高效產(chǎn)錳氧化酶鞘細菌的分離鑒定及酶學特性

鄧加聰，王詩瑤，蔣素素，鄭 虹*

（福建師范大學 福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清 350300）

高效產(chǎn)錳氧化酶鞘細菌的分離鑒定及酶學特性

鄧加聰，王詩瑤，蔣素素，鄭 虹*

（福建師范大學 福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清 350300）

從活性污泥中分離篩選錳氧化酶鞘細菌及研究酶學特性，利用尿素富集培養(yǎng)基、CGY平板及搖瓶復篩從水樣中分離產(chǎn)錳氧化酶菌株，通過菌落形態(tài)觀察、生理生化實驗和16S rRNA基因序列對菌株進行鑒定，并對其發(fā)酵條件及所產(chǎn)錳氧化酶的酶學性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，分離篩選到一株高產(chǎn)錳氧化酶的菌株FM-3，被鑒定為鞘細菌屬纖發(fā)菌（Leptothrix）。該菌株的最適產(chǎn)酶條件為甘油添加量0.8%，蛋白胨添加量0.15 g/L，吐溫-80添加量0.2%，30℃150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，此時發(fā)酵液的錳氧化酶活性可達2 977.44 IU/mL。該菌株產(chǎn)錳氧化酶的最適溫度和pH分別為40℃和7.0，添加一定量的Mg2+對錳氧化酶活性有增強作用，Ca2+、Cu2+對錳氧化酶影響不大，Pb2+、Zn2+、Ag+對錳氧化酶具有一定的抑制作用。

纖發(fā)菌；錳氧化酶；分離篩選；鑒定；酶學特性

錳是地球上廣泛分布的元素之一，是僅次于鐵的第二大過渡元素，我國很多地區(qū)的地下水中錳含量超過飲用水（0.1 mg/L）的標準[1]，長期飲用錳超標的水，會給人體帶來極大的危害[2]。因此對錳污染的水資源進行除錳處理時必須的。目前最常用的錳治理方法是生物除錳法，是利用錳氧化菌將水中二價錳離子氧化成不溶性的高價錳化合物，通過過濾達到除錳的目的[3-6]。

自然界中常見的錳氧化菌主要有鏈霉菌屬（Streptomyces）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、假單胞菌屬（Pesudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）[7-9]等。國內(nèi)外對錳氧化菌的研究主要集中在錳氧化菌的分離篩選、水中錳離子去除的條件及應用、錳氧化機理的研究等[10-11]。RAJASABAPATHY R等[12]從亞速爾群島海水淺水域、熱泉噴口表面分離除了一株非運動性、需氧型的、呈桿或狹窄檸檬型的革蘭氏陰性菌株VSW210T，該菌在溫度30℃、pH 7、NaCl 2%～6%的條件下生長良好?；?6S rRNA基因序列以及鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，菌株VSW210T鑒定為Citreicella marina。晏平等[13]從某水廠的生物除錳濾池中分離出1株新的高效錳氧化菌，命名為H1，通過生理生化試驗及16S rDNA序列對比分析鑒定為氨基桿菌（Aminobactersp.），Aminobactersp.H1的錳耐受濃度高達50 mmol/L，可完全去除濃度低于10 mmol/L的Mn（Ⅱ），菌株H1對Mn（Ⅱ）的氧化主要是通過產(chǎn)生錳氧化活性因子和堿性代謝產(chǎn)物提高pH兩個因素共同作用的結(jié)果。

本實驗旨在研究錳氧化酶產(chǎn)生菌的分離篩選、產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學特性研究，為后續(xù)錳污染的治理及錳氧化酶的分離研究提供奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

水樣：福州祥坂污水處理廠的活性污泥混合液。

1.1.2 主要試劑

生工SK8255柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖、DNAMarker、正向引物16S-F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′、反向引物16S-R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′：生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）尿素富集培養(yǎng)基：尿素0.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，K2HPO40.1 g/L，pH 7.0。

