Morphological abnormality；Disease；Husbandry

稿件運行過程

2017-01-08

修回日期：2017-03-15

發(fā)表日期：2017-08-10

Q955

A

2310-1490(2017)03-473-07

國家林業(yè)局珍稀瀕危物種野外救護與人工繁育項目(No.2130211)

程建鑫，男，25歲，碩士研究生；主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。E-mail：15940239445@163.com

*通訊作者：李丕鵬：E-mail：lipipeng@yahoo.com；陸宇燕：E-mail：luyuyan1962@163.com