（2）CGY斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，甘油10.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

（3）Stoke平板培養(yǎng)基：葡萄糖1.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，MgSO4·H2O 0.2 g/L，CaCl20.05 g/L，F(xiàn)eCl30.01 g/L，pH 7.0。

（4）鐵錳細菌選擇性培養(yǎng)基（基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基）：蛋白胨0.25g/L，酵母膏0.25g/L，葡萄糖0.25g/L，檸檬酸鐵銨10g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，CaCl20.2 g/L，NaNO30.5 g/L，NH4NO30.5 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

BS97MyCycler聚合酶鏈反應（polymerase chain reac tion，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；FA2204B型電子分析天平：上海越平科學儀器有限公司；LDZX-40B1型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-M型臺式冷凍離心機：上海湘儀離心機有限公司；SPX-15OB-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-25大容量恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；7200型分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的富集培養(yǎng)及分離篩選

取1 mL水樣接種于尿素培養(yǎng)基，混勻，30℃靜置培養(yǎng)，定期挑取培養(yǎng)液表面的絮狀物移入新鮮尿素培養(yǎng)基中，反復富集3次，取富集液劃線于Stoke平板培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于CGY試管斜面。

1.3.2 錳氧化細菌的復篩

將上述篩選到的菌株，接種于CGY試管斜面，30℃活化24 h，用無菌水制成濃度為107個/mL的菌懸液，按2%接種量接入鐵錳細菌選擇性培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶的活性。

1.3.3 錳氧化細菌的菌落菌體形態(tài)及生理生化鑒定

將試管保存的菌株劃線接種于平板培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)2 d。根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[15]對菌株進行菌落細胞形態(tài)及生理生化鑒定。

1.3.4 錳氧化細菌16S rRNA基因序列的遺傳分析

錳氧化細菌基因組的提?。喊凑赵噭┖姓f明書提取菌株基因組DNA。16S rRNA基因的擴增與分析：采用細菌通用引物進行擴增，PCR反應條件為：98℃、3 min；98℃、25 s，55℃、25s，72℃、1min，循環(huán)30次；延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。16S rRNA基因測序委托上海生工公司完成。測序序列與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站GenBank中的已知序列進行Blast。采用MAGE 4.0軟件中Bootstrap Test of Phylogeny的鄰接（neighbor-joining，N-J）法BootStrap的設(shè)定值為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行系統(tǒng)發(fā)育的分析[16-17]。

1.3.5 菌株產(chǎn)錳氧化酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）不同碳源對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于添加有不同碳源（檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖、酵母膏、可溶性淀粉、甘油）的發(fā)酵培養(yǎng)基，每種碳源的添加量為0.5 g/L，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（2）甘油添加量對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于添加有不同量甘油（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（3）不同氮源對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于添加有不同氮源（硝酸鈉、蛋白胨、尿素、硝酸銨、硫酸銨、氯化銨）的發(fā)酵培養(yǎng)基，各種氮源的添加量為0.25 g/L，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（4）蛋白胨添加量對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于添加有不同量蛋白胨（0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（5）培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）取樣測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（6）吐溫-80添加量對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響

按3%接種量將種子液接種于不同吐溫-80添加量（0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L）的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶活力。

（7）菌株產(chǎn)錳氧化酶的正交設(shè)計試驗

為了進一步研究甘油、蛋白胨、吐溫-80、培養(yǎng)時間對菌株發(fā)酵產(chǎn)錳氧化酶能力的影響，以甘油、蛋白胨、吐溫-80、培養(yǎng)時間這4個因素進行正交試驗，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇L9（34）進行試驗設(shè)計。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

1.3.6 菌株產(chǎn)錳氧化酶活力的測定

吸取粗酶液5 mL，加入質(zhì)量濃度為400 mg/L的硫酸錳母液5mL，30℃靜置反應30min，按甲醛肟分光光度法測定（測定吸光度值前離心去除沉淀物[18-21]。

錳氧化酶酶活力單位定義為每分鐘單位體積酶液氧化1 μmol二價錳離子所相當?shù)拿噶浚↖U/mL）。

發(fā)酵液8 000 r/min、4℃離心5 min，收集上清液，備用。

錳氧化酶的酶學性質(zhì)：取10mL上清液分別在不同溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃），不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）的緩沖體系，以及不同金屬離子溶液（Pb（NO3）2、MnCl2、CuCl2、MgCl2、AgNO3、ZnCl2）中保持30min使金屬離子終濃度達到5 mmol/L，測定處理液的錳氧化酶活性，考察溫度、pH及金屬離子對錳氧化酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳氧化細菌的富集與分離篩選

通過尿素培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、Stoke平板培養(yǎng)基稀釋涂布及劃線分離，從水樣中分離出8株鞘細菌，編號為FM-1、FM-2、FM-3、FM-4、FM-5、FM-6、FM-7、FM-8。

圖1 不同菌株錳氧化酶活性的比較Fig.1 Comparison of manganese oxidase activities of different strains

將篩選到的8株錳氧化細菌接種于鐵錳細菌選擇性培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，測定發(fā)酵液的錳氧化酶活性，結(jié)果見圖1。由圖1可知，不同菌株產(chǎn)錳氧化酶的活力有一定的差別，菌株FM-3＞FM-1＞FM-8＞FM-6＞FM-5＞FM-4＞FM-2＞FM-7，這8株菌的錳氧化酶活性均＞1 500 IU/mL，其中菌株FM-3的錳氧化酶活性達到2 341.035 IU/mL。因此，確定以菌株FM-3進行進一步試驗。

2.2 菌株FM-3的形態(tài)特征和生理生化特征

2.2.1 菌株FM-3的菌落、菌體形態(tài)

圖2 菌株FM-3的菌落(A)與菌體(B)形態(tài)Fig.2 Colony(A)and cell(B)morphology of strain FM-3

由圖2A可知，菌株FM-3的菌落呈白色，直徑約1.5mm，邊緣不規(guī)則伴有卷曲的絲狀伸出，扁平，中央較厚。由圖2B可知，菌株FM-3的菌體呈典型的絲狀體結(jié)構(gòu)，許多細胞共同生長在一個管狀鞘內(nèi)，且呈絲狀排列，單個細胞為桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色結(jié)果為陰性。

2.2.2 菌株FM-3的部分生理生化試驗

將4℃冰箱保存菌株FM-3接種于CGY培養(yǎng)基，30℃活化2 d，新鮮菌株進行各項生理生化試驗，結(jié)果見表2。

表2 菌株FM-3的生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of strain FM-3

由表2可知，菌株FM-3為葡萄糖發(fā)酵型，能分解糖、醇類產(chǎn)生有機酸不產(chǎn)氣；能產(chǎn)硫化氫、過氧化氫酶及硝酸鹽還原酶；能利用檸檬酸鹽、酒石酸鹽和丙二酸鹽；具有水解淀粉及微弱的明膠液化能力；M-R反應為陽性，V-P測定和吲哚反應呈陰性。

綜合菌株FM-3的菌株形態(tài)及生理生化試驗結(jié)果，菌株FM-3能水解明膠，能產(chǎn)生過氧化氫酶、硝酸鹽還原酶等，菌株多個細胞在同一管鞘內(nèi)生長，與文獻已報道的纖發(fā)菌的形態(tài)基本一致[14，22]，因此初步鑒定該菌株為鞘細菌屬的纖發(fā)菌（Leptothrix）。

2.3 菌株FM-3的16S rRNA基因序列分析

菌株FM-3的16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得其序列大小約為1454bp。與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，隨機選取同源性相近的菌株序列，構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 菌株FM-3基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain FM-3

由圖3可知，菌株FM-3與纖發(fā)菌屬（Leptothrix）聚為一類，且與登錄號NR026333.1、FM886893.1等菌株16S rRNA序列的同源性達到99%。因此，在細菌系統(tǒng)發(fā)育分類學上，將該菌株鑒定為纖發(fā)菌，命名為纖發(fā)菌（Leptothrix）FM-3。

2.4 菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶發(fā)酵條件的單因素試驗

2.4.1 不同碳源對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以不同的碳源（添加量為0.5g/L）替代酵母膏、葡萄糖，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶的酶活，結(jié)果見圖4。

圖4 碳源對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.4 Effect of carbon sources on the manganese oxidase produced by strain FM-3

由圖4可知，菌株FM-3對不同的碳源利用程度不同，其利用情況如下：甘油＞酵母膏（CK）＞蔗糖＞檸檬酸鈉＞可溶性淀粉＞葡萄糖。結(jié)果表明，甘油為該菌的最適碳源，蔗糖及檸檬酸鈉次之，以葡萄糖和可溶性淀粉為碳源時，菌株FM-3基本不產(chǎn)酶；當以甘油為最適碳源時，該菌株錳氧化酶的活力可達2 715.56 IU/mL。綜上所述，菌株FM-3的最適產(chǎn)酶碳源為甘油。

2.4.2 甘油添加量對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中添加不同含量的甘油，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定不同甘油添加量對菌株FM-3產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 甘油添加量對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.5 Effect of glycerin addition on the manganese oxidase produced by strain FM-3

由圖5可知，不同的甘油添加量對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響差異明顯，菌株產(chǎn)錳氧化酶的活力隨著甘油添加量的增加呈先增后降的趨勢；當甘油添加量＜0.8 g/L時，隨著甘油添加量的增加，產(chǎn)酶量也隨之增高；當甘油添加量為0.8 g/L時，發(fā)酵液中錳氧化酶的產(chǎn)量最高，其酶活力可達2 069.741 IU/mL；當甘油添加量＞0.8 g/L時，產(chǎn)酶量有所減少，說明過低或過高的甘油添加量使碳源濃度過小或過大，都不利于菌株的利用和錳氧化酶的產(chǎn)生。因此，菌株最適產(chǎn)酶的甘油添加量為0.8 g/L。

2.4.3 不同氮源對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

圖6 氮源對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources on the manganese oxidase produced by strain FM-3

在添加有甘油的基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以不同的氮源替代蛋白胨，添加量為0.25 g/L，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶的酶活，結(jié)果（圖6）可知，菌株FM-3對不同氮源的利用率有一定的差別，菌株FM-3對有機氮的利用高于無機氮的利用，菌株FM-3對氮源的利用情況如下：蛋白胨＞硝酸鈉＞硫酸銨＞氯化銨＞尿素＞硝酸銨；當?shù)礊榈鞍纂藭r，其產(chǎn)酶量最高，其錳氧化酶活力可達3 012.98 IU/mL。故以蛋白胨為最適氮源。

2.4.4 蛋白胨添加量對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入不同量的蛋白胨，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測定發(fā)酵液中錳氧化酶的酶活，結(jié)果見圖7。

圖7 蛋白胨添加量對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.7 Effect of peptone addition on the manganese oxidase produced by strain FM-3

由圖7可知，菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的活力隨著蛋白胨添加量的增加呈先增后降低的趨勢，當?shù)鞍纂颂砑恿繛?.15 g/L時，錳濃度最低即產(chǎn)酶量最高，當?shù)鞍纂颂砑恿浚?.15 g/L時，隨著氮源添加量的增加，產(chǎn)酶量也隨之增高；當?shù)鞍纂颂砑恿浚?.15 g/L時，產(chǎn)酶量有所減少。因此，菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的最適蛋白胨添加量為0.15 g/L。

2.4.5 不同培養(yǎng)時間對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)一定時間，每隔12h取樣測定發(fā)酵液中錳氧化酶酶活，結(jié)果見圖8。

圖8 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.8 Effect of culture time on the manganese oxidase

由圖8可知，菌株FM-3錳氧化酶的產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間的增長呈先增后降的趨勢，當發(fā)酵培養(yǎng)時間為12～60 h時，錳氧化酶活力隨時間的增長而提高；當發(fā)酵培養(yǎng)時間為60 h時，錳氧化酶活力最高，其錳氧化酶活力可達3451.68IU/mL；當發(fā)酵培養(yǎng)時間＞60 h之后，隨著培養(yǎng)時間的延長，錳氧化酶活力反而下降[11-13]。因此，菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的最適發(fā)酵時間為60 h。

2.4.6 吐溫-80添加量對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響

在最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入一定量的吐溫-80，3%接種量接入種子液，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，取樣測定酶活力，結(jié)果見圖9。

圖9 吐溫-80添加量對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.9 Effect of Tween-80 addition on the manganese oxidase

有文獻報道[23]，添加一定濃度的吐溫-80可以促進菌株合成錳氧化酶。由圖9可知，菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的產(chǎn)量隨著誘導物吐溫-80的增加呈先增后降的趨勢；當吐溫-80的添加量為0.1～0.3g/L時，錳氧化酶活力隨吐溫-80的添加量增大而提高；當吐溫-80的添加量為0.3 g/L時，菌株錳氧化酶的活力達到最大值，為4 179.58 IU/mL；當吐溫-80的添加量＞0.3 g/L之后，錳氧化酶活力隨之下降。BAR-LEVS S等[24]研究表明吐溫-80能提高細胞膜的滲透性，解除已合成的錳氧化酶在細胞內(nèi)對酶基因的轉(zhuǎn)錄或mRNA翻譯的阻礙，有利于酶的分泌。因此，最適的吐溫-80添加量為0.3 g/L。

2.5 菌株FM-3產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇4因素3水平對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表3。

由表3可知，各因素對菌株產(chǎn)錳氧化酶的影響主次為：C＞B＞A＞D，即吐溫-80添加量＞蛋白胨添加量＞甘油添加量＞培養(yǎng)時間。得到最佳的發(fā)酵工藝為A2B1C2D3，即甘油添加量為0.8 g/L，蛋白胨添加量為0.15 g/L，吐溫-80添加量為0.2 g/L，3℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。此最佳發(fā)酵條件下，錳氧化酶活性可達2 977.44 IU/mL。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization

2.6 菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的酶學特性研究

2.6.1 溫度對錳氧化酶活力的影響

圖10 溫度對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.10 Effect of temperature on manganese oxidase produced by strain FM-3

由圖10可知，菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的酶活隨著溫度的升高呈先增后降的趨勢，溫度對錳氧化酶活性影響不大，在試驗溫度（25～55℃）條件下保溫30 min，錳氧化酶的活性仍保持在1 950.00 IU/mL以上，其最適溫度為40℃，當錳氧化酶在溫度40℃條件下保溫30 min后，其錳氧化酶活性可達2 710.08 IU/mL。

2.6.2 pH對錳氧化酶活力的影響

由圖11可知，菌株FM-3的錳氧化酶活性隨pH的升高呈先升后降的趨勢，錳氧化酶的穩(wěn)定pH范圍為6.5～8.0，最適pH值為7.0，錳氧化酶在pH 7.0條件下放置30 min后，其錳氧化酶活性可達2 514.80 IU/mL。

圖11 pH對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.11 Effect of pH on manganese oxidase produced by strain FM-3

2.6.3 金屬離子對錳氧化酶活力的影響

圖12 金屬離子對菌株FM-3產(chǎn)錳氧化酶的影響Fig.12 Effect of metal ions on manganese oxidase produced by strain FM-3

由圖12可知，不同金屬離子對菌株產(chǎn)錳氧化酶的活性影響各不相同，與未加金屬離子的上清液（CK）相比，添加一定量的Mg2+對錳氧化酶活性有增強作用，Ca2+、Cu2+對錳氧化酶影響不大，Pb2+、Zn2+、Ag+對錳氧化酶具有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

通過富集、平板稀釋及搖瓶復篩從污水中篩選到一株具有較高錳氧化酶活性的菌株FM-3，對菌株進行了形態(tài)觀察及16S rRNA序列遺傳分析，將該菌株鑒定為鞘細菌屬的纖發(fā)菌，命名為纖發(fā)菌（Leptothrix）FM-3；該菌株的最適產(chǎn)酶條件為甘油添加量0.8 g/L，蛋白胨添加量為0.15 g/L，吐溫-80添加量為0.2 g/L，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，此時發(fā)酵液的錳氧化酶活性可達2 977.44 IU/mL。對菌株所產(chǎn)錳氧化酶酶學活性進行研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適溫度和pH分別為40℃和7.0，添加一定量的Mg2+對錳氧化酶活性有增強作用，Ca2+、Cu2+對錳氧化酶影響不大，Pb2+、Zn2+、Ag+對錳氧化酶具有一定的抑制作用。對菌株FM-3的鑒定及研究菌株錳氧化酶的活性研究，對菌株今后在治理污水和給排水工程中的應用奠定了一定的基礎(chǔ)，而對菌株產(chǎn)錳氧化酶的酶學特性研究為該酶的分離純化及應用具有一定的指導意義。

[1]李圭白，劉 超.地下水除鐵除錳[M].北京：中國建筑工業(yè)出版社，1989：40-44.

[2]張 杰，李 冬，陳立學，等.地下水除鐵除錳機理與技術(shù)的變革[J].自然科學進展，2005，15（4）：433-438.

[3]K?MPFER P.Physiological and chemotaxonomic characterization of filamentousbacteriabelongingtothegenusHaliscomenobacter[J].Syst Appl Microbiol,1995,18(3):363-367.

[4]全桂靜，吳財富.鞘細菌處理生活污水效果的研究[J].遼寧化工，2009，38（5）：311-314.

[5]凌薇薇，吳曉芙，陳永華，等.除錳微生物的篩選及其除錳特性研究[J].中南林業(yè)科技大學學報，2011，31（6）：152-156.

[6]馬偉樓，尹春華，鐘廣蓉.生物法除錳技術(shù)研究綜述[J].河北農(nóng)業(yè)科學，2010，14（2）：74-78.

[7]楊 宏，鐘 潔，紀 娟，等.Mn（II）氧化細菌的微生物學研究進展[J].應用于環(huán)境生物學報，2008，14（1）：143-146.

[8]劉顏軍，周靜曉，王革嬌.錳氧化菌Bacillussp.MK3-1的Mn（Ⅱ）氧化特性和除錳能力研究[J].微生物學通報，2009，36（4）：473-478.

[9]DUCKWORTH O W,SPOSITO G.Siderophore-manganese(III)in teractions II.manganite dissolution promoted by desferrioxamine B[J].Environ Sci Technol,2005,39(16):6045-6051.

[10]TEBO B M,JOHNSON H A,MCCARTHY J K,et al.Geomicrobi-ology of manganese(Ⅱ)oxidation[J].Trend Microbiol,2005,13(9):421-428.

[11]邱并生.錳氧化細菌[J].微生物學通報，2011，38（5）：786.

[12]RAJASABAPATHYR,MOHANDASSC,DASTAGERSG,etal.Citreicella manganoxidanssp.nov.,a novel manganese manganese oxidizing bacteriumisolatedfromashallowwaterhydrothermalventinEspalamaca(Azores)[J].Anton Van Leeuw,2015,108(6):1433-1439.

[13]晏 平，姜理英，陳建孟，等.錳氧化菌Aminobactersp.H1的分離鑒定及其錳氧化機制研究[J].環(huán)境科學，2014，35（4）：1428-1436.

[14]東秀株，蔡秒英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].第一版.北京：科學出版社，2001：349-398.

[15]R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1984：157-167.

[16]董安國，高 琳，趙建邦，等.基于DNA序列的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36（10）：221-226.

[17]陳正福，徐麗華，姜成林，等.構(gòu)建微生物分子分類系統(tǒng)進化樹的快速運算法與數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)[J].微生物學通報，1997，24（1）：22-26.

[18]BEOLCHINI F,PAGNANELLI F,TORO L,et al.Ionic strength effect on copper biosorption bySpharrotilus natans:equilibrium study and dynamic modeling in membrane reactor[J].Water Res,2006,40(1):144-152.

[19]佘晨興，許旭萍，李惠珍.鞘細菌生態(tài)學及其在環(huán)保上的應用[J].福建輕紡，2003，175（12）：6-7.

[20]American Public Health Association.Ameican Water Works Association.The Water Pollution Control Federation.水和廢水標準檢驗法[M].宋仁元，張亞杰，譯.北京：中國建筑工業(yè)出版社，1985：193-196.

[21]國家環(huán)境保護總局，水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，2002：368-370.

[22]翁酥穎，柯嘉康，戚蓓靜，等.球衣細菌（Sphaerotilus）的研究——球衣細菌的純種分離、鑒定和保存[J].上海師范大學學報：自然科學版，1980（3）：77-85.

[23]余 梅，阮小文，譚麗泉，等.白腐真菌產(chǎn)錳過氧化物酶的研究[J].化學與生物工程，2014，31（11）：40-45.

[24]BAR-LEV S S,KIRK T K.Effects of molecular oxygen on lignin degradation byP.chrysosportum[J].Biochem Bioph Res Commoun,1981,99:373-378.

Isolation and identification of manganese-oxidase-producing Sheath bacteria and the enzymatic characterization

DENG Jiacong,WANG Shiyao,JIANG Susu,ZHENG Hong*
(School of Ocean and Biochemical Engineering,Fuqing Branch of Fujian Normal University,Fuqing 350300,China)

A strain of Sheath bacterium which produces manganese oxidase,was isolated and screened from activated sludge and the enzymatic characteristics were studied.The manganese-oxidase-producing strains were isolated from soil by the enrichment culture medium,CGY plate and shake flask culture.One strain was identified according to morphological features,physiological and biochemical analysis as well as 16S rRNA gene sequence analysis.And the fermentation conditions for producing manganese-oxidase and enzymatic characteristics were studied.The results shown that a bacterium FM-3 with high activity of manganese-oxidase was isolated.The strain was identified asLeptothrixFM-3.The optimal fermentation conditions for manganese-oxidase production were glycerol 0.8%,peptone 0.15 g/L,Tween-80 0.2%,at 30℃150 r/min oscillation for 72 h.Under these conditions,the activity of manganese oxidase fermentation liquid up to 2 977.44 IU/ml.The optimum temperature and pH value of manganeseoxidase were 40℃and 7.0,respectively.Mg2+could activate the manganese-oxidase,but Ca2+,Cu2+had little impact.While Pb2+,Zn2+and Ag+had only modest inhibitory effect.

Leptothrix;manganese-oxidase;isolation and screening;identification;enzymatic characteristics

X172

0254-5071（2017）10-0097-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.021

2017-07-07

福建省自然科學基金項目（2015J01132）；福建省教育廳中青年教師項目（JA15569）

鄧加聰（1981-），男，副教授，博士研究生，研究方向為微生物菌株篩選及發(fā)酵。

*通訊作者：鄭 虹（1981-），女，高級實驗師，碩士，研究方向為微生物菌株篩選及發(fā)酵